龍膽瀉肝湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎大鼠M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡的調(diào)控作用△

殷學(xué)偉 郭勵(lì)劼 周夢(mèng)賢 邱巖 畢宏生 郭大東

葡萄膜炎是一類臨床常見、不可逆、具有致盲性的復(fù)發(fā)性自身免疫性眼病，病因復(fù)雜，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前，葡萄膜炎多采用激素和免疫抑制劑藥物治療，副作用較大。因此，深入探討葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)對(duì)葡萄膜炎的臨床治療具有重要意義。龍膽瀉肝湯(Longdan Xiegan decoction,LXD)是由龍膽草、山梔子、澤瀉、黃芩、木通、車前子、生地黃、柴胡、當(dāng)歸和生甘草共十味中藥組成，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用[2]；臨床研究發(fā)現(xiàn)，LXD對(duì)前葡萄膜炎有較好的治療作用[3]。此外，LXD可通過多種途徑改善機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而有效減少實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠前房炎癥細(xì)胞浸潤，保護(hù)眼部組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)機(jī)體免疫功能恢復(fù)[4]，但是LXD對(duì)葡萄膜炎免疫平衡的調(diào)控機(jī)制仍不十分清楚。巨噬細(xì)胞是先天固有免疫的重要組成部分，在炎癥和宿主防御中發(fā)揮核心作用。在不同的病理生理?xiàng)l件下，巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為不同的功能表型，即經(jīng)典活化性巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages，M1)和選擇活化性巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages，M2)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，M1/M2巨噬細(xì)胞極化的不平衡通常與各種炎癥性疾病密切相關(guān)?？寡装Y的 M2 型巨噬細(xì)胞的減少和促炎癥的M1型巨噬細(xì)胞的增加與炎癥性疾病及自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。M1型巨噬細(xì)胞主要參與啟動(dòng)和維持炎癥反應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞主要參與炎癥消退[6]。失衡(增加)的M1/M2巨噬細(xì)胞比例是推動(dòng)自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理因素[7]?？紤]到M1/M2巨噬細(xì)胞平衡在炎癥性疾病中的重要作用，本研究擬通過檢測(cè)LXD干預(yù)12 d前后EAU大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞和iNOS、Arg-1的mRNA及蛋白表達(dá)的變化，分析LXD對(duì)EAU大鼠M1型、M2型巨噬細(xì)胞極化的影響，探討LXD對(duì)EAU大鼠M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡的調(diào)控作用，為EAU的臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(IRBP)(生工生物工程股份有限公司，上海)；結(jié)核分枝桿菌(TB)(Difco公司，美國)；完全弗氏佐劑(CFA)(Sigma公司，美國)；LXD配方顆粒(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司)；Genesis-D動(dòng)物眼部照相機(jī)(Kowa公司，日本)；RNA提取試劑盒(Aidlab公司，北京)；大鼠脾臟單核細(xì)胞分離液試劑盒(Solarbio公司，北京)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Q-PCR試劑盒(QIAGEN 公司，德國)；FITC-F4/80(博奧森生物技術(shù)有限公司，北京)；APC-CD11b(鈺博生物科技有限公司，上海)；PE-CD86(eBioscience公司，美國)；PE-CD206(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，上海)；固定破膜試劑盒(BD公司，美國)；大鼠ELISA(iNOS、Arg1) 試劑盒(Jianglaibio公司，上海) 。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理隨機(jī)將48只健康Lewis雌性大鼠(鼠齡6～8周，體質(zhì)量160～180 g，Charles Rive維通利華公司，北京)分為正常對(duì)照(NC)組、EAU模型組和LXD干預(yù)組，每組16只。EAU模型組和LXD干預(yù)組大鼠的足底、腹壁兩側(cè)和后背處分別注射200 μL含IRBP、CFA和TB的混合液以建立EAU大鼠模型，在NC組大鼠的相同部位分別注射相同含量的CFA及TB混合乳糜液(不含IRBP)。免疫后，LXD組大鼠每天按1000 mg·kg-1進(jìn)行LXD灌胃干預(yù)，EAU模型組和NC組大鼠給予相同體積的PBS緩沖液灌胃，每天1次，直至大鼠處死。

1.2 Q-PCR檢測(cè)各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中iNOS和Arg-1 mRNA表達(dá)免疫后12 d，收集各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織，進(jìn)行組織RNA的提取和RNA反轉(zhuǎn)錄，引物序列：GAPDH 上游引物為5’-CACGGCAAGTTCAACGGCACAGT-3’，GAPDH下游引物為5’-AGCGGAAGGGGCGGAGATGAT-3’，大小為222 bp；iNOS上游引物為5’-CTTCCGGGCAGCCTGTGAGACG-3’，iNOS下游引物為5’-ATCCCCAGGTGTTCCCCAGGTAGG-3’，大小為297 bp；Arg1上游引物為5’-CGGCTTGCGAGATGTGG-3’，Arg1下游引物為5’-TAGCCGGGGTGAATACTGG-3’，大小為200 bp。反應(yīng)體系為每孔20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，反應(yīng)循環(huán)1次；95 ℃ 20 s，57 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，循環(huán)45次。Q-PCR程序完成后，按 2-ΔΔCt計(jì)算iNOS和Arg1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 ELISA法檢測(cè)各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中iNOS和Arg1蛋白表達(dá)免疫后12 d，收集各組大鼠的脾臟、淋巴結(jié)以及眼組織，液氮研磨后加入RIPA裂解液350 μL溶解，勻漿30 s，移至超聲波組織細(xì)胞粉碎機(jī)中進(jìn)行冰上超聲20 min，然后置于4 ℃的離心機(jī)中8000 r·min-1離心10 min。BCA法檢測(cè)并計(jì)算各組樣品的蛋白濃度，采用商業(yè)用ELISA 試劑盒檢測(cè)各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織iNOS和Arg1的蛋白表達(dá)。

1.4 各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中M1/M2巨噬細(xì)胞極化水平檢測(cè)免疫后12 d，分別取三組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織，收集單核細(xì)胞，加入細(xì)胞刺激液6 μL和蛋白酶轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑4 μL輕輕混勻，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，避光孵育5 h，首先進(jìn)行細(xì)胞表面染色，然后將細(xì)胞固定破膜，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，最后加入350 μL PBS將細(xì)胞重懸，濾網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組樣本中M1型、M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平，分析LXD對(duì)EAU大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，組內(nèi)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較均采用單因素方差分析，組間采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中iNOS和Arg1的mRNA表達(dá)Q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，免疫后12 d，與NC組相比，EAU模型組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)水平均升高，Arg1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均降低(均為P<0.05)；與EAU模型組相比，LXD干預(yù)組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，Arg1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高(均為P<0.05)(見表1)。

表1 免疫后12 d各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中iNOS和Arg1 mRNA的表達(dá)

2.2 各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中iNOS和Arg1的蛋白表達(dá)ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EAU組和LXD組大鼠各組織中iNOS和Arg1蛋白相對(duì)表達(dá)水平變化趨勢(shì)與mRNA相對(duì)表達(dá)水平基本一致。免疫后12 d，與NC組相比，EAU模型組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高，Arg1蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯降低(均為P<0.05)；與EAU模型組相比，LXD干預(yù)組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中iNOS蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Arg1蛋白表達(dá)水平均明顯升高(均為P<0.05)(見表2)。

表2 免疫后12 d各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中iNOS和Arg1蛋白表達(dá)

2.3 LXD對(duì)EAU大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫后12 d,EAU模型組大鼠各組織中M1型巨噬細(xì)胞水平升高，而M2型巨噬細(xì)胞水平降低，M1/M2巨噬細(xì)胞極化比例均高于NC組，呈現(xiàn)不均衡狀態(tài)；LXD干預(yù)組大鼠各組織M1型巨噬細(xì)胞水平下降，M2型巨噬細(xì)胞水平升高，兩者比例逐漸恢復(fù)均衡(見圖1、圖2、表3)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中M1型巨噬細(xì)胞水平變化 A：圈門的P1為F4/80+CD11b+細(xì)胞；B：右上象限為F4/80+CD11b+CD86+ 巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中M2型巨噬細(xì)胞水平變化 A：圈門的P1為F4/80+CD11b+細(xì)胞；B：右上象限為F4/80+CD11b+CD206+巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)。

表3 各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中M1型、M2型巨噬細(xì)胞水平以及M1/M2巨噬細(xì)胞比例變化

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，葡萄膜炎屬“瞳神緊小”“瞳神干缺”等范疇，急性期以肝膽火熾型為主。LXD具有瀉肝經(jīng)實(shí)火、利肝膽濕熱之功效，對(duì)急性期葡萄膜炎有顯著療效。本課題組前期研究顯示，中西醫(yī)綜合治療葡萄膜炎效果優(yōu)于單純西藥治療[8-9]，提出“火熱為標(biāo)，肝膽為樞，五臟為本”的葡萄膜炎病機(jī)理論，其中“肝性失柔，火熱上炎”為其關(guān)鍵病機(jī)，以“清火柔肝明目，標(biāo)本經(jīng)樞兼調(diào)”治法取得較好的臨床療效[10]。因此，我們認(rèn)為中醫(yī)藥治療葡萄膜炎與調(diào)肝有關(guān)。肝主疏泄、主藏血，在維持機(jī)體正常功能和調(diào)節(jié)免疫平衡方面發(fā)揮重要作用，具有現(xiàn)代免疫學(xué)的基礎(chǔ)。LXD可通過清肝火、調(diào)肝經(jīng)促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)免疫平衡，達(dá)到治療葡萄膜炎的目的。 LXD對(duì)葡萄膜炎等免疫性眼病具有良好的治療作用。有研究顯示，龍膽瀉肝膠囊能顯著降低葡萄膜炎患者外周血中 IFN-γ、TNF-α、IL-23 的水平，改善機(jī)體的免疫狀態(tài)，表明LXD對(duì)葡萄膜炎有良好的治療作用[3]。本課題組前期臨床研究顯示，LXD對(duì)葡萄膜炎的治療在治愈率、隨訪 1年復(fù)發(fā)率、住院時(shí)間、不良反應(yīng)、患者耐受性及依從性、癥候積分改變率等多方面均優(yōu)于單純西藥組[10]；前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，LXD可有效減少 EAU 大鼠前房的炎癥細(xì)胞浸潤，保護(hù)眼部組織結(jié)構(gòu)，正向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[11]。因此，探討LXD治療葡萄膜炎的生物學(xué)本質(zhì)，具有臨床和實(shí)驗(yàn)研究的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

巨噬細(xì)胞是一種重要的抗原提呈細(xì)胞,巨噬細(xì)胞參與的免疫機(jī)制可能與M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡相關(guān)。在LPS、IFN-γ等炎癥因子刺激作用下,巨噬細(xì)胞可極化為M1型巨噬細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞在Th2型細(xì)胞因子作用下可極化為促進(jìn)損傷組織修復(fù)的M2型巨噬細(xì)胞[12-14]。巨噬細(xì)胞可通過在M1和M2功能表型中的改變作出環(huán)境信號(hào)反應(yīng)[15]。Arg1為M2 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，而iNOS為M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物[16]。Arg1與iNOS作為巨噬細(xì)胞極化過程中的一對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性酶，二者可通過調(diào)控它們的表達(dá)和活性的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，M1型巨噬細(xì)胞可釋放IL-6和IFN-γ等，進(jìn)而間接激活STAT3，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞iNOS等炎癥因子的表達(dá)，引起致炎因子的分泌增多，進(jìn)而發(fā)生膿毒性休克和組織壞死[17-18]。M1/M2巨噬細(xì)胞極化的不平衡可影響炎癥性疾病，包括自身免疫性疾病的發(fā)展進(jìn)程。M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)或分泌CD86、TNF-α以及iNOS等多種促炎因子，M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)或分泌抗炎因子，如Arg1及IL-10等[19]。在自身免疫性疾病中，STAT6可刺激巨噬細(xì)胞發(fā)生M2型極化，進(jìn)而調(diào)節(jié)Arg1抗炎因子的表達(dá)[20-21]。研究顯示，IL-33可使腸系膜中的M2型巨噬細(xì)胞比例增高，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，參與皮膚黏膜上皮組織損傷的修復(fù)以及重建黏膜免疫平衡過程[22]。Arg1可有效減少iNOS所生成的NO造成的機(jī)體損傷，對(duì)組織修復(fù)具有促進(jìn)作用[23]。研究顯示，M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物可參與抗炎、抗腫瘤以及抗氧化過程，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[24]。

Kung等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)小鼠動(dòng)物模型中，噻二唑-6,11-二酮可通過特異性抑制T細(xì)胞死亡相關(guān)基因8的功能和表達(dá)，調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡，減少關(guān)節(jié)炎癥的疼痛和破壞，進(jìn)而抑制RA的發(fā)生發(fā)展；花青素-3-O-β-葡萄糖苷(Cy-3-g)可通過過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)介導(dǎo)的NF-κB以及轉(zhuǎn)錄6信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡，降低促炎因子表達(dá)水平，提高抗炎因子表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗炎作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，免疫后12 d的EAU模型組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中iNOS mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Arg1的mRNA及蛋白表達(dá)水平降低(均為P<0.05)，M1/M2巨噬細(xì)胞極化比例均高于NC組，呈現(xiàn)不均衡表達(dá)；經(jīng)LXD治療后，LXD干預(yù)組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中iNOS 表達(dá)均顯著降低，而Arg1 表達(dá)均明顯升高(均為P<0.05)，M1型巨噬細(xì)胞極化水平下降，而M2型巨噬細(xì)胞極化水平升高，M1/M2巨噬細(xì)胞比例逐漸恢復(fù)均衡。提示LXD可通過調(diào)節(jié)M1型、M2型巨噬細(xì)胞的極化水平恢復(fù)EAU大鼠M1/M2巨噬細(xì)胞的極化平衡，從而發(fā)揮治療EAU的作用。

總之，EAU大鼠的脾臟、淋巴結(jié)以及眼組織中iNOS水平顯著升高，而Arg-1表達(dá)水平降低，M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡發(fā)生紊亂。LXD可明顯降低M1型巨噬細(xì)胞極化水平以及相關(guān)因子iNOS表達(dá)水平，提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞極化水平以及相關(guān)因子Arg-1表達(dá)水平，從而發(fā)揮對(duì)EAU大鼠M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡的調(diào)控作用，達(dá)到治療葡萄膜炎的效果。本研究為臨床應(yīng)用LXD治療EAU提供了新的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。