精子DNA碎片指數(shù)在男性生育力評估及其療效監(jiān)測中的應用*

伍細言，彭新華，胡子文，禹虹，范烺（湖南省婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，長沙410008）

男性不育指男女雙方未采取任何避孕措施，性生活正常，1年及以上女方未受孕。男性不育原因錯綜復雜，現(xiàn)有的男科實驗室無法檢測精子亞細胞形態(tài)的微小損傷，精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）能從精子DNA層面評價精子質量，被認為是一種評價精液質量和預測男性生育能力的有效指標［1］。精子DFI與精子產生過程中染色體異常組裝、精子的氧化應激損傷或凋亡等有關［2］。研究表明，男性精子DNA損傷的增加，不僅會導致男性不育，亦可能影響胚胎發(fā)育，導致反復流產或出生缺陷增加、子代染色體異常的風險增加，甚至還會影響體外受精（in vitro fertilization，IVF）的結局［3-4］。本研究回顧性分析精子DFI數(shù)據(jù)，探討精子DFI在評估男性生育力及監(jiān)測抗氧化藥物對高精子DFI男性不育患者療效中的應用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年2月至2019年7月于我院就診的2 122例男性患者。（1）正常生育組（62例）：夫妻雙方在我院行孕前檢查，雙方檢查結果正常，并排除其他全身性疾病，電話回訪女方在1年內懷孕并正常生育的男性。（2）女方復發(fā)性流產的不育組（61例）：夫妻雙方染色體正常，女方先兆流產及習慣性流產＞2次，于我院查因的男性；（3）不育行IVF組（1 999例）：因單純男性不育因素行IVF的男性，或因女性單純的輸卵管或盆腔因素且女性年齡＜40歲行IVF的男性。根據(jù)精子DFI檢測結果，不育行IVF組中430例高精子DFI（＞15%）男性進行了抗氧化治療。

1.2 主要儀器與試劑 FACS Calibur流式細胞儀（BD公司）；人類精子核完整性染色試劑盒（浙江星博生物科技公司）。

1.3 標本采集與DFI檢測 患者禁欲2～7 d后手淫法收集完整的精液于干燥取精杯內，于當天或凍存于-20℃冰箱解凍后在流式細胞儀上采用精子染色質結構分析法（sperm chromatin structure assay，SCSA）檢測精子DFI。SCSA被認為是檢測精子DNA損傷的金標準［5］。其原理是：受損的精子DNA在酸的作用下變性形成單鏈，而正常精子DNA維持雙鏈。吖啶橙（AO）與雙鏈DNA結合發(fā)出綠色熒光，而與單鏈DNA結合發(fā)出黃色或紅色熒光。精子經(jīng)AO染色后用流式細胞儀進行分析。具體操作為：取適量精液用樣本稀釋液（A液）稀釋至100μL，使精子終濃度為（1～2）×106/mL；加入200μL酸溶液（B液，置于冰上操作），準確計時30 s之后，加入600μL吖啶橙染色液（C液）染色5 min，用流式細胞儀分析。每份標本至少計數(shù)5 000個精子，流式細胞儀經(jīng)軟件分析后自動給出每份標本的精子DFI值。430例高精子DFI（＞15%）男性進行抗氧化藥物治療。治療方法：口服天然維生素E，每天3次，每次100 mg，規(guī)范治療3個月。

1.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行。先用Kolmogorov-Smirnova和Shapiro-Wilk法檢驗數(shù)據(jù)分布狀態(tài)，呈偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（IQR）］表示。采用Kruskal-Wallis H檢驗分析三組間精子DFI值的差異性，兩兩比較用Nemenyi檢驗?？寡趸幬镏委熜Ч^察用Fisher分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組精子DFI結果比較 正常生育組、女方復發(fā)性流產的不育組及不育行IVF組精子DFI結果差異有統(tǒng)計學意義（H=18.050，P＜0.01）；兩兩比較顯示，不育行IVF組男性精子DFI高于正常生育組（χ2=-4.017，P＜0.01）。見表1。

表1 正常生育組、女方復發(fā)性流產的不育組及不育行IVF組精子DFI結果比較

2.2 抗氧化藥物對精子DFI的治療效果 430例高精子DFI男性抗氧化藥物治療前后精子DFI值的變化見表2，高精子DFI男性進行抗氧化藥物治療后精子DFI下降。

表2 抗氧化藥物治療前后精子DFI值的比較

3 討論

精子DFI檢測作為精液常規(guī)檢查的重要補充，目前已在臨床實驗室常規(guī)開展。研究表明，精子DFI與精液常規(guī)參數(shù)存在一定的相關性［6］，精液常規(guī)只能初步反映精子質量，而精子DFI能夠從分子層面反映精子DNA的完整性。精子DFI增高，可反映男性生育力降低，同時增加女方復發(fā)性流產風險，影響IVF助孕結局［7-9］。而年齡、泌尿生殖道感染、生活方式、環(huán)境污染物等多種因素都可以引起男性精子DFI增高［10］。研究表明，正常生育組、復發(fā)性流產組及不育行IVF組間男性精子DFI存在差異，且不育行IVF組的精子DFI高于正常生育組，而復發(fā)性流產組的男性精子DFI介于正常生育組和不育行IVF組間，表明精子DFI增高與復發(fā)性流產和男性生育力降低密切相關。

引起復發(fā)性流產的因素復雜，有遺傳因素、子宮病變、內分泌失調、自身免疫病等，其中還有近50%原因不明。研究顯示，男性精子DFI增高可能是不明原因復發(fā)性流產的重要因素［7］。本研究亦顯示，復發(fā)性流產組的男性精子DFI高于正常生育組，但未達到顯著差異水平。這可能與本研究納入的復發(fā)性流產組未剔除女方因素有關。但此結果也提示，復發(fā)性流產夫婦在臨床診治中應重視男性因素，尤其是精子DNA完整性的影響。

本研究中的不育行IVF組以男性因素為主，其精子DFI高于正常生育組，再次佐證了精子DFI可以用于評估男性生育力，且高精子DFI患者應該進行相應的治療。

研究表明，氧化應激反應是導致精子質量下降及精子DNA損傷的重要因素。1979年，Jones等［11］首先提出，人類精子對氧化應激特別敏感，精子暴露于過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）分子環(huán)境中，可導致精子細胞膜結構受損，引起兩種嚴重的“連鎖反應”：一方面，促進精子細胞的凋亡過程，引起精子細胞核碎裂，核DNA碎片增多；另一方面，導致精子核DNA直接暴露于精漿中的ROS類物質中，精子DNA遭受ROS的正面攻擊而引起大范圍的DNA雙鏈的斷裂破壞，引起精子遺傳物質結構受損、功能缺陷而導致男性不育。

雖然有大量研究致力于改善精子DFI，但是目前尚無明確的治療指南。大量研究結果顯示［12-15］，應用抗氧化藥物對于體內過多氧自由基導致的氧化應激反應具有十分明顯的抑制效果，可以有效保護精子DNA及相關功能。但抗氧化治療是否顯著降低精子DFI，相關研究較少。在我們的臨床診療中，對高精子DFI患者多通過如下綜合措施進行治療，包括：（1）調整不健康的生活習慣：包括改變久坐、熬夜、缺少鍛煉、抽煙、喝酒等不良生活方式。（2）服用抗氧化藥物如維生素E、維生素C、葡萄糖酸鋅、輔酶Q10等。結果顯示，68.8%的病例經(jīng)綜合治療后精子DFI均有不同程度的下降，提示抗氧化治療能在一定程度上改善精子DFI。另有31.2%的男性精子DFI無改善，可能與患者依從性差或其他未知因素有關，未來我們需要進一步查找引起精子DFI增高的潛在因素。總之，精子DFI可在一定程度上反映男性生育能力，而對高精子DFI患者通過服用抗氧化藥物，加強宣教，改變不良習慣，可以有效降低男性精子DFI，并最終改善妊娠結局。