P53和多粘連細胞外基質蛋白LAMC2在食管鱗癌中的表達相關性研究*

魯陳陳，常 晨，劉東播，郝佳潔，王明榮

(1.蚌埠醫(yī)學院人體解剖學教研室，安徽 蚌埠 233030;2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學國家重點實驗室)

食管癌是世界十大惡性腫瘤之一，在中國最常見的腫瘤中排名第五位，致死率排名第四位[1]。食管鱗癌的高死亡率主要原因為發(fā)現(xiàn)較晚，手術治療5年生存率仍然不超過40 %[2]。因此，提高食管癌治療水平已經(jīng)成為醫(yī)學界的研究熱點。近來，大規(guī)?；蚪M研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌基因組存在多種突變，其中包括TP53、PIK3CA和ZNF750等[3-6]，且許多突變存在明顯的瘤內異質性[7]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)LAMC2蛋白在食管鱗癌中存在高表達和異質性[8]。LAMC2(Laminin 5γ2 chain,LN-5γ2)是一種多粘連細胞外基質蛋白，由一個重鏈α鏈(400 KD)和兩個輕鏈β、γ鏈(130～200 KD)組成的十字形異源三聚體。LAMC2在腫瘤細胞分化、遷移和增殖中起重要作用，而且有可能作為腫瘤潛在的標志物。在本研究中，我們進一步擴大樣本檢測LAMC2蛋白的表達，并且利用相同病例的連續(xù)切片檢測P53蛋白的表達，探討兩個分子之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料 2011至2012年間河南林州腫瘤醫(yī)院病理科收取的食管癌手術組織150例，均經(jīng)過病理學診斷為食管癌鱗狀細胞癌(簡稱食管鱗癌)。組織標本來源患者中女性38例，男性112例；年齡34～78歲，中位年齡61歲；腫瘤分期pT1、pT2、pT3期分別為5、23、122例；有、無淋巴結轉移分別為89、61例；腫瘤高、中、低分化病例數(shù)分別為20、82、48例。所有標本均為病理診斷后剩余的標本，本研究的設計和開展獲得了中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(16-084/1163)。

1.2方法

1.2.1組織微陣列制備 將收取的組織標本進行常規(guī)石蠟包埋、切片和HE染色，經(jīng)過顯微鏡閱片。每例針對包含上皮全層的手術切緣組織(正常食管組織)鏡下選取2個點，腫瘤組織取3個點。將相應組織點在蠟塊上標記，利用穿刺針將供體蠟塊轉移至受體蠟塊，制作成組織微陣列。每個組織微陣列包含20個病例，每個病例5個點分別為N-1、N-2、T-1、T-2、T-3，切片厚度為5 μm。

1.2.2免疫組織化學染色 兩張連續(xù)的組織微陣列切片同時經(jīng)68 ℃烤箱烤片120 min，烘烤完畢立即放入二甲苯脫蠟，然后經(jīng)100 %、85 %、75 %梯度乙醇各5 min水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5 min洗滌。經(jīng)3 %雙氧水封閉內源性過氧化物酶15 min，0.1 %枸櫞酸鈉緩沖液修復20 min。兩張組織微陣列切片分別滴加一抗Anti-LAMC2(美國 Chemicon公司)和Anti-TP53(北京中杉金橋生物技術有限公司)，4 ℃孵育過夜(>8 h)。次日經(jīng)磷酸鹽緩沖液PBS浸泡沖洗后，依次滴加PV9000免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)中的聚合物輔助劑和酶標山羊抗鼠/兔IgG 聚合物，在37 ℃溫箱分別孵育20 min和30 min。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色，蘇木素復染，梯度乙醇各5 min脫水，二甲苯浸泡透明，中性膠封片后鏡下檢查。

1.3免疫組織化學結果判斷 以細胞漿(LAMC2)或細胞核(P53)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性表達信號，對陽性細胞漿和細胞核染色強度和所占百分比進行評分。染色強度評價方法：無棕褐色為0分，淺棕褐色為1分，中度著色為2分，深棕褐色為3分。按陽性細胞漿和細胞核的細胞所占百分比評分：陽性細胞百分比≤10 %為1分，11 %～30 %為2分，31 %～50 %為3分，≥51 %為4分。根據(jù)染色強度和陽性細胞百分比評分之和進行總體評分。每例腫瘤3個位點分別進行評分，取3個腫瘤位點的平均分為終評分。根據(jù)最終評分，將0-1分定義為陰性，2-3分為陽性。

1.4統(tǒng)計學方法 使用SPSS Statistics 23.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，采用卡方檢驗判斷LAMC2和P53的蛋白表達改變與臨床病理參數(shù)(患者性別、年齡、腫瘤分期、分化程度、淋巴結轉移及腫瘤分期)的相關性、以及P53和多粘連細胞外基質蛋白LAMC2在食管鱗癌中的表達相關性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1LAMC2在食管鱗癌組織中的表達情況 免疫組織化學染色結果顯示，LAMC2蛋白在正常食管上皮組織中全為陰性，在食管鱗癌組織中的陽性率為43.3 %(65/150)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=82.979，P<0.001)，見表1。LAMC2蛋白在食管鱗癌中表達定位于細胞質和細胞膜，在腫瘤邊緣區(qū)域表達較強，而在腫瘤中部表達較弱或為陰性(圖1)。

圖1 食管鱗癌組織中LAMC2的表達情況

表1 食管鱗癌組織中LAMC2的表達情況[(n) %]

進一步分析與臨床病例參數(shù)的關系，結果表明LAMC2表達與患者性別、T分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移均相關，女性患者的LAMC2表達率高于男性患者(P<0.05),T3期患者LAMC2表達率高于T1-2(P<0.05),N1期患者LAMC2表達率高于N0期(P<0.05),G3期患者LAMC2表達率高于G1-2(P<0.05)，見表2。

表2 LAMC2蛋白表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系[(n) %]

2.2P53在食管鱗癌組織中的表達情況 免疫組織化學染色結果顯示，P53蛋白在食管鱗癌的手術切緣正常食管上皮組織中也全為陰性，在食管鱗癌組織中表達于細胞核，陽性率為59.3 %(89/150)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=126.54，P<0.001)，見表3，圖2。

圖2 食管鱗癌組織中P53的表達情況

表3 食管鱗癌組織中P53的表達情況[(n) %]

進一步分析與臨床病例參數(shù)的關系，結果表明P53表達與患者性別、腫瘤分化程度、淋巴結轉移均相關，女性患者的P53表達率低于男性患者(P<0.05)，N1期患者P53表達率低于N0期(P<0.05),G3期患者P53表達率高于G1-2(P<0.05)，見表4。

2.3LAMC2和P53在食管鱗癌組織中的表達具有相關性 綜合分析兩種蛋白在食管鱗癌中的表達情況，兩種蛋白雙陽性率為32.7 %(49/150)，均不表達者占30 %(45/150)。經(jīng)卡方檢驗差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=12.248，P<0.001)，見表5，圖3。

表4 P53蛋白與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系[(n) %]

圖3 食管鱗癌組織連續(xù)切片中LAMC2和P53表達正相關

上排為LAMC2蛋白下排為P53蛋白在腫瘤組織表達(SP×200)：(1)A1-2：LAMC2和P53均不表達；(2)B1-2：LAMC2和P53均中度表達；(3)C1-2：LAMC2 和P53均高表達。

表5 LAMC2和P53在食管鱗癌組織中的表達相關性

3 討論

本課題組在前期研究中，以河南地區(qū)的食管鱗癌組織標本，檢測LAMC2的表達，結果表明LAMC2在正常組織中不表達，在腫瘤組織中的陽性率為40 %，LAMC2的陽性表達與患者的腫瘤分化程度有關[8]。在此基礎上，進一步擴大病例，檢測安徽地區(qū)食管鱗癌組織中的LAMC2的表達，與前期結果類似，LAMC2在正常組織中不表達，在腫瘤組織中的陽性率為43.3 %。但在本次研究中，LAMC2的表達與患者的性別、T分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移均相關，這種地區(qū)的差異可能與河南地區(qū)和安徽地區(qū)的飲食結構有關，但是具體原因有待進一步研究明確。

此外，本研究特別使用連續(xù)切片同時檢測了P53的表達。TP53作為目前被發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因之一，當TP53發(fā)生突變時，不僅使其正常功能缺失，還會導致下游基因表達失調，進而引起腫瘤[9]。TP53突變在蛋白水平的最突出表現(xiàn)是其半衰期延長，即在正常細胞中P53蛋白的半衰期很短，常規(guī)的免疫組織化學染色檢測不到；而在許多腫瘤中，TP53發(fā)生突變后，正常的蛋白降解途徑發(fā)生變化，導致P53蛋白不能正常降解，故其半衰期延長而異常積累[10]。利用免疫組織化學技術檢測P53蛋白可觀察到明顯的腫瘤細胞核染色信號[11]。因此在本研究中，通過免疫組織化學染色技術去探索P53在食管鱗癌中的表達，結果發(fā)現(xiàn)P53在正常食管上皮組織中不表達，而在食管鱗癌腫瘤組織中有59.3 %的表達。

本研究中發(fā)現(xiàn)P53蛋白的表達和LAMC2表達正相關，P53蛋白在核內具有激活基因轉錄的作用[12]，推測食管鱗癌中P53可能通過某種方式促進LAMC2的表達。Amelio等在膽管癌中通過大規(guī)?；驕y序發(fā)現(xiàn)LAMC2表達與P53的表達存在正相關，并認為這一相關性可能是通過EGFR通路調控，TP53突變型R273H可能通過HIF1A通路調控LAMC2的表達[13]。此外，高表達的LAMC2通過EMT和EGFR通路促進腫瘤轉移[14]。本次研究也發(fā)現(xiàn)LAMC2高表達與淋巴結轉移有關。因此，這種P53蛋白的異常積累和LAMC2的高表達可能共同作用導致腫瘤轉移。但是TP53在食管鱗癌中通過何種機制影響LAMC2的表達，還有待在進一步的研究中深入探索。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌中P53和LAMC2存在較高頻率的表達增強，而在正常食管上皮組織中不表達。而且，兩者的表達存在正相關，可能綜合作為食管鱗癌的候選標志物。