沙門氏菌LAMP檢測方法的建立及其在蔬菜栽培土壤中的應(yīng)用

呂 新，劉蘭英，陳麗華，李玥仁

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2. 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，福建 福州 350003）

0 引 言

【研究意義】沙門氏菌是最主要的病原微生物之一，由其引起的食物中毒占食物中毒病例的第1或第2位[1]。僅在2005—2011年，國外發(fā)生的19起蔬菜因病原微生物污染而引起的食源性疾病案例中，有11起是由沙門氏菌污染引起的，占比高達58%[2]。沙門氏菌也是我國食源性疾病的主要病原體，我國發(fā)生的細菌性食源性中毒事件中有80%左右由沙門氏菌引起[3]。國內(nèi)已有多篇研究文獻發(fā)現(xiàn)胡蘿卜、香菜、香蔥、生菜等新鮮蔬菜中存在沙門氏菌污染風(fēng)險[4?6]。蔬菜的沙門氏菌污染可能發(fā)生在從農(nóng)田到餐桌的每個環(huán)節(jié)[7?8]，近年來，隨著對蔬菜供應(yīng)鏈主要環(huán)節(jié)中沙門氏菌污染風(fēng)險和來源的深入研究，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌污染風(fēng)險雖然貫穿供應(yīng)鏈的每個主要環(huán)節(jié)，但仍以栽培環(huán)節(jié)，特別是蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染風(fēng)險最大，也是沙門氏菌檢測和風(fēng)險控制的重點[8?11]?！厩叭搜芯窟M展】目前環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）已經(jīng)運用到多種食品中沙門氏菌的快速檢測中，因其具有快速、靈敏的優(yōu)點備受關(guān)注。Hara-Kudo等[12]采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，可以檢出沙門氏菌最低含量為2.2 CFU·管?1，并在1 h以內(nèi)獲得檢測結(jié)果；張宏偉等[13]采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測食品樣品中沙門氏菌最低檢出限為1.5 CFU·hg?1；王瑾等[14]采用實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，可檢測沙門氏菌最低含量為6 CFU·管?1，人工污染雞肉的檢出限為450 CFU·g?1，全程用時約7 h；Wu等[15]利用實時熒光定量環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)對生菜中沙門氏菌進行檢測，靈敏度達到了4 CFU.g?1，而檢測過程僅需3 h左右；龐心怡等[16]采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測肉類中沙門氏菌，對人工污染的沙門氏菌肉樣檢測靈敏度達98 CFU·mL?1，而全程僅用時15 h?！颈狙芯壳腥朦c】目前對沙門氏菌檢測多采用國標《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4 789.4—2016）方法，但該方法需要對待檢樣品進行預(yù)增菌、選擇性分離和生化試驗鑒定，操作繁瑣，耗時費力，僅篩選出沙門氏菌可疑菌落就需要3～4 d，后續(xù)的生化試驗還需2～3 d[17]，滿足不了沙門氏菌快速檢測的要求。而環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）最早在2000年由日本科學(xué)家Notomi[18]發(fā)明，該技術(shù)可在恒溫條件下（60～65 ℃）1h內(nèi)完成核酸的高倍擴增，靈敏度比PCR技術(shù)高2～7個數(shù)量級，反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過瓊脂糖電泳、濁度儀和定量PCR進行檢測，也可以通過鈣黃綠素、羥基萘酚藍、SYBR Green I顯色后觀察[19,20]，目前已成功應(yīng)用于沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血弧菌、志賀氏菌等多種病原微生物的檢測[14,21?23]，但國內(nèi)尚未見有關(guān)蔬菜栽培土壤中沙門氏菌LAMP檢測方法的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以沙門氏菌特有侵襲蛋白A （invA）基因序列設(shè)計可視化LAMP檢測引物，建立基于鈣黃綠素顯色的蔬菜栽培土壤中沙門氏菌可視化快速檢測方法，以期為蔬菜栽培土壤中沙門氏菌的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蔬菜栽培土壤 供試蔬菜栽培土壤樣品集自閩清縣東橋鎮(zhèn)綠輝蔬菜種植農(nóng)場，樣品按S型多點采集土壤表層（0～20 cm）的混合樣，采樣后立即用冰袋包裝新鮮樣品帶回實驗室，人工除去植物殘體、根系和石頭，過2 mm篩后測定土壤理化指標。供試蔬菜栽培土壤具體理化指標如下：土壤類型為黃紅壤，0～20 cm土層pH值5.31，有機質(zhì)含量16.61 g·kg?1，堿解氮含量126.54 mg·kg?1，速效磷含量 18.25 mg·kg?1，速效鉀含量113.79 mg·kg?1。

1.1.2 材料與試劑 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），DL2000 Marker、dNTP（Takara公司），Bst 2.0 DNA polymerase（美國NEB公司），瓊脂糖（西班牙Biowest），Betaine、Tween-20（上海生工），MnCl2、NaCl、Calcein（阿 拉 丁 公 司），F(xiàn)astDNA?Spin Kit for Soil試劑盒（美國MP Bio公司），無菌均質(zhì)袋（ 北京陸橋）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 PCR儀（BIO-RADTMS1000），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RADTMGel Doc XR+），F(xiàn)astPrepTMFP120核酸提取儀（美國MP Bio公司），easyMixTM拍擊式均質(zhì)器（法國AES Chemunex公司），電泳儀及電源（北京六一儀器廠），恒溫水浴鍋（上海一恒 ），恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）。

1.1.4 菌株 表1為供試7種微生物菌株，分別來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）和美國典型 培養(yǎng)物保存中心（ATCC）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)Genbank登錄的沙門氏菌特有侵襲蛋白A （invasion protein A，invA）基因序列（Accession: M90846.1），在網(wǎng)站（http://primerexplorer.jp/e/）上使用Primer Explorer 5.0在線軟件設(shè)計3對LAMP引物用于沙門氏菌檢測，包括1對外引物（F3/B3）、1對內(nèi)引物（FIP/BIP）和1對環(huán)引物（Loop F/Loop B）。檢測引物交由上海生工合成。具體檢測引物序列見表2。

表 1 供試菌株Table 1 Bacteria used for testing

表 2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物Table 2 Primers of LAMP

1.2.2 沙門氏菌培養(yǎng)、計數(shù)及基因組DNA提取 將TSA平板內(nèi)活化的沙門氏菌，挑取單個菌落接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min?1過夜培養(yǎng)15～18 h，以1∶100比例轉(zhuǎn)接于100 mL TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min?1培養(yǎng)3 h左右至細菌對數(shù)生長期（OD600≈0.55）。菌液使用生理鹽水按10倍梯度依次稀釋后，分別取100 μL不同濃度稀釋液涂于TSA平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h計數(shù)。

沙門氏菌DNA模板采用熱裂解法提取，取1 mL沙門氏菌菌液在臺式離心機上10 000 r·min?1離心5 min，棄上清液，沉淀重懸于0.5 mL生理鹽水，加入等體積2×TZ裂解液，于99.5 ℃加熱10 min，冰上冷卻2 min后，在10 000 r·min?1離心5 min，取上 清液即為沙門氏菌DNA模板，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化 分別對LAMP反應(yīng)體系中dNTPs濃度、MgSO4濃度以及Betaine濃度，反應(yīng)條件中反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間進行優(yōu)化，其中dNTPs終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mmol·L?1，MgSO4終濃度分別為2、4、6、8、10、12 mmol·L?1，Betaine終 濃 度 分 別 為0.6、0.8、1.2、1.4、1.6 mol·L?1；反 應(yīng) 溫 度 分 別 設(shè) 置58、59、60、61、62、63、64、65 ℃，反應(yīng)時間分別為30、40、50、60、70、80、90 min。選用50 μmol·L?1Calcein-500 μmol·L?1MnCl2作 為 指 示 劑[24]，陽 性 反 應(yīng) 顯 綠色，陰性反應(yīng)顯橘黃色，每個因子設(shè)置3個重復(fù)，以 確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.4 LAMP反應(yīng)特異性檢測 分別以鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希氏菌O157:H7、單核細胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌菌株為材料，以熱裂解法制備各菌株DNA，驗證所建立LAMP檢測方法的特異性。取1 μL各菌株的DNA作為模板，采取已優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件進行特異性分析，反應(yīng)結(jié)束后，以管內(nèi)顏色變化來判斷陰陽性，陽性為綠色，陰性為橘黃色；或?qū)U增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖電泳上檢測，陽性反應(yīng)可觀察到特征性梯形帶，陰性反應(yīng)則沒有出 現(xiàn)擴增條帶。

1.2.5 LAMP反應(yīng)靈敏度檢測 以10倍遞減將沙門氏 菌 濃 度 稀 釋 為7×108～7×102CFU·mL?17個 梯度，以熱裂解法提取沙門氏菌DNA，然后取1 μL不同含量的沙門氏菌DNA作為模板，對LAMP反應(yīng)靈敏度進行檢測。結(jié)果直接肉眼觀察，陽性反應(yīng)顯綠色，陰性反應(yīng)顯橘黃色，同時在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢 測。

1.2.6 人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品檢測 取10 g經(jīng)國標方法檢測沙門氏菌陰性的蔬菜栽培土壤樣品，置于裝有90 mL蛋白胨緩沖水（BPW）的無菌均質(zhì)袋中，分別加入滅菌生理鹽水稀釋至適宜含量的沙門氏菌0.5 mL，以制備含沙門氏菌含量為0、5×101、4×102、1×103、4×103、1×104、4×104、1×105CFU·g?1的人工污染樣品，將均質(zhì)袋放置在拍擊式均質(zhì)器中拍打1 min，置37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)增菌4 h。預(yù)增菌后重新混勻土壤樣品，吸取1 mL混勻土壤樣品至FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒中的土壤裂解管中，12 000 r·min?1離心3 min，吸棄上清，然后在FastPrepTMFP120核酸提取儀上提取土壤微生物總DNA，100 μL溶解土壤微生物總DNA，取1 μL作為LAMP反應(yīng)擴增模板。

1.2.7 蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染的檢測 利用所建立的蔬菜栽培土壤中沙門氏菌LAMP檢測方法對采自全省不同蔬菜產(chǎn)區(qū)的41份土壤樣品進行沙門氏菌檢測，同時采用國標方法（GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》）進行檢測分 析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測方法的建立

通過反應(yīng)溫度和時間進行優(yōu)化，確定LAMP最適反應(yīng)溫度為65 ℃，反應(yīng)時間為1 h。優(yōu)化后蔬菜栽培土壤中沙門氏菌LAMP檢測最佳反應(yīng)體系25 μL包括：2.5 μL 10×Isothermal Amplification Buffer，1.4 mmol·L?1dNTPs，0.2 μmol·L?1F3-B3，1.6 μmol·L?1FIPBIP，0.4 μmol·L?1Loop F～Loop B，0.8 mol·L?1Betaine，6.0 mmol·L?1MgSO4，8 U Bst 2.0 DNA polymerase，50 μmol·L?1Calcein和500 μmol·L?1MnCl2，DNA模板1 μl，滅菌超純水補足25 μL體積。優(yōu)化的LAMP反應(yīng) 效果如圖1所示。

圖 1 LAMP體系檢測沙門氏菌Fig. 1 Detection of Salmonella using optimized LAMP assay

2.2 特異性檢測結(jié)果

分別以鼠傷寒沙門氏菌菌株和非沙門氏菌菌株的DNA為模板進行LAMP反應(yīng)特異性分析，結(jié)果表明，在Calcein-MnCl2指示劑的作用下，65 ℃溫育1 h后，鼠傷寒沙門氏菌LAMP反應(yīng)產(chǎn)物顯綠色，而供試6個非沙門氏菌菌株的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物均顯橘黃色（圖2-A）。進一步取2 μL擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果除鼠傷寒沙門氏菌LAMP擴增產(chǎn)物出現(xiàn)梯形條帶外，其他6個菌株均未出現(xiàn)任何條帶（圖2-B）。結(jié)果表明，本研究所建立的可視化LAMP檢測方法對沙門氏菌具有良好的特 異性。

2.3 靈敏度檢測結(jié)果

分別以7個不同含量沙門氏菌DNA為模板進行擴增來驗證LAMP體系的靈敏度，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，在每管25 μL LAMP反應(yīng)體系中沙門氏菌DNA含量為7×105～7 CFU時均可以出現(xiàn)LAMP產(chǎn)物特有的梯形條帶（圖3-A），而當沙門氏菌DNA含量為7 ×10?1CFU時沒有出現(xiàn)任何條帶。可視化顯色結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致（圖3-B），說明L AMP反應(yīng)體系可以檢測到7 CFU沙門氏菌DNA。

圖 2 LAMP方法檢測沙門氏菌的特異性Fig. 2 Specificity of LAMP assay in detecting Salmonella

圖 3 LAMP方法檢測沙門氏菌的靈敏度Fig. 3 Sensitivity of LAMP assay in detecting Salmonella

2.4 人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品檢測結(jié)果

人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品經(jīng)37 ℃預(yù)增菌4 h后，提取土壤微生物總DNA進行擴增檢測。分別設(shè)置0、5×101、4×102、1×103、4×103、1×104、4×104、1×105CFU·g?1共7組 不 同 梯 度 進 行LAMP擴增檢測。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，當LAMP反應(yīng)體系中沙門氏菌含量為4×102～1×105CFU·g?1時均可以出現(xiàn)LAMP產(chǎn)物特有的梯形條帶（圖4-A），而當沙門氏菌含量為5×101CFU·g?1時沒有出現(xiàn)任何條帶?？梢暬@色結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致（圖4-B），說明本LAMP反應(yīng)體系檢測蔬菜栽培土壤 樣品靈敏度為4×102CFU·g?1。

2.5 蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染的檢測結(jié)果

應(yīng)用上述LAMP檢測方法和國標檢測法，同時對全省不同蔬菜產(chǎn)區(qū)的41份土壤樣品進行沙門氏菌檢測，結(jié)果見表3。2種方法都檢測到2份沙門氏菌陽性樣品和39份沙門氏菌陰性樣品，LAMP檢測方法與國標方法（GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》）檢測結(jié)果一致，而LAMP檢測將國標方法檢測時間由5～7 d縮短至8 h內(nèi)，大幅減輕 了檢測強度，提高了檢測效率。

圖 4 LAMP方法檢測人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品Fig. 4 LAMP assay for detecting artificially inoculated Salmonella in soil samples

表 3 2種方法對比檢測蔬菜栽培土壤沙門氏菌污染結(jié)果Table 3 Salmonella detection in soil by two different methods

3 討論與結(jié)論

快速檢測技術(shù)是監(jiān)測和防控沙門氏菌等食源性疾病最重要的環(huán)節(jié)之一，而衡量快速檢測技術(shù)性能最關(guān)鍵指標是檢測用時與靈敏度。目前采用的國標檢測方法《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016），需要對待檢樣品進行預(yù)增菌、選擇性分離和生化試驗鑒定等步驟，操作繁瑣；最終拿到鑒定結(jié)果需要5～7d，耗時費力，難以滿足沙門氏菌快速檢測的要求。PCR方法雖然具有檢測時間短、靈敏度高的特點，但需要專門的檢測儀器（普通PCR儀或熒光定量PCR儀)，而環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于具有更高的靈敏度和視覺判斷性的優(yōu)點，且檢測過程不需要專門的檢測儀器，彌補了國標檢測方法和PCR方法檢測沙門氏菌的不足。

沙門氏菌侵襲蛋白（invasion protein）基因簇是沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白的基因，與沙門氏菌對腸道上皮細胞的侵襲有關(guān)，包括invA、invB、invC、invD、invE等基因，其中以invA基因應(yīng)用最為廣泛，目前根據(jù)invA基因序列設(shè)計特異性引物已成功應(yīng)用于乳品、肉類、蔬菜等食品中沙門氏菌的檢測[14,15,21]。本研究根據(jù)沙門氏菌侵襲蛋白A （invA）基因序列設(shè)計特異性LAMP引物，建立了一種基于顏色判定的簡單、快速和靈敏的蔬菜栽培土壤中沙門氏菌的快速檢測方法，對沙門氏菌純菌檢測靈敏度可達7 CFU/25 μL，人工污染的栽培土 壤 樣 品 檢 測 靈 敏 度 為4×102CFU·g?1。采 用 該LAMP方法與國標檢測方法對比檢測蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染，結(jié)果表明LAMP檢測結(jié)果與國標方法檢測結(jié)果一致，說明該方法能成功應(yīng)用于蔬菜栽培土壤中沙門氏菌的快速檢測，可為蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染的及時防控提供技術(shù)支撐。