利用物種特異性PCR技術(shù)快速鑒定南瓜實(shí)蠅

黃 振，侯有明 ，郭瓊霞 ，陳韶萍,

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福州長樂機(jī)場海關(guān)，福建 福州 350209；3. 福州海關(guān)技術(shù)中心，福建 福州 350001）

0 引言

【研究意義】南瓜實(shí)蠅Bactrocera tau（Walker），屬雙翅目Diptera、實(shí)蠅科Tephritidae、果實(shí)蠅屬Bactrocera[1]，是我國進(jìn)境植物檢疫性害蟲。卵、幼蟲、蛹能隨寄主如果蔬、土壤、包裝物等可進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。南瓜實(shí)蠅食性雜、寄主廣，達(dá)16個科80余種[2]，主要危害南瓜、角瓜、絲瓜、黃瓜、葫蘆、苦瓜、桑椹、西瓜、菠蘿蜜、楊桃、芒果、番石榴、番茄、扁蒲、菜豆等瓜果植物，對葫蘆科植物危害尤為嚴(yán)重[3]。Walker1849年首次在中國報道[4]，目前主要報道分布在越南、緬甸、泰國、老撾、日本、柬埔寨、馬來西亞、菲律賓、新加坡、不丹、斯里蘭卡、印度、印度尼西亞等地[5?6]。國際果蔬貿(mào)易給南瓜實(shí)蠅的傳入傳播帶來了極大的潛在風(fēng)險[7]，日常分類鑒定工作通常以成蟲外部形態(tài)特征作為分類鑒定依據(jù)，而日常檢疫中經(jīng)常截獲幼蟲、卵或蛹，甚至翅、足等殘體，無法快速、準(zhǔn)確鑒定，通常是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲后進(jìn)行鑒定，耗時較長，嚴(yán)重影響果蔬進(jìn)出口貿(mào)易的通關(guān)速度。因此，建立快速、特異、有效的PCR技術(shù)，對快速鑒定南瓜實(shí)蠅具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】采用分子生物學(xué)的方法開展昆蟲種類鑒定，可以解決通過傳統(tǒng)形態(tài)特征不能進(jìn)行實(shí)蠅種類鑒定的問題。越來越多的分子鑒定技術(shù)被運(yùn)用于昆蟲的鑒定[8]。Mun等[9]應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Apa I、Nhe I和Sac I，將南瓜實(shí)蠅、桔小實(shí)蠅和地中海實(shí)蠅等4種實(shí)蠅區(qū)分開來。吳佳教等[10]用PCR-RFLP技術(shù)對我國口岸截獲頻率較高的9種檢疫性實(shí)蠅開展了研究，用限制性內(nèi)切酶MSE1和DRAI對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用得到的酶切位點(diǎn)將供試的9種實(shí)蠅區(qū)分開來。張亮等[11]通過 RAPD 技術(shù)構(gòu)建了南瓜實(shí)蠅、黑膝實(shí)蠅B. scutellaris等6種實(shí)蠅的指紋圖譜的分種鑒定。林麗莉等[12]應(yīng)用RFLP技術(shù)，對我國部分地區(qū)發(fā)生分布的蜜柑大實(shí)蠅B. tsuneonis（Miyake）和橘大實(shí)蠅B. minax（Enderlein）開展鑒別研究。Chua等[13]采用RFLP技術(shù)成功地區(qū)分了洋桃實(shí)蠅和木瓜實(shí)蠅，進(jìn)而使桔小實(shí)蠅復(fù)合種的有效識別得以實(shí)現(xiàn)。Kakouli等[14]用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù) AFLP進(jìn)行了實(shí)蠅種類的檢測鑒定。然而，上述對實(shí)蠅的檢測鑒定技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，如 RFLP和RAPD技術(shù)具有需求DNA的量較少、基因的多態(tài)性豐富、對基因組的覆蓋范圍比較廣等優(yōu)點(diǎn)；但RFLP技術(shù)由于操作繁瑣，需通過檢測內(nèi)切酶識別位點(diǎn)上的變異，來進(jìn)行昆蟲種間親緣關(guān)系和昆蟲種屬特異性鑒定，多態(tài)性檢出率低，而RAPD 技術(shù)的穩(wěn)定性較差，對試驗(yàn)環(huán)境因子變化較為敏感，擴(kuò)增的產(chǎn)物可重復(fù)性、穩(wěn)定性較低等，限制了RFLP和RAPD技術(shù)的廣泛應(yīng)用[15]。雖然AFLP技術(shù)可以較好地彌補(bǔ)上述兩種技術(shù)方法的不足，但AFLP技術(shù)對檢測樣本DNA的質(zhì)量要求較高，且所需設(shè)備的費(fèi)用較為昂貴。因此，上述的檢測方法難以滿足口岸進(jìn)出境果蔬貿(mào)易快速通關(guān)、準(zhǔn)確鑒定及低成本的檢疫需求。因?yàn)閙tDNA COⅠ基因相對保守，排列的順序比較穩(wěn)定緊密，容易被通用引物擴(kuò)增，又有足夠的特異性能將不同物種區(qū)分開，所以mtDNA COⅠ基因作為標(biāo)記基因，為生物分類學(xué)提供了信息化的分類標(biāo)準(zhǔn)和有效的分類手段，成為目前昆蟲分類鑒定及昆蟲分子進(jìn)化系統(tǒng)研究應(yīng)用較多的基因之一，并被應(yīng)用于實(shí)蠅近緣種的系統(tǒng)發(fā)育研究[16?18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于RAPD、AFLP、RFLP等技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)的不足[19]，本試驗(yàn)在前人利用COI標(biāo)記鑒定技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用mt DNA COI基因序列，篩選并設(shè)計種特異引物[20]，采用SS-PCR方法快速鑒定南瓜實(shí)蠅?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用種特異性引物快速鑒定南瓜實(shí)蠅的方法，實(shí)現(xiàn)對口岸進(jìn)境水果攜帶并截獲的疑似南瓜實(shí)蠅的卵、幼蟲、蛹、成蟲及成蟲殘體的快速鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試蟲樣：南瓜實(shí)蠅B. tau（Walker）、洋桃實(shí)蠅B. carambolae Drew & Hancock、瓜實(shí)蠅B. cucurbitae（Coquillett）、辣 椒 實(shí) 蠅B. latifrons（Hendel）、腿端黑實(shí)蠅B. atrifemur Drew & Hancock、番石榴果實(shí)蠅 B. correcta（Bezzi）、二 顏 帶 實(shí) 蠅 B. cilifera（Hendel）、桔小實(shí)蠅B. dorsalis（Hendel）、銹紅果實(shí)蠅B. rubigina（Wang & Zhao）、瘤脛實(shí)蠅B. tuberculata（Bezzi）、具條實(shí)蠅B. scutellata（Hendel）、何氏華實(shí)蠅B. hochii（Zia）、近黑顏實(shí)蠅B. parater（Zhao &Lin）、黑顏實(shí)蠅B. diaphora Coquillett、黑膝實(shí)蠅B.scutellaris（Bezzi）、滇寡鬃實(shí)蠅B. modica（Hardy）、瑞麗果實(shí)蠅B. ruiliensis Wang, Long et Zhang, sp. nov.、五指山實(shí)蠅B. wuzhishana Lin et Yang, sp. nov.、棗實(shí)蠅Carpomya vesuviana Costa、瓜棍腹實(shí)蠅Dacus longicornis Wiedemann等20種實(shí)蠅，其中除Bactrocera屬18種外，另有 Carpomya、Dacus2個屬的種類各1種。蟲樣來自口岸進(jìn)境果蔬檢疫截獲、中國邊境監(jiān)測、調(diào)查和誘捕的檢疫性實(shí)蠅種類。用于分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn)的實(shí)蠅標(biāo)本，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取和質(zhì)量檢測

將20種實(shí)蠅蟲樣放置于2 mL的離心管中，加入適量液氮充分研磨，根據(jù)用OMEGA E.Z.N.A.TMInsect DNA Kit試劑盒的操作方法，對蟲樣進(jìn)行基因組DNA的提取，并放置于?20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA質(zhì)量檢測采用上游引物L(fēng)CO1490（堿基序列為：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′）和下游引物HCO2198（堿基序列為：5′-TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA-3′）的1對通用引物對20種實(shí)蠅蟲樣提取的基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，在定量梯度PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳，凝膠成像，拍攝記錄質(zhì)量檢測結(jié)果。

1.3 引物設(shè)計

通過數(shù)據(jù)庫（NCBI）查找已公布的南瓜實(shí)蠅的登錄序列，分析比較并選定登錄號為JN542420的線粒體mt DNA COⅠ基因序列，利用數(shù)據(jù)庫（NCBI）中提供的BLAST程序檢查同源序列，最終選定8種實(shí)蠅（表1）。

表 1 設(shè)計南瓜實(shí)蠅特異性引物所用實(shí)蠅種類及登錄號Table 1 Species and accession numbers of fruit flies used for designing B. tau-specific primers

應(yīng)用數(shù)據(jù)庫下載FASTA格式，對表1中的8種實(shí)蠅序列進(jìn)行序列比對，再根據(jù)SNP位點(diǎn)，利用Primer-Premier 5.0軟件進(jìn)行人工設(shè)計引物，采用Oligo 6.44對設(shè)置的引物進(jìn)行評定，最后應(yīng)用數(shù)據(jù)庫（NCBI）中 的Primer-BLAST（BLAST：Basic Local Alignment Search Tool）DNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比較分 析，檢查同源序列。

1.4 引物種特異性測試

測試南瓜實(shí)蠅引物的種特異性時，選取南瓜實(shí)蠅為陽性對照，其余的20種實(shí)蠅蟲樣為陰性對照，檢測驗(yàn)證設(shè)計引物種特異性測試的反應(yīng)體系和條件，電泳檢測，凝膠成像，查看有否擴(kuò)增出預(yù)期大小 的目標(biāo)片段，拍攝并記錄結(jié)果。

1.5 引物靈敏度測試

將提取南瓜實(shí)蠅的基因組DNA模板，按照10?1、10?2、10?3倍3種不同濃度稀釋，測試提取的南瓜實(shí)蠅DNA的稀釋濃度后的靈敏度。用設(shè)計的種特異性引物NF404和NR610進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對DNA模板進(jìn)行最低檢出閾值的測定，驗(yàn)證本檢測方法的靈 敏度。

1.6 SS-PCR方法的應(yīng)用與驗(yàn)證

將福州長樂機(jī)場進(jìn)境旅客攜帶果蔬中截獲的南瓜實(shí)蠅并飼養(yǎng)到成蟲，經(jīng)過專家鑒定復(fù)核，收集幼蟲、蛹、成蟲、足、翅等17個蟲樣，按照本研究的SS-PCR方法，將提取的基因組DNA為模板，應(yīng)用種特異性引物NF404和NR610進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來驗(yàn)證 該方法的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 質(zhì)量檢測結(jié)果

采用1對LCO1490和HCO2198通用引物，對提取的20種實(shí)蠅蟲樣的基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示所有的實(shí)蠅蟲樣的DNA均能擴(kuò)增出一條單一整齊且清晰透明的，長度約700 bp的目標(biāo)條帶（圖1）。

圖 1 利用LCO1490和HC02198 一對通用型引物對提取的實(shí)蠅DNA模板進(jìn)行質(zhì)量檢測的結(jié)果Fig. 1 Utilization of universal primers, LCO1490 and HC02198,for testing extracted DNA templates from fruit flies

2.2 特異性引物選擇

應(yīng)用Bioedit對已下載的JN542420.1、HM561566.1、JN542417.1、AY530891.1、AF423105.1、JX855917.1、KF998674.1、KF318598.1等8種序列進(jìn)行ClustalW多重比對，通過篩選最終選擇的種特異性引物NF′404和NR′610（圖2）。

圖 2 8種果實(shí)蠅的ClustalW多重比對的部分結(jié)果（種特異性引物NF’404和NR’610序列位置用橫線劃出）Fig. 2 Partial result of ClustalW multiple comparisons on 8 fruit flies

NF′404：5′-TGCCTCGACGATATTCTGACT-3′；

NR′610：5′-AACTGTGTTCAGCAGGTGGT-3′。

將NF′404和NR′610利用NCBI數(shù)據(jù)庫提供的Primer-BLAST程序檢查同源序列，最終將正向引物NF′404第6個堿基C轉(zhuǎn)換成T，第7個堿基G轉(zhuǎn)換成A，第8、19個堿基A轉(zhuǎn)換成G，確定出引物NF404和NR610。

篩選出NF404和NR610種特異性引物，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。特異性引物NF404和NR610的序列分別為：

NF404：5′-TGCCTTAGCGATATTCTGGCT-3′；

NR610：5′-AACTGTGTTCAGCAGGTGGT-3′。

2.3 引物種特異性

選用篩選獲得的種特異性引物NF404和NR610進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明：僅南瓜實(shí)蠅擴(kuò)增出一條清晰透明且單一的約207 bp的條帶，其他20種實(shí)蠅種類樣本均未顯現(xiàn)目標(biāo)條帶（圖3）。表明該試驗(yàn)設(shè)計的NF404和NR610種特異性引物具有較強(qiáng)的特異性和穩(wěn)定性。

上海英濰捷基貿(mào)易有限公司對本試驗(yàn)將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性分析（BLAST），表明該段序列與數(shù)據(jù)庫中 的南瓜實(shí)蠅序列完全一致。

2.4 引物的靈敏度

應(yīng)用核酸蛋白分析儀對提取的南瓜實(shí)蠅DNA模板的質(zhì)量濃度進(jìn)行測試，質(zhì)量濃度為56.95 ng·μL?1。取3種不同濃度的DNA模版測定最低檢出閾值，結(jié)果表明：隨著模版質(zhì)量濃度的降低，擴(kuò)增出的條帶逐漸變淡，在質(zhì)量濃度稀釋100倍后，仍可見較為明 顯條帶（圖4），說明本試驗(yàn)方法靈敏度較高。

2.5 應(yīng)用與驗(yàn)證

采用SS-PCR快速鑒定技術(shù)對截獲的南瓜實(shí)蠅標(biāo)

圖 3 引物NF404和NR610的種特異性驗(yàn)證Fig. 3 Verification on species-specificity of primers, NF404 and NR610

圖 4 引物NF404和NR610的靈敏度驗(yàn)證Fig. 4 Verification on sensitivity of primers, NF404 and NR610

本進(jìn)行檢測驗(yàn)證，取經(jīng)復(fù)核鑒定的幼蟲、蛹、成蟲及成蟲的足、翅或部分殘體等17個樣品經(jīng)過檢驗(yàn)，均檢測有目標(biāo)條帶（圖5），說明分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，即基于mt DNA COⅠ基因建立的種特異性COⅠ引物具有很強(qiáng)的特異性，SS-PCR快速鑒定南瓜實(shí)蠅的方法可以應(yīng)用于實(shí)際鑒定。

圖 5 SS-PCR快速鑒定南瓜實(shí)蠅的應(yīng)用與驗(yàn)證Fig. 5 Application and verification of SS-PCR for rapid identification of B. tau

3 討論

3.1 引物的特異性是快速準(zhǔn)確鑒定的決定性因素

被選作分子標(biāo)記的基因很多，但是COI（cytochrome oxidase I或coxI）基因被選為DNA條形碼的靶標(biāo)基因，相對保守，種間變異大，容易被通用引物擴(kuò)增，同時又有足夠的變異能夠?qū)⒔壏N、近似種等分開。本試驗(yàn)選用mt DNA COI作為標(biāo)記基因，在基因庫中篩選查找南瓜實(shí)蠅已公布序列進(jìn)行比對分析，設(shè)計引物NF404和NR610，用南瓜實(shí)蠅作為陽性對照，用其形態(tài)相近的3個果實(shí)蠅屬4個亞屬19種實(shí)蠅作為陰性對照，目標(biāo)種能特異性并穩(wěn)定地擴(kuò)增出長度207 bp清晰且單一的目標(biāo)條帶，其他實(shí)蠅種類均無條帶出現(xiàn)，表明設(shè)計引物的種特異性強(qiáng)，能夠鑒定南瓜實(shí)蠅。

3.2 SS-PCR檢測鑒定方法的實(shí)用性

采用SS-PCR檢測鑒定方法，不但可快速準(zhǔn)確鑒定特異種類南瓜實(shí)蠅，而且可檢測到的DNA模板質(zhì)量濃度的最低檢出閾值為5.695×10?3ng·μL?1。在口岸進(jìn)境的多批果蔬的檢疫檢測時，對發(fā)現(xiàn)的不同蟲態(tài)目標(biāo)實(shí)蠅（飼養(yǎng)到成蟲及經(jīng)過專家形態(tài)鑒定復(fù)核），采用SS-PCR檢測鑒定方法，可在8 h之內(nèi)快速準(zhǔn)確鑒定特異種類南瓜實(shí)蠅。同時，本試驗(yàn)建立種特異性引物PCR方法檢測南瓜實(shí)蠅的不同蟲態(tài)用時短、DNA用量少、靈敏度高、儀器設(shè)備簡單、鑒定準(zhǔn)確率高，能夠滿足口岸檢驗(yàn)檢疫高通量快速通關(guān)和快速準(zhǔn)確的要求，而且本研究建立的方法對南瓜實(shí)蠅的卵或蟲體部分殘體均可檢測，不受實(shí)驗(yàn)材料存活狀態(tài)的影響，檢測靈敏度高。因此，種特異引物 PCR方法在昆蟲的快速鑒定和近緣種區(qū)分上有著 廣泛的應(yīng)用前景。

3.3 對線粒體基因組的研究有待于進(jìn)一步加強(qiáng)

目前，線粒體基因組在實(shí)蠅科害蟲中的應(yīng)用較少，僅有3屬 14種，在已公開發(fā)表的大多文獻(xiàn)中只描述了新測定物種的線粒體基因組序列及其特點(diǎn)。對于利用線粒體基因組在實(shí)蠅科害蟲中進(jìn)行物種鑒定、種群溯源、分子進(jìn)化等方面的研究尚未見報道。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，獲得具有重要經(jīng)濟(jì)意義的實(shí)蠅種類的線粒體基因組序列研究顯得極為迫切，所以對實(shí)蠅科昆蟲線粒體基因組的研究和應(yīng)用需要進(jìn)一步加強(qiáng)。