水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水脫氮除磷微藻的篩選

賈 緯，聶毅磊，陳 宏，羅立津，樂占線，莊 鴻，鄭軍榮

（福建省微生物研究所，福建 福州 350007）

0 引言

【研究意義】養(yǎng)殖廢水富含氮、磷和有機物等，未經(jīng)有效處理排放到周邊水域，易破壞周邊水域水環(huán)境的生態(tài)平衡，導致水體富營養(yǎng)化。養(yǎng)殖廢水中的有機污染物主要包括碳水化合物、蛋白質和脂肪等，可生化性較好，能夠適用于生物處理技術，而氮、磷等營養(yǎng)鹽的溶出和積累構成了養(yǎng)殖廢水中的無機污染物[1]。對于溶解性營養(yǎng)鹽，目前多采用沉淀、過濾等物理或化學處理方法，但效果均不甚理想，而且成本高，易導致二次污染，而生物處理方法相對經(jīng)濟有效[2?3]。微藻是一類單細胞或簡單多細胞的、以氮磷為主要營養(yǎng)源的光合自養(yǎng)型微生物，具有光能利用效率高、繁殖速度快、環(huán)境適應能力強和生長周期短等特性。微藻具有去除污水中有機污染物和氮、磷等無機污染物的功能[4?5]。與其他污水處理技術相比，微藻凈化污水的主要優(yōu)勢：快速地去除使用傳統(tǒng)處理工藝難以有效去除的氮、磷等污染物；在凈化污水的同時可固定CO2，達到減排的效果[6]；收獲的微藻可作為水產(chǎn)餌料和飼料添加劑，亦可作為原料應用于藥品、食品和生物質燃料等高附加值產(chǎn)品的開發(fā)[7?9]?！厩叭搜芯窟M展】近年來，我國的海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展必然帶來海水養(yǎng)殖廢水的排放問題。由于海水養(yǎng)殖廢水污染物組成復雜和鹽度效應，增加了處理難度。目前有關微藻凈化處理海水養(yǎng)殖廢水的研究報道不多，尚沒有成熟的處理技術能高效地去除海水養(yǎng)殖廢水中的氮磷營養(yǎng)鹽。丁一等[10]研究了固定化小球藻對海水養(yǎng)殖廢水的處理效果，連續(xù)流運行15 d，固定化小球藻對海水養(yǎng)殖廢水氨氮、磷酸鹽的平均去除率分別為84.49%和72.17%；馬航等[11]以青島大扁藻為生物源的膜反應器，運行60 d，對海水養(yǎng)殖廢水中TN和TP的去除率可達73.6%和77.9%；EIKassas[12]的研究表明，螺旋藻可以降低養(yǎng)殖系統(tǒng)中氨氮和硝酸鹽氮的含量。馬瑞陽等[13]研究了普通小球藻和芽孢桿菌共固定系統(tǒng)對海水養(yǎng)殖尾水的凈化效果，結果表明其對NH4+-N、PO43－-P、Tp和COD的去除率分別為96.57%、98.62%、89.89%和39.09%.【本研究切入點】福建是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大省，以海水養(yǎng)殖為主[14]，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模發(fā)展必然給廢水處理帶來挑戰(zhàn)。本研究旨在篩選適宜福建海水養(yǎng)殖廢水凈化處理的藻種，為實際應用奠定基礎。【擬解決的關鍵問題】本研究以前期篩選的小球藻JY-1、SY-4以及鏈帶藻SH-1等3株微藻為對象，考察其在不同鹽度f/2培養(yǎng)基和海水養(yǎng)殖廢水中的生長狀況，評價其鹽度耐受性，同時研究3株微藻對海水養(yǎng)殖廢水的脫氮除磷效果，以期篩選適合福建海水養(yǎng)殖廢水凈化處理的藻種，為福建養(yǎng)殖廢水治理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BG11固體培養(yǎng)基：NaNO31.5 g，K2HPO40.04 g，MgSO4·7H2O 0.075 g，CaCl2·2H2O 0.036 g，Na2CO30.02 g，檸檬酸0.006 g，Na2EDTA 0.001 g，微量元素溶液1 mL，蒸餾水1 000 mL，瓊脂15 g；其中微量元素溶液含檸檬酸鐵0.006 g·L?1、H3BO32.86 g·L?1、MnCl2·4H2O 1.81 g·L?1、ZnSO4·7H2O 0.22 g·L?1、Na2MoO4·2H2O 0.39 g·L?1、CuSO4·5H2O 0.08 g·L?1、CoCl2·6H2O 0.04 g·L?1，用NaOH或HCl調 節(jié)pH至7.1，121 ℃高壓滅菌20 min。

f/2培養(yǎng)基：NaNO30.075 g，NaH2PO4·H2O 0.005 g，微量元素溶液1 mL，維生素溶液1 mL，蒸餾水1 000 mL，用NaOH或HCl調節(jié)pH到7.8，121 ℃高壓滅菌20 min，維生素溶液用孔徑0.22 μm的濾膜過濾除菌。其 中 微 量 元 素 溶 液 含CuSO4·5H2O 0.01 g·L?1、ZnSO4·7H2O 0.022 g·L?1、CoCl2·6H2O 0.01 g·L?1、MnCl2·4H2O 0.18 g·L?1、Na2MoO4·2H2O 0.006 g·L?1、Na2EDTA 4.36 g·L?1、FeCl3·6H2O 3.15 g·L?1，維生素溶液含維生素B1 100 mg·L?1、維生素B7 0.5 mg·L?1、維生素B12 0.5 mg·L?1。

養(yǎng)殖廢水采集自福建長樂某南美白對蝦養(yǎng)殖廢水，初始指標為：鹽度（7±1）‰，總氮（10.78±0.09）mg·L?1，氨態(tài)氮(2.75±0.02）mg·L?1，硝態(tài)氮（3.96±0.04） mg·L?1，亞硝態(tài)氮（0.10±0.005）mg·L?1，總磷 （0.85±0.03） mg·L?1。

1.2 藻種來源及培養(yǎng)條件

供試藻種為小球藻JY-1（Chlorella sp.JY-1）、小球藻SY-4（Chlorella sp.SY-4）以及鏈帶藻SH-1（Desmodesmus sp. SH-1），均分離自長樂水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水。無菌條件下用接種環(huán)從BG11固體培養(yǎng)基斜面上挑取供試藻種接種于500 mL錐形瓶中，調整藻細胞含量至約105個·mL?1，培養(yǎng)基裝量250 mL，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。培養(yǎng)條件：溫度25±1 ℃，光照強度4 000～5 000 lx，光照周期12∶12（L∶D），轉 速150 r·min?1。

1.3 指標測定

采用顯微計數(shù)法測定藻細胞含量。水質分析參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》[15]，總氮采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法（HJ636—2012），氨態(tài)氮采用納氏試劑分光光度法（HJ535—2009），硝態(tài)氮采用紫外分光光度法（HJ/T346—2007），亞硝態(tài)氮采用紫外分光光度法（GB7493—87），總磷采用鉬酸銨分光光度法（GB11893—89）。所用儀器為752型紫 外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 微藻對不同鹽度海水的耐受性分析 對福建長樂地區(qū)不同南美白對蝦養(yǎng)殖池實地采樣分析表明，養(yǎng)殖池水體鹽度為5‰～17‰。據(jù)此配制f/2培養(yǎng)基，加入海鹽使得鹽度分別為5‰、10‰、20‰、30‰，考察3株微藻在其中的生長狀況，篩選耐鹽性高的微藻藻株。

無菌條件下用接種環(huán)從保藏斜面上挑取供試藻種，接種于不同鹽濃度的f/2培養(yǎng)基中，調整藻細胞含量至約105個·mL?1。培養(yǎng)一周，用血球計數(shù)板在顯微鏡下觀察，并計算出藻細胞數(shù)量。比較不同藻種 在各組培養(yǎng)基中的生長濃度。

1.4.2 微藻對養(yǎng)殖廢水中氮磷去除效果的測定 取適量在f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周的微藻藻液，經(jīng)3 000 r·min?1離心5 min，棄上清液，取藻細胞接種于裝有250 mL養(yǎng)殖廢水的500 mL錐形瓶中，調整藻細胞濃度至約105個·mL?1，同時以未添加藻細胞的養(yǎng)殖廢水為空白對照，設立3個平行對照組，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度25±1 ℃，光照強度4 000-5 000 lx，光照周期12∶12（L∶D），轉速150 r·min?1。分別于不同時間點取樣，將水體用3 000 r·min?1離心5 min，取上 層水體測定氨氮、硝氮、亞硝氮和總磷等的含量。

1.4.3 氨氮去除率的計算方法 總氮、氨氮、硝氮、亞硝氮及總磷的去除率按以下公式計算

其中：P為去除率（%），C0和Cn分別為接種微藻前后養(yǎng)殖廢水中總氮、氨氮、硝氮、亞硝氮和總 磷的質量濃度（mg·L?1）。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理與分析 利用Microsoft Office Excel 2 019和SPSS19.0等軟件對數(shù)據(jù)進行分析和圖標制作。

2 結果與分析

2.1 微藻的鹽度耐受性

3株供試藻種在不同鹽度的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周，對培養(yǎng)基中的藻細胞進行顯微計數(shù)（圖1），對不同藻種在不同鹽度下的藻濃度顯著性分析表明差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。3株藻均可以在鹽度為5‰、10‰、20‰和30‰的f/2培養(yǎng)基中生長，其中小球藻JY-1、SY-4的細胞含量高于鏈帶藻SH-1的 細胞含量。

2.2 微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的生長狀況

對3株微藻在南美白對蝦養(yǎng)殖廢水中的生長濃度進行比較研究。經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，JY-1、SY-4和SH-1的細胞含量分別為1.56×107、1.47×107、6.62×106個·mL?1（圖2）。表明3株微藻均能在鹽含量為7‰±1‰的養(yǎng)殖廢水中生長，其中小球藻JY-1的生長 能力相對較強。

2.3 微藻對養(yǎng)殖廢水的脫氮除磷效果

由表1～表5可見，處理5 d，小球藻JY-1、SY-4和鏈帶藻SH-1對南美白對蝦養(yǎng)殖廢水中總氮的去

圖 1 3種微藻在不同鹽度培養(yǎng)基中生長的最終細胞含量Fig. 1 Final cell densities of microalgae in media of varied salinities

圖 2 3株微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的細胞含量曲線圖Fig. 2 Growth of microalgae in aquaculture wastewater

除率分別為50.36%、41.51%和49.74%；氨態(tài)氮的去除率分別為96.29%、84.92%和96.65%；硝態(tài)氮的去除率分別為15.84%、3.69%和12.56%；總磷的去除率分別為93.51%、82.4%和94.1%；亞硝態(tài)氮的濃度有一定升高，推測可能是其他形態(tài)的氮轉化成亞硝態(tài)氮導致其含量升高。添加微藻JY-1和SH-1的處理組中，隨著微藻在養(yǎng)殖廢水中的生長繁殖，藻細胞含量逐步升高，廢水中的總氮、氨態(tài)氮和總磷水平逐步降低，至第3 d時相對較低，之后變化不明顯，這與微藻在廢水中的藻細胞含量變化曲線基本一致，說明微藻對廢水中氨態(tài)氮和磷的同化作用隨生物量增加而增長。而硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮在氨態(tài)氮快速下降的處理前期變化并不明顯，推測微藻對氨態(tài)氮的降解可能是一個同化過程，而并非簡單的物質形態(tài)變化[16]。氨態(tài)氮基本被利用，廢水中的氨態(tài)氮降到一定水平后，硝態(tài)氮才開始被利用，但總體來說，微藻對養(yǎng)殖廢水中硝態(tài)氮的去除效果并不顯著。水體中的亞硝態(tài)氮早期變化不明顯，而隨著硝態(tài)氮的降解，亞硝態(tài)氮的降解才逐步提升。綜合分析，小球 藻JY-1對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的脫氮除磷凈化能力最強。

表 1 3株微藻對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中總氮的去除效果Table 1 Efficiency of total nitrogen removal by various microalgae （單位: mg·L?1）

表 2 3株微藻對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中氨氮的去除效果Table 2 Efficiency of NH 4+-N removal by various microalgae （單位: mg·L?1）

表 3 3株微藻對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中硝態(tài)氮的去除效果Table 3 Efficiency of NO3?-N removal by various microalgae （單位: mg·L?1）

表 4 3株微藻對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中亞硝態(tài)氮的去除效果Table 4 Efficiency of NO2?-N removal by various microalgae （單位: mg·L?1）

表 5 3株微藻對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中總磷的去除效果Table 5 Efficiency of total phosphate removal by various microalgae （單位: mg·L?1）

3 討論與結論

污水成分復雜，同一藻株在不同來源污水中的生理活性有較大差異。即使是同一種屬的不同藻株，其對污水的處理效果也大不相同[17?20]。因而，篩選適合本土養(yǎng)殖廢水凈化處理用藻種具有現(xiàn)實指導意義。本研究從長樂養(yǎng)殖廢水中篩選獲得3株鹽度適應性較廣、生長較好的微藻藻種，并利用其對半海水養(yǎng)殖的南美白對蝦養(yǎng)殖廢水進行氮磷污染物去除效果的研究，根據(jù)OD680nm數(shù)值評估微藻在污水中的生長狀態(tài)。在實驗環(huán)境下，SH-1和JY-1兩株微藻對污水中的氮磷均具有較好的去除效果。培養(yǎng)3 d后，對氨氮的去除率在95%以上，對總磷的去除率在90%以上，鏈帶藻SH-1更是以較低的生物量獲得了與其他藻類相當?shù)奶幚硇Ч?，顯示了良好的應用前景。鏈帶藻作為具有較強固碳能力的一種綠藻，可用于污水中氮磷污染物的去除[21]，但國內對鏈帶藻用于養(yǎng)殖污水處理方面的研究鮮見報道，因此鏈帶藻SH-1在養(yǎng)殖污水中的生理活性和生理機制值得深入研究。后續(xù)研究可以針對不同的底物水平，在處理條件和處理工藝方面進行進一步優(yōu)化，探索該藻株對養(yǎng)殖污水凈化處理的極限所在。

JY-1的去除效率略高于SH-1。值得注意的是，對硝氮的顯著降解現(xiàn)象均僅出現(xiàn)在污水中的氨氮降低到一定水平后（本試驗中是0.1～0.4 mg·L?1），另外在硝氮的降解過程中均伴隨著亞硝氮水平的升高，水體中亞硝氮的積累可能對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成一定影響，雖然在本研究中亞硝氮的最終水平并不高，但如果底物營養(yǎng)水平提高，處理時間延長，污水處理過程中產(chǎn)生的亞硝氮可能積累到一個更高的水平。如果要將本研究應用于養(yǎng)殖污水的原位處理，需要進一步摸索處理條件，引入具有互補和相互促進作用的其他種屬藻類或反硝化菌群，進行藻-藻、藻-菌復合治理模式和處理工藝的探索[22?23]，這也是開展后續(xù)研究工作的一個可能的方向。由于微藻對廢水中氮磷污染物的利用是一個同化過程，氮、磷等元素并未真正從水體中去除，而是富集成為藻類生物質的構成組分。因此，在廢水凈化處理過程中需及時利用過濾、離心等手段富集藻體進行加工再利用，或者直接將處理后富含微藻的養(yǎng)殖水體應用于水產(chǎn)動物的原位養(yǎng)殖，以免藻體衰亡后釋放污染物造成水體環(huán)境的再次污染。