響應(yīng)面優(yōu)化刺五加總黃酮提取工藝及體外抗氧化研究

闞琦繽，劉瑞雪，王曉婭，蘇建青，褚秀玲

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000）

0 引 言

【研究意義】抗生素類飼料添加劑的禁用，導(dǎo)致畜禽消化道疾病的高發(fā)，而氧化應(yīng)激是造成消化道損傷的重要因素[1]。臨床研究顯示刺五加［Acanthopanax senticosus （Rupr. Maxim.） Harms］對(duì)畜禽消化道具有較好的抗氧化作用，而刺五加總黃酮是其中主要的抗氧化成分[2,3]。通過現(xiàn)代化的提取技術(shù)，高效提取刺五加總黃酮，能夠緩解刺五加原料藥材的緊缺狀況，評(píng)價(jià)其抗氧化能力，開發(fā)新型中藥飼料添加劑，應(yīng)用于畜禽臨床養(yǎng)殖，對(duì)預(yù)防畜禽消化道疾病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】王彥博等[4]采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了麥積山野生刺五加黃酮的提取工藝，發(fā)現(xiàn)提取溫度和料液比對(duì)黃酮得率影響顯著（P＜0.05），優(yōu)化后總黃酮得率為（28.11±0.19 ）mg·g?1，并評(píng)價(jià)了提取物清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基和總抗氧化能力的作用，顯示提取物的抗氧化能力均優(yōu)于對(duì)照品L-抗壞血酸。高騰等[5]采用響應(yīng)面優(yōu)化了刺五加莖皮黃酮的提取工藝，結(jié)果顯示提取溫度和提取時(shí)間對(duì)黃酮得率影響顯著（P＜0.05），黃酮的最大得率為38.0 mg·g?1。吳桐等[6]用正交試驗(yàn)優(yōu)化了快速溶劑萃取法提取刺五加葉中的蘆丁，結(jié)果顯示提取溫度和循環(huán)次數(shù)對(duì)蘆丁的得率影響差異顯著（P＜0.05），蘆丁得率達(dá)到0.155 mg·g?1。響應(yīng)面法是一種解決多變量問題的統(tǒng)計(jì)方法，能利用合理性試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，分析回歸方程來尋求最優(yōu)的工藝參數(shù)[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人關(guān)于提取刺五加根莖總黃酮的研究鮮有報(bào)道，抗氧化活性是評(píng)價(jià)其提取效果的關(guān)鍵因素?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)擬通過響應(yīng)面法優(yōu)化刺五加總黃酮的超聲波輔助乙醇提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken Design響應(yīng)面優(yōu)化，獲得超聲波輔助乙醇提取刺五加總黃酮的最佳提取工藝，并通過體外抗氧化試驗(yàn)評(píng)價(jià)刺五加總黃酮的抗氧化能力，為刺五加臨床的高效應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺五加飲片（聊城利民大藥房），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），RAW264.7細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），試驗(yàn)中所用其 他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LE203E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SB-600DTY超聲波多頻清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-5900紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；1530酶標(biāo)儀 ，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)流程

刺五加飲片→清洗干燥（60 ℃）→粉碎過篩（60目）→超聲波浸提→過濾→測(cè)定總黃酮得率→AB-8 樹脂純化→體外抗氧化能力評(píng)價(jià)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 刺五加總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.4.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 采用本實(shí)驗(yàn)室建立的標(biāo) 準(zhǔn)曲線制作方法[5]制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.1.2 刺五加總黃酮的提取 稱取2 g刺五加干粉放入150 mL錐形瓶中，加入乙醇溶液并搖晃均勻，然后放入超聲波清洗儀中進(jìn)行提取試驗(yàn)。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH的顯色體系[8]測(cè)量溶液中刺五加總黃酮 的得率。

1.4.1.3 單因素試驗(yàn) 本試驗(yàn)選用乙醇-水混合溶劑體系，準(zhǔn)確稱取2.0 g刺五加干粉，采用控制變量法分別對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行探究，考查各因素對(duì)刺五加總黃酮得率的影響 。各因素條件見表1。

1.4.1.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Benhnken Design原理，將刺五加總黃酮得率（Y）作為響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）和提取溫度（D），設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以優(yōu)化刺五加總黃酮提取工藝。各因素 水平見表2。

1.4.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳提取工藝，對(duì)刺五加進(jìn)行3次平行提取，驗(yàn)證新工藝的刺五 加總黃酮得率。

1.4.1.6 刺五加總黃酮純化 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化條件提取刺五加總黃酮，并參照Xie 等[9]研究的大孔樹脂純化總黃酮方法，純化刺五加總黃酮提取液。將純化后的刺五加總黃酮提取液減壓濃縮至總黃酮質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL?1，置于?20 ℃保存，用于體外抗氧化試驗(yàn)。1.4.1.7 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.4.1.8 H202誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)·mL?1，以每孔200 μL接種于96孔板。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，吸去培養(yǎng)基，并使用PBS清洗一遍。加入200 μL含有不同體積分?jǐn)?shù)H2O2的無血清1640培養(yǎng)基，孵育2 h后采用CCK-8法[10]計(jì)算細(xì)胞存活率。CK組使用不含H202的無血清1640培養(yǎng)基。每個(gè)試驗(yàn) 組設(shè)定6個(gè)重復(fù)孔。

表 1 單因素試驗(yàn)水平Table 1 Level of single factor experiment

表 2 四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)Table 2 Response surface experiment of 4 factors and 3 levels

1.4.1.9 刺五加總黃酮提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)·mL?1，以每孔200 μL接種于96孔板。將細(xì)胞分為CK組、H2O2組、H2O2+刺五加總黃酮低劑量（30 μg·mL?1）組、H2O2+刺五加總黃酮中劑量（60 μg·mL?1）組、H2O2+刺五加總黃酮高劑量（90 μg·mL?1）組。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80～90%時(shí)，吸去培養(yǎng)基，并使用PBS清洗一遍。刺五加黃酮組給予相應(yīng)計(jì)量的刺五加總黃酮作用24 h，CK組和H2O2組以無血清1640培養(yǎng)基代替刺五加總黃酮。處理結(jié)束后去除培養(yǎng)基，使用PBS清洗一遍后加入含有400 μM H2O2的無血清1640培養(yǎng)基作用2h，CK組使用無血清1640培養(yǎng)基代替 H2O2。采用CCK-8法計(jì)算細(xì) 胞存活率。

1.4.2 刺五加總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.4.2.1 DPPH自由基清除能力 按照Sridhar Kandi等[11]的方法測(cè)定刺五加總黃酮提取液的DPPH自由基清除活性，并計(jì)算清除率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。以同等質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸作陽性對(duì)照。

式中，A1：空白組吸光值；A2：刺五加總黃酮組吸 光值；A3：黃酮背景組吸光值

1.4.2.2 ABTS自由基清除能力測(cè)定 參考Zhao Z Y等[12]的方法，測(cè)定刺五加總黃酮提取液對(duì)ABTS自由基的清除活性，并計(jì)算清除率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。以同等質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸作陽性對(duì)照。

式中，B1：空白組吸光值；B2：刺五加總黃酮組吸 光值；B3：黃酮背景組吸光值。

1.4.2.3 羥基自由基清除能力測(cè)定 采用Dai C Y等[13]的研究方法測(cè)定刺五加總黃酮提取液對(duì)羥基自由基的清除活性，并計(jì)算清除率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。以同等質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸作陽性對(duì)照。

式中，C1：空白組吸光值；C2：刺五加總黃酮組 吸光值；C3：黃酮背景組吸光值

1.4.2.4 總還原能力測(cè)定 按照Shang H M等[14]的研究方法測(cè)定刺五加總黃酮提取液的總還原能力，以同 等質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸作陽性對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每1組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用 Design Expert 10.0.7 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和結(jié)果分析；使用 GraphPad Prism 8.0.1軟 件進(jìn)行作圖；使用 SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度在0～50 μg·mL?1時(shí)，方程線性關(guān)系良好，可用于測(cè)定刺五加總黃酮得 率。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)刺五加總黃酮得率的影響 如圖2所示，當(dāng)乙醇從30%增加到50%，刺五加總黃酮得率逐步提高；當(dāng)乙醇超過50%，刺五加總黃酮得率與乙醇濃度呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。說明乙醇-水相系統(tǒng)的濃度不同，其極性也不同，對(duì)黃酮分子的萃取能力也有變化[15]。在乙醇為50%時(shí)，溶劑的萃取能力最強(qiáng)，刺五加總黃酮得率達(dá)到最高值（18.58±0.32 ）m g·g?1。

2.2.2 液料比對(duì)刺五加總黃酮得率的影響 液料比是影響黃酮得率的一個(gè)重要因素，較高的液料比可以增加黃酮分子與溶劑的質(zhì)量傳遞，從而提高黃酮得率[16]；如圖3所示，當(dāng)液料比從10 mL·g?1增加至40 mL·g?1，總黃酮得率增長(zhǎng)較為明顯，并在40 mL·g?1達(dá) 到峰值（19.39±0.17） mg·g?1。

圖 1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of rutin

圖 2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)刺五加總黃酮得率的影響Fig. 2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)刺五加總黃酮得率的影響 由圖4可知，提取時(shí)間從25 min增加到70 min，刺五加總黃酮得率持續(xù)上升；當(dāng)時(shí)間超過70 min時(shí)，黃酮得率隨時(shí)間增長(zhǎng)而下降，在70 min達(dá)到最高值（17.04±0.19 ）mg·g?1。其原因可能是超聲波會(huì)對(duì)黃酮分子產(chǎn)生空化作用，提取時(shí)間過長(zhǎng)將導(dǎo)致黃酮化合物分解，致使得率下降[17]。

圖 3 液料比對(duì)刺五加總黃酮得率的影響Fig. 3 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of total flavonoids

圖 4 提取時(shí)間對(duì)刺五加總黃酮得率的影響Fig. 4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids

2.2.4 提取溫度對(duì)刺五加總黃酮得率的影響 如圖5

所示，當(dāng)提取溫度從40 ℃提高到70 ℃，刺五加總黃酮得率逐步提高，在70 ℃時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最高值（18.86±0.25 ）mg·g?1；當(dāng)提取溫度升高至80 ℃時(shí)，總黃酮得率出現(xiàn)下降。其原因可能是較高的提取溫度，能夠增加分子的運(yùn)動(dòng)速度，加快溶劑的滲透作用，從而使黃酮類化合物迅速擴(kuò)散到溶劑中[18]。但是提取溫度過高將導(dǎo)致部分黃酮類化合物分解[19]，降低刺五加總黃酮的提取率。

圖 5 提取溫度刺五加總黃酮得率的影響Fig. 5 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和模型擬合 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將刺五加總黃酮得率作為響應(yīng)值，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比和提取溫度設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，共29組。結(jié)果見表3。利用Design Expert 10.0.4軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到回歸方程如下：

其中：Y為刺五加總黃酮得率（mg·g?1）；A為乙醇（%）；B為液料比（mL·g?1）；C為提取時(shí)間（ min）；D為提取溫度（℃）。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析 對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行方 差分析，結(jié)果見表4，模型P＜0.000 1，說明模型所得方程與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合較好，可用該模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化刺五加總黃酮的提取。失擬項(xiàng)P＞0.05，說明該試驗(yàn)誤差小，模型殘差由隨機(jī)誤差產(chǎn)生。其中：一次項(xiàng)A、B、C、D的P＜0.01，說明乙醇、提取時(shí)間、液料比和提取溫度對(duì)刺五加總黃酮得率的影響極顯著；交互項(xiàng)AC、AD、BC、CD的P＜0.05，說明乙醇與提取時(shí)間，乙醇與提取溫度，液料比與提取時(shí)間，提取時(shí)間與提取溫度間的交互作用影響顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的P＜0.01，說明對(duì)刺五加總黃酮得率的影響均極顯著。

表 3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface experiment

使用軟件繪制響應(yīng)面三維曲線，如圖6所示，可直觀表現(xiàn)各因子對(duì)響應(yīng)值的影響趨勢(shì)，響應(yīng)面圖中曲線走勢(shì)越陡，表明該因素對(duì)黃酮得率影響越大，如走勢(shì)平滑，則影響較小。由圖6可知，乙醇（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）和提取溫度（D）的曲線均較陡，說明他們對(duì)提取率影響均較大，與表4分析一致。等高線的形狀能反映出兩因素交互作用的程度，橢圓形說明交互作用顯著，若為圓形則反之。由圖6可知，圖6（B）、6（C）、6（D）和6（F）的等高線表現(xiàn)為橢圓形且較為緊密，說明乙醇與提取時(shí)間，乙醇與提取溫度，液料比與提取時(shí)間，提取時(shí)間與提取溫度之間交互作用明 顯。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)建立的模型預(yù)測(cè)刺五加總黃酮最佳提取工藝，即乙醇55%，提取時(shí)間73 min，液料比45∶1，提取溫度72 ℃，進(jìn)行3次提取試驗(yàn)，測(cè)得刺五加總黃酮實(shí)際得率為（24.11±0.17） mg·g?1，與 預(yù)測(cè)值23.89 mg·g?1接近（表5）。

2.3.4 刺五加總黃酮純化 經(jīng)過AB-8樹脂純化后，刺五加總黃酮純度由純化前24.75%±0.54%提高至47.65%±0.032%。經(jīng)過純化后，刺五加總黃酮純度約是純化前的2倍，提升了刺五加總黃酮的質(zhì)量，可 用于后續(xù)抗氧化試驗(yàn)。

2.4 刺五加總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

2.4.1 DPPH自由基清除試驗(yàn) 如圖7所示，質(zhì)量濃度在10～100 μg·mL?1區(qū)間內(nèi)，刺五加總黃酮提取液對(duì)DPPH自由基的清除活性隨濃度的增加而增加。刺五加總黃酮在10～60 μg·mL?1時(shí)，清除活性迅速增強(qiáng)；當(dāng)超過60 μg·mL?1時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除活性趨于平緩。刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為28.38 μg·mL?1和15.90 μg·mL?1，刺五加總黃酮提取液DPPH自由基清除能力是L-抗壞血酸的55.21%。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg·mL?1時(shí)，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除率分別為8 8.26%和98.80%。

表 4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiment

2.4.2 ABTS自由基清除試驗(yàn) 由圖8可知，刺五加總黃酮提取液對(duì)ABTS自由基的清除活性與濃度成正相關(guān)。同等質(zhì)量濃度下，L-抗壞血酸對(duì)于ABTS自由基的清除能力要強(qiáng)于刺五加總黃酮提取液，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對(duì)ABTS自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為103.77 μg·mL?1和59.88 μg·mL?1，刺五加總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力為L(zhǎng)-抗壞血酸的57.70%。當(dāng)質(zhì)量濃度為300 μg·mL?1時(shí)，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對(duì)ABTS自由基的最大 清除率分別為93.64%和99.23%。

2.4.3 羥基自由基清除試驗(yàn) 如圖9所示，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對(duì)羥基自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為228.70 μg·mL?1和114.12 μg·mL?1，刺五加總黃酮對(duì)于羥基自由基的清除能力是L-抗壞血酸的49.90%。雖然刺五加總黃酮提取液對(duì)羥基自由基的清除活性和濃度呈正相關(guān)，但增長(zhǎng)趨勢(shì)較為平緩。當(dāng)質(zhì)量濃度為300 μg·mL?1時(shí)，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對(duì)羥基自由基的清除率分別為6 2.82%和85.33%。

2.4.4 總還原能力測(cè)定 刺五加總黃酮的還原能力由吸光值的高低表示，吸光值越高其還原能力越強(qiáng)。如圖10所示，隨著刺五加總黃酮濃度的提高，吸光值也隨之快速升高。當(dāng)質(zhì)量濃度在10～100 μg·mL?1范圍內(nèi)，刺五加總黃酮提取液吸光值從0.09增加到0.76；L-抗壞血酸吸光值從1.13增加到1.25。在質(zhì)量濃度為100 μg·mL?1時(shí)，刺五加總黃酮提取液的總還原 能力占L-抗壞血酸的61.04%。

2.5 刺五加總黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作 用

2.5.1 建立H2O2氧化損傷模型 如圖11所示，當(dāng)H2O2濃 度 從100 μmol·L?1增 加 到1000 μmol·L?1，RAW264.7細(xì)胞存活率下降明顯，說明H2O2對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷作用，致使部分細(xì)胞死亡。H2O2對(duì)RAW264.7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為391.4 μmol·L?1，為了方便后續(xù)試驗(yàn)，因此選擇400 μ mol·L?1為RAW264.7細(xì)胞建模濃度。

圖 6 兩因素間交互作用對(duì)刺五加總黃酮得率的影響Fig. 6 Effect of interaction between two factors on extraction of total flavonoids

表 5 刺五加總黃酮最佳提取條件Table 5 Optimized conditions for flavonoid extraction from A.senticosus

圖 7 DPPH自由基清除活性Fig. 7 DPPH free radical scavenging ability of extracted flavonoids

圖 8 ABTS+自由基清除活性Fig. 8 ABTS+ free radical scavenging ability of extracted flavonoids

2.5.2 刺五加總黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷保護(hù)試驗(yàn) 如圖12所示，H2O2組細(xì)胞活性與CK組相比

圖 9 羥基自由基清除活性Fig. 9 Hydroxyl free radical scavenging ability of extracted flavonoids

圖 10 刺五加總黃酮還原能力Fig. 10 Reducing power of flavonoids extract from A. senticosus

圖 11 H2O2對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig. 11 Effects of H2O2 on proliferation of RAW264.7 cells

下降明顯，說明H2O2對(duì)RAW264.7細(xì)胞造成了一定的氧化損傷。刺五加總黃酮提取液高、中、低組（90、60、30 μg·mL?1）與H2O2組相比，RAW264.7細(xì)胞活性明顯提高，說明刺五加總黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

圖 12 刺五加總黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用Fig. 12 Effect of extracted flavonoids in protecting oxidative damage on RAW264.7 cells

3 討論與結(jié)論

刺五加傳統(tǒng)的提取方法主要是水提法和醇提法，具有使用操作簡(jiǎn)便、成本低和適用性廣的優(yōu)勢(shì)，但是隨著中藥的用量增加，中藥成本的升高，需要用更先進(jìn)的現(xiàn)代化提取技術(shù)進(jìn)行提取。超聲波輔助提取具有提取時(shí)間短，提取溫度低和提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，溫和的提取條件能夠更好地保護(hù)提取物的活性，減少對(duì)有效成分的破壞。優(yōu)化方法常用的有正交設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面法，正交設(shè)計(jì)法選取的試驗(yàn)點(diǎn)并不能完全反應(yīng)整體的情況，且最終結(jié)果僅是對(duì)所選水平的優(yōu)化，而響應(yīng)面法將數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合后，以圖形表達(dá)函數(shù)關(guān)系，且能檢查出各因素之間的交互性，具有更好的優(yōu)化作用。本試驗(yàn)用響應(yīng)面優(yōu)化出的提取條件是：乙醇55%，提取時(shí)間73 min，液料比45 mL·g?1，提取溫度72 ℃，總黃酮得率達(dá)到24.11 mg·g?1。和傳統(tǒng)的溶劑提取法相比，超聲波輔助提取法具有提取時(shí)間短、提取溫度低和提取效率高的優(yōu)點(diǎn)。

提取物的活性是評(píng)價(jià)其提取效果更重要的因素，畢竟提取物最終的藥效才是其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵價(jià)值。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用調(diào)節(jié)失衡，氧化作用處于優(yōu)勢(shì)地位，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)，從而產(chǎn)生過量的氧化中間產(chǎn)物，對(duì)機(jī)體造成損傷，降低機(jī)體的免疫功能[20]。目前，對(duì)于中藥提取物的抗氧化活性測(cè)定主要集中于體外氧化自由基清除試驗(yàn)[21]。結(jié)果表明，刺五加總黃酮提取液對(duì)3種自由基都具有一定的清除能力，并且劑量依賴性顯著。其中刺五加總黃酮提取液對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基清除能力的IC50值為28.38 μg·mL?1、107.77 μg·mL?1和228.70 μg·mL?1，分別是L-抗壞血酸IC50值的55.21%、57.70%和49.90%。但是，隨著質(zhì)量濃度的提高，刺五加總黃酮提取液同L-抗壞血酸對(duì)3種自由基清除率的差異逐漸縮小。刺五加總黃酮提取液的總還原能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg·mL?1，刺五加總黃酮提取液的總還原能力是L-抗壞血酸的0.61倍。其次，試驗(yàn)通過H2O2刺激RAW264.7細(xì)胞建立氧化損傷模型，結(jié)果表明，30 μg·mL?1、60 μg·mL?1、90 μg·mL?1的刺五加總黃酮組與H2O2處理組比較，均具有顯著的抗氧化損傷作用，差異性顯著（P＜0.05）。由此可見，刺五加總黃酮提取液具有較好的體外抗氧化活性，為刺五加活性成分的深入研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。