福建省七葉一枝花細(xì)菌性軟腐病病原鑒定

鄭梅霞，蘇海蘭，肖榮鳳，何桂強(qiáng)，朱育菁 *

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2. 井岡山自然保護(hù)區(qū)長(zhǎng)古嶺林場(chǎng)，江西 井岡山 343600）

0 引言

【研究意義】七葉一枝花［Paris polyphylla Smith var. chinensis（Franch.）Hara］屬百合科重樓屬植物，是歷版《中國(guó)藥典》收載的兩種重樓藥材基原植物之一[1?3]。七葉一枝花根莖藥用歷史悠久，具有抗腫瘤、抗菌消炎等作用[4]。七葉一枝花人工種植過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)軟腐病、葉斑病、莖腐病、根腐病等病害[5]，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和質(zhì)量[6?9]。分析病害的發(fā)生特點(diǎn)，鑒定七葉一枝花病害的病原菌，對(duì)充分了解七葉一枝花病害從而采取針對(duì)性的防治措施具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】馬維思等[1]對(duì)滇重樓軟腐病菌進(jìn)行分離鑒定，其致病菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種Pectobacterium carowvorum subsp. carotovorum。趙振玲等[10]對(duì)滇重樓的葉斑病進(jìn)行分析，是由半知菌類的柱隔孢（Ramularia）引起的真菌性病害。滇重樓的根腐病主要由多種因素綜合引起，發(fā)生率一般為50%，嚴(yán)重可達(dá)87.7%[11]。【本研究切入點(diǎn)】目前，在福建省光澤縣七葉一枝花主要產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)了軟腐病，造成生育期的七葉一枝花植株葉片腐爛、莖稈開裂、植株倒伏和塊莖腐爛，田間發(fā)病率約為5%～45%。已對(duì)七葉一枝花種植形成較大威脅。該病害在我省發(fā)生的情況還缺乏了解，尚無(wú)有效的防治方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)七葉一枝花軟腐病的發(fā)生特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，以期為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

七葉一枝花軟腐病病株于2018～2019年采自福建省光澤縣福建承天農(nóng)林科技發(fā)展有限公司重樓規(guī)范化栽培基地。

LB：蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂17.5 g，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2。主要試劑：無(wú)菌水、STE Buffer、Tris-平衡酚、氯 仿、TE Buffer。

1.2 方法

1.2.1 田間病害調(diào)查 2018—2019年，在福建省光澤多個(gè)七葉一枝花種植基地，采用田間調(diào)查法觀察發(fā)病植株的癥狀，了解七葉一枝花軟腐病的發(fā)生情況 和發(fā)病特點(diǎn)。

1.2.2 病原菌分離純化和保存 采用組織分離法進(jìn)行病原菌的分離和純化。采集剛發(fā)生軟腐病的新鮮七葉一枝花葉片、莖稈，自來(lái)水沖洗干凈植株表面泥土后，酒精棉球擦拭干凈，將植株組織先用消毒后的刀片切去表皮，然后切病健交界處大小約為2 mm×2 mm×1 mm的薄片。將切成片狀的病組織在75%的酒精溶液中浸泡30 s，然后在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒5～8 min后，用無(wú)菌水漂洗3次，將植物組織片貼到LB平板表面，25 ℃倒置培養(yǎng)2 d，待培養(yǎng)物長(zhǎng)出，采用稀釋劃線轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)皿中。純化兩次，以甘油∶LB液=1∶4的比例存放在 ?80 ℃凍保存。

1.2.3 致病性測(cè)定 由于該植物對(duì)生長(zhǎng)條件要求較為嚴(yán)格，室內(nèi)條件不容易培養(yǎng)，于4—5月選在田間獨(dú)立栽種的盆苗中處理，取16株長(zhǎng)勢(shì)一致的7年生七葉一枝花，自來(lái)水沖洗去除表面泥土，分析選擇葉片或莖稈用毛刷把10?6cfu·mL?1濃度的菌液刷在表面，處理后的葉片與莖桿用濕紗布包住，培養(yǎng)2 d后，去除紗布繼續(xù)培養(yǎng)，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，觀 察發(fā)病情況。

1.2.4 病原菌鑒定 形態(tài)特征：經(jīng)致病性測(cè)定確認(rèn)病原細(xì)菌后，透射電鏡觀察菌體特征。分子鑒定：利用細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)純化菌株的菌液提取基因組，利用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'和1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGA-3'聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增該菌株的16s rDNA片段，然后將 PCR 產(chǎn)物電泳后回收，送由基因公司測(cè)序[12]。將測(cè)序結(jié)果用 Blast 與NCBI 中的Gene Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣菌株的 16 SrDNA進(jìn)行同源性比對(duì)，使用 MEGA7 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的 構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 七葉一枝花軟腐病的特點(diǎn)及危害

七葉一枝花為草本宿根植物，一年出苗一次。從每年2月植株出苗開始，多雨時(shí)節(jié)可觀察到在葉片、莖稈和塊莖均有軟腐病發(fā)生，并且地溫在20 ℃～25 ℃或在25 ℃以上，通氣不良、田里積水，利于病害發(fā)生發(fā)展。軟腐病主要危害部位為葉片和莖部，葉片發(fā)病初期在受害部位出現(xiàn)水浸狀的壞死，病部很快擴(kuò)大，感病部位內(nèi)部組織被細(xì)菌分解成液體狀態(tài)，病組織開始軟化、變色，病斑邊緣初有明顯界限，隨著病勢(shì)的發(fā)展界限逐漸模糊不清，然后軟腐（圖1-a、b）。莖稈發(fā)病初期在莖稈基部形成水浸狀病斑，后軟化，莖內(nèi)部開始腐爛，產(chǎn)生刺激性臭味，發(fā)病部位沿著維管束向上蔓延造成整個(gè)莖稈稀軟腐爛，葉片萎蔫、植株倒伏（圖1-c）。隨著病情的蔓延，七葉一枝花塊莖也會(huì)受到軟腐病的危害，軟腐組織呈棕褐色，被侵染組織和健康組織界限明顯，病斑邊緣有褐色或黑色的色素。腐爛早期無(wú)氣味，二次侵染后有臭氣、黏液、黏稠物質(zhì)（圖1-d）。

圖 1 七葉一枝花植株軟腐病發(fā)病癥狀Fig. 1 Symptoms of soft rot disease on P. polyphylla

2.2 致病性測(cè)定

植株接種后，接種葉片的植株第4 d開始發(fā)病，并逐漸向四周擴(kuò)散蔓，于第7 d蔓延至全葉和莖桿，葉片呈水漬狀（圖2-a和圖2-b）。接種莖桿的植株第3 d開始發(fā)病，并逐漸向四周擴(kuò)散蔓延，于第5 d導(dǎo)致莖桿開裂，內(nèi)部腐爛和軟腐，有菌濃流出（圖2-c）。從發(fā)病的組織中再次分離獲得的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定，證明與所接病原菌一致。

圖 2 七葉一枝花植株人工接種致病癥狀.Fig. 2 Symptoms of soft rot disease on artificially inoculated P.polyphylla plant

2.3 病原菌形態(tài)特征

該菌在肉汁凍培養(yǎng)基上菌落圓形、光滑、乳白色、半透明，菌落邊緣光滑或呈波狀，菌落中央有略帶乳黃色的瘤狀突起（圖2）。七葉一枝花植株軟腐病病原細(xì)菌的透射電鏡掃描圖如圖3所示，菌體為兩端鈍圓呈短桿狀，大小1.4～2.4（平均1.6）μm × 0.4～0.6（平均 0.5）μm，具有2～8 根周生鞭毛（圖4）。

圖 3 植株軟腐病病原菌的菌落形態(tài)Fig. 3 Morphology of soft rot pathogen colonies

圖 4 植株軟腐病病原細(xì)菌形態(tài)特征Fig. 4 Morphology of soft rot pathogen

2.4 病原菌分子鑒定

代表性菌株FJAT-49333經(jīng)16SrDNA測(cè)序，并在NCBI 中的Gene Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣菌株的 16 SrDNA進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)與Pectobacterium carotovorum同源性均達(dá)到99%以上，發(fā)育樹圖如圖5所示。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，16S rDNA鑒定和致病性實(shí)驗(yàn)，可將七葉一枝花軟腐病的病原菌鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum。

圖 5 七葉一枝花植株軟腐病病原細(xì)菌的發(fā)育樹Fig. 5 Pathogenic bacteria development tree of soft rot disease on P. polyphylla

3 討論與結(jié)論

七葉一枝花作為一種馴化時(shí)間較短的藥用植物，隨著人工種植種植面積的不斷增加，各種病害問(wèn)題日漸凸顯[13?15]。細(xì)菌性軟腐病是世界性的重要細(xì)菌性病害之一，除危害白菜、甘藍(lán)、蘿卜、花椰菜等十字花科蔬菜外，還危害馬鈴薯、番煎、辣椒、大蔥、洋蔥、胡蘿卜、序菜、萵苣等煎科、豆科、傘形科和葫聲科的多種蔬菜以及馬蹄蓮、鸞尾、唐菖蒲等觀賞植物[16]。胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum會(huì)引起茄子、番茄、辣椒和芹菜等多種作物發(fā)生軟腐病[17?19]，該類細(xì)菌性軟腐病是世界性重要病害之一[20?22]。胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum寄主范圍和地理分布廣泛，是自然條件下普遍存在的植物病原菌，能侵染數(shù)百種蔬菜以及一些花卉植物，細(xì)菌性軟腐病具有發(fā)生范圍廣和難以防治的特點(diǎn)[23?24]。楊鐘靈等[19]研究表明，胡蘿卜軟腐果膠桿菌可以引起黃花馬蹄蓮的軟腐病。晉知文等[25]研究表明，胡蘿卜軟腐果膠桿菌可以引起芹菜軟腐病。

本研究首次分離鑒定了七葉一枝花軟腐病的病原菌，為胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum。通過(guò)對(duì)七葉一枝花細(xì)菌性軟腐病的分離與鑒定以及對(duì)七葉一枝花軟腐病發(fā)生時(shí)進(jìn)行田間調(diào)查，明確了其致病菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovoru。田間栽培時(shí)應(yīng)注意加強(qiáng)通風(fēng)、清除積水，及時(shí)清除病株，以減輕田間七葉一枝花軟腐病的發(fā)生和蔓延。本研究對(duì)下一步研究七葉一枝花細(xì)菌性軟腐病的有效防治方法提供前期理論基礎(chǔ)。