太子參根際土壤微生物多樣性及其與土壤主要理化因子的相關(guān)性

高慧芳，許佳音，孟 婷，陳金紹，邱君志，張重義，張燎原

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，福建 廈門 361022；3. 廈門中藥廠有限公司，福建 廈門 361002；4. 福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】太子參（Pseudostellaria heterophylla）別名孩兒參、童參，為石竹科多年生草本植物，以根部入藥，具有抗疲勞、抗衰老、調(diào)脾虛體倦等功效[1]。太子參以福建省柘榮縣栽培歷史最為悠久，其品質(zhì)優(yōu)良，年產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的60%，素有“中國(guó)太子參之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，并于1987年列為太子參的最佳生長(zhǎng)適宜區(qū)、中國(guó)太子參生產(chǎn)基地[2]。近年來(lái)，太子參醫(yī)藥價(jià)值開發(fā)日益深入，其原藥材的需求量迅速增加，價(jià)格不斷攀升，給太子參產(chǎn)業(yè)化發(fā)展帶來(lái)重要機(jī)遇。但由于太子參在栽培過(guò)程中存在的連作障礙問(wèn)題，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[3?4]。太子參連作障礙主要表現(xiàn)為塊根重下降、分根數(shù)減少特別是地下部位不能正常膨大，從而不能形成具有商品價(jià)值的塊根?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前期研究發(fā)現(xiàn)，土壤肥力、植物根系分泌物和根際微生物種群的失衡，是導(dǎo)致太子參連作障礙的主要原因[5]。而根系分泌物介導(dǎo)的根際微生物種群失衡，尤其是病原微生物的增多，成為太子參連作效應(yīng)發(fā)生的重要原因[6?8]。微生物與土壤生態(tài)功能是相輔相成、息息相關(guān)的，并且跟植物之間有著緊密關(guān)聯(lián)。微生物群落的組成及其多樣性是衡量土壤性質(zhì)和功能的一個(gè)重要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，太子參連作及菌肥處理會(huì)顯著影響太子參根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性，推測(cè)微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡是導(dǎo)致太子參連作效應(yīng)形成的根本原因。而不同產(chǎn)地的太子參根際土壤微生物的含量及群落結(jié)構(gòu)存在較大差異性[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】柘榮縣由于特殊的地理位置，不同太子參種植地土壤性質(zhì)、氣候環(huán)境、海拔等因素有所差別，但栽培過(guò)程中都存在不同程度的連作問(wèn)題。不同的栽培過(guò)程是否導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)的變化，存在哪些共性和差異性，這些共性是否是引起連作問(wèn)題、病害增多的原因。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，研究柘榮縣5個(gè)不同樣地太子參根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，并分析土壤pH值和主要化學(xué)性質(zhì)及太子參根系分泌物酚酸類物質(zhì)對(duì)其的影響，以期揭示太子參栽培過(guò)程中病害形成存在的共性及差異性問(wèn)題，為科學(xué)種植太子參并提高其產(chǎn)量及品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

福建省寧德市柘榮縣，地理位置為N27°05′～N27°19′，E119°43′～E120°04′，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，溫和濕潤(rùn)，年平均氣溫15.5 ℃，雨量充沛，年平均降水量為1 600～2 400 mm，平均相對(duì)濕度約為85.00%，雨日多雨區(qū)廣，11～2月少雨，3～6月多雨[2]，為 太子參提供良好的種植條件。

1.2 試驗(yàn)樣品采集

于2018年6月25日進(jìn)行柘榮縣太子參根際土壤的采集：選擇植株健壯的太子參，除去表層土壤，找到植物根系，輕輕抖落根系上的土壤于無(wú)菌采集袋中，做好采樣記錄。將每個(gè)樣地的太子參根際土壤取5組混為1個(gè)樣品，每處樣地設(shè)3次重復(fù)，分別進(jìn)行理化性質(zhì)的測(cè)定、根系分泌物的檢測(cè)和土壤宏基因組DNA的提取。5個(gè)樣地序號(hào)為：Ⅰ（英山鄉(xiāng)油麻厝村）；Ⅱ（東源鄉(xiāng)鴛鴦?lì)^村）；Ⅲ（東源鄉(xiāng)綢嶺村）；Ⅳ（東源鄉(xiāng)東源村）；Ⅴ（乍洋鄉(xiāng)束劉厝村）。5個(gè)樣地的地形為中山丘陵，成土母質(zhì)為坡積母 質(zhì)，質(zhì)地是中壤類型[11]，詳細(xì)信息如表1所示。

1.3 高通量測(cè)序及分類注釋

以提取的宏基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)和細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)，基于Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序工作由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。根據(jù)測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)，進(jìn)行質(zhì)量控制，采用PEAR（Paired-End reAd mergeR，version 0.9.6）和Vsearch（version 2.3.4）軟件過(guò)濾原始的測(cè)序數(shù)據(jù)，得到有效序列（Valid_Data），并將有效序列在大于97.00%相似性條件下進(jìn)行聚類OTU（Operational Taxonomic Units，操作分類單元），通過(guò)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，并得到每個(gè)物種在該樣品中的豐度。利用QIIME軟件計(jì)算樣品中的Alpha多樣性值和Beta多樣性值，并進(jìn)行聚類分析。計(jì)算差異種群兩兩間的Spearman秩相關(guān)系數(shù)，借助Gephi（Version 0.9.2）軟件構(gòu)建差異種群共變化網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步探究差 異種群間的相互關(guān)系。

1.4 土壤pH值及主要化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

測(cè)定采集土樣的理化性質(zhì)，土壤pH值采用電位計(jì)法（水土質(zhì)量比2.5∶1）；土壤有機(jī)質(zhì)（Organic Matter,OM）采用外加熱重鉻酸鉀氧化-容量法；土壤全氮（total nitrogen, TN）采用碳氮元素分析儀（VARIO MAX, 德國(guó)ELEMENTAR）測(cè)定[12]；土壤銨態(tài)氮（ammonium nitrogen, NH4+）采用靛酚藍(lán)比色法；土壤全磷（total phosphorus, TP）采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法；土壤有效磷（available phosphorus, AP）采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；土壤全鉀（total potassium, TK）采用堿熔-火焰光度法；土壤速效鉀（available potassium, AK）采用乙酸銨浸提-火焰光度法[13]。

表 1 太子參根際土壤樣品信息Table 1 Information on soils sampled from rhizosphere of P. heterophylla habitats

土壤中有效態(tài)銅、有效態(tài)鋅和有效態(tài)鐵用0.10%HCl浸提，土壤中有效態(tài)錳采用醋酸銨浸提法，并使用電感耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS，NexION 300X，PerkinElmer）測(cè)定[14]。條件參數(shù)：功率為1 300 W，等離子氣流量為13.00 L·min?1，輔助氣流速為1.40 L·min?1，氦氣流量為5.20 L·min?1，氫氣流速為5.80 L ·min?1，采用深度為7.80 mm，重復(fù)采樣3次。

1.5 土壤酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)

土樣的前期處理參考吳丹等[15]的相關(guān)方法，樣品旋蒸后用甲醇定容至5 mL后用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。9種常見(jiàn)酚酸為對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸及肉桂酸，溶解于甲醇作為標(biāo)品進(jìn)行HPLC檢測(cè)。前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的色譜條件：色譜柱（SunFire C18 5 μm,4.6 mm×250 mm Column），流動(dòng)相A為0.1%磷酸，流動(dòng)相B為甲醇，0～6 min（A：73.00%；B：27.00%），6～22 min（A：50.00%；B：50.00%）檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃。儀器為Waters e2695-Model C ode 998。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素（one-way ANOVA）方差分析和Duncan法多重比較分析（a=0.05）。采用Adobe Photoshop CS6軟件作 圖。采用Canoco 5軟件進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)（CCA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 太子參根際土壤測(cè)序的有效數(shù)據(jù)

5個(gè)樣地的太子參根際土壤經(jīng)測(cè)序后共得到744 331條真菌基因優(yōu)化序列，按照97.00%序列相似性基礎(chǔ)，可劃分為1 314個(gè)真菌分類單元（OTU）：14門（Phylum），44綱（Class），87目（Order），157科（Family），275屬（Genus），396種（Species）；共得到1 032 029條細(xì)菌基因優(yōu)化序列，按照97.00%序列相似性劃分10 310個(gè)細(xì)菌分類單元（OTU）：38門（Phylum），101 綱（Class），160 目（Order），263科（Family），484屬（Genus），554種（Species）。如圖1-A和1-B所示，真菌和細(xì)菌的OTU豐度存在不同程度的差異。1-A所示，5組之間只有Ⅰ組和Ⅱ組真菌OTU豐度呈顯著差異性；1-B所示，Ⅳ組的細(xì)菌OTU豐度最高；Ⅲ組的細(xì)菌OTU豐度最低，與Ⅰ、Ⅱ組的細(xì)菌OTU豐度有顯著差異性；而Ⅲ組和Ⅳ組的細(xì)菌OTU豐度呈極顯著差異。不同樣地的真菌OTU豐度與細(xì)菌OTU相比，5組之間的細(xì)菌OTU豐度呈現(xiàn)更明顯的差異性。說(shuō)明不同栽培地對(duì)太子參根際土壤細(xì)菌的影響大于對(duì)其真菌的影響，且太子參根際土壤微生物以細(xì)菌為主。

通過(guò)對(duì)韋恩圖中各樣品特有的或共有的真菌OTU數(shù)進(jìn)行分析，如圖1-C所示，5個(gè)樣地的樣品中真菌共有OTU數(shù)達(dá)到264個(gè)。其中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ4組的共有真菌OTU為99，說(shuō)明這4組的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性高；Ⅰ、Ⅱ 和Ⅳ三者共有的真菌OTU為40，說(shuō)明這3組的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高；Ⅲ和Ⅳ這兩者的共有真菌OTU為64，說(shuō)明這2組的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ特有真菌OTU分別為31、22、121、45、72，分別占其OTU總數(shù)的4.03%、3.12%、16.31%、5.45%、9.36%。而5個(gè)樣地共有真菌OTU數(shù)均高于其他的隨機(jī)組合共有真菌OTU，表明不同樣地的微生物物種相近。

從圖1-D可以看出，5個(gè)樣地土壤細(xì)菌共有OTU數(shù)為2 044；Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ四組的共有細(xì)菌OTU為2 109，說(shuō)明這4組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性高；Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ三者共有的細(xì)菌OTU為873，說(shuō)明這3組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高；Ⅰ和Ⅳ這兩者的共有細(xì)菌OTU為250，說(shuō)明這2組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ特有細(xì)菌OTU分別為140、49、396、311、161，分別占各太子參細(xì)菌OTU總數(shù)的1.87%、0.66%、8.68%、3.81%、2.37%。

從圖1綜合分析，單個(gè)樣地的OTU數(shù)均不同，其中單個(gè)樣地的OTU數(shù)Ⅲ為最多（真菌121個(gè)，細(xì)菌396個(gè)），Ⅱ最少（真菌22個(gè)，細(xì)菌49個(gè)），說(shuō)明不同樣地太子參根際土壤中各自特有的微生物不同，存在差異性；而5個(gè)樣地的共有OTU數(shù)明顯多于特有的數(shù)量，說(shuō)明5個(gè)樣地的根際土壤微生物組成 趨勢(shì)相似。

圖 1 真菌和細(xì)菌的OTU豐度及韋恩圖（AB：箱線圖；CD：韋恩圖）Fig. 1 OTU richness and Venn diagrams on fungi and bacteria in rhizosphere soil (AB: Box-plot; CD: Venn diagrams)

2.2 5個(gè)樣地太子參根際土壤微生物群落豐度與多樣性

比較5個(gè)樣地太子參根際土壤微生物群落的α多樣性，其中Observed-species指數(shù)、Chao1指數(shù)越高，說(shuō)明物種多樣性越好，物種越豐富；Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)越高，說(shuō)明物種豐富度和均勻度越好。如表2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，太子參根際土壤細(xì)菌群落的Observed-species指數(shù)和Chao1指數(shù)呈明顯的差異性。其中Ⅳ、Ⅱ土壤中細(xì)菌有著較高的Observed_species指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，說(shuō)明樣地Ⅳ、Ⅱ土壤的細(xì)菌群落豐富度和多樣性高于其他3個(gè)樣地；Ⅲ土壤的多樣性指數(shù)均呈現(xiàn)較低值，說(shuō)明此樣地土壤菌群豐富度和多樣性較低?？傊訁⒏H土壤中細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)趨勢(shì)為：Ⅳ＞Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅴ＞Ⅲ，5個(gè)樣地太子參根際土壤的細(xì)菌群落豐富度及均勻性存在顯著差異，而真菌群落差異不明顯。

主坐標(biāo)分析圖上點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離越近，說(shuō)明樣品之間的微生物群落差異越小。由圖2可以看出，真菌第一軸的解釋量為27.25%，第二軸的解釋量為13.95%，第一、二兩軸的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到41.20%；細(xì)菌第一軸的解釋量為38.67%，第二軸的解釋量為12.80%，第一、二兩軸的累積貢獻(xiàn)率達(dá)51.47%，可以較為全面反映樣本信息。圖2-A中，其中Ⅳ、Ⅰ、Ⅱ之間的點(diǎn)距離較近，說(shuō)明3個(gè)樣地的微生物群落構(gòu)成相似。而Ⅲ、Ⅴ的3個(gè)點(diǎn)與其他樣地的點(diǎn)之間距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明Ⅲ、Ⅴ與其他樣地的微生物群落構(gòu)成差異較大。從圖中可以看出，無(wú)論是真菌或者細(xì)菌群落，Ⅳ、Ⅰ、Ⅱ這3個(gè)樣地之間距離較近，說(shuō)明每組內(nèi)的群落構(gòu)成相似性較高；而Ⅲ與其他樣地距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明該樣地的微生物群落與其他樣地的微生物群落構(gòu)成相似性較低。

基于Unifrac距離矩陣進(jìn)行UPGMA聚類分析，如圖3所示，將5組樣品劃分為2個(gè)類群。第一類群包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ四組樣品，說(shuō)明這4個(gè)樣地太子參根際土壤微生物群落相似性較高；第二類為Ⅲ樣地樣品，與第一類樣品整體距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明Ⅲ樣地樣品與其他4組樣地太子參根際土壤微生物群 落差異較大。

表 2 樣品α多樣性指數(shù)Table 2 α diversity indices on 5 rhizosphere soil samples at P. heterophylla habitats

圖 2 主坐標(biāo)分析太子參根際土壤真菌和細(xì)菌群落差異Fig. 2 Principal coordinates analysis on fungi and bacteria communities in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為了反映太子參根際土壤微生物群落組成的相似性和差異性，對(duì)OTU進(jìn)行物種分類后首先在“門”分類等級(jí)對(duì)5個(gè)樣地的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。如圖4-A所示，聚類后OTU對(duì)應(yīng)的真菌類群涉及子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、類原生動(dòng)物門（Rozellomybota）、球囊菌門（Glomeromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、芽枝菌門（Blastocladiomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、Aphelidiomycota、捕 蟲 菌 門（Zoopagomycota），一個(gè)門未被鑒定unidentified，一個(gè)門未被分類fungi_unclassitied。其中子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）在5個(gè)樣地的含量都很高；子囊菌門（Ascomycota）在Ⅴ根際土壤中的含量為最高，在Ⅲ根際土壤中含量較低；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在Ⅲ根際土壤中的含量為最高，在Ⅴ根際土壤中含量較低；接合菌門（Zygomycota）在 Ⅰ 根際土壤中含量為最高，在Ⅴ根際土壤中的含量較低，說(shuō)明不同樣地的微生物群落豐度存在差異。

圖 3 UPGMA 聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of UPGMA

圖 4 太子參根際土壤優(yōu)勢(shì)微生物群落組成Fig. 4 Compositions of dominant microbial communities in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

如圖4-B所示，在細(xì)菌“門”的分類水平上，5個(gè)樣地太子參根際土壤在細(xì)菌菌落的組成上并無(wú)較大差別，且在細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度上差異也較小。在5個(gè)樣地的太子參根際土壤中有6個(gè)“門”的細(xì)菌菌群分布最多：變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、后壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）。其中變形菌門（Proteobacteria）在5個(gè)樣地的豐度最高，并在Ⅲ的太子參根際土壤中含量占據(jù)首位。酸桿菌門（Acidobacteria）在5個(gè)樣地的豐度有所差異，其中在Ⅳ和Ⅱ的太子參根際土壤中含量相似且豐度較高，在Ⅲ土壤中的含量為最少。而放線菌門（Actinobacteria）在Ⅲ土壤中含量最高，在Ⅳ和Ⅱ的土壤中含量相對(duì)較低。綠彎菌門（Chloroflexi）和后壁菌門（Firmicutes）在5個(gè)樣地的土壤中含量基本持平?？偟膩?lái)說(shuō)，在“門”分類水平上，5個(gè)樣地的優(yōu)勢(shì)菌群保持一致，說(shuō)明在“門”水平，太子參根際土壤微生物群落組成具有相似性。

豐度熱圖是對(duì)豐度最高的前20種物種分類信息進(jìn)行相似性聚類，比較在不同樣地之間“屬”的含量差異，從圖4-C中可以看出，正青霉屬（Eupenicillium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、柄孢殼屬（Podospora）、被孢霉菌屬（Mortierella）、田頭菇屬（Agrocybe）在樣地Ⅰ中豐度較高，腐質(zhì)霉屬（Humicola）、Ascomycota_unclassified、肉座菌屬（Hypocrea）在樣地Ⅴ中豐度較高，粉褶蕈屬（Entoloma）在樣地Ⅱ豐度較高，雙擔(dān)菌屬（Geminibasidium）、瘦臍菇屬（Rickenella）在樣地Ⅲ中豐度較高，赤霉屬（Gibberella）、毛殼菌屬（Chaetomium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、捷別爾達(dá)孢屬（Teberdinia）在Ⅳ中豐度較高。由此可見(jiàn)，同一菌屬在不同樣地的豐度存在差異性。如圖4-D所示，同一細(xì)菌物種在不同樣地間的豐度亦存在差異，如Gp2、Gp3在樣地Ⅳ中豐度較高，芽單孢菌屬（Gemmatimonas）在樣地Ⅱ中豐度較高，但是它們?cè)谄渌麡拥刂胸S度均較低；對(duì)各樣品進(jìn)行聚類發(fā)現(xiàn)，Ⅱ和Ⅳ為一類，此結(jié)果與細(xì)菌群落組成及分布圖一致。

表3展示的是不同樣地間太子參根際土壤真菌群落中前20種優(yōu)勢(shì)分類單元及其相對(duì)豐度?？梢钥闯?，Ⅰ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是被孢霉屬（Mortierella）、腐質(zhì)霉屬（Humicola）、柄孢殼屬（Podospora）等；Ⅱ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是被孢霉屬（Mortierella）、粉褶蕈屬（Entoloma）、腐質(zhì)霉屬（Humicola）等；Ⅲ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是瘦臍菇屬（Rickenella）、雙擔(dān)菌屬（Geminibasidium）、被孢霉屬（Mortierella）等；Ⅳ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是被孢霉屬（Mortierella）、赤霉屬（Gibberella）、捷別爾達(dá)孢屬（Teberdinia）等；Ⅴ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是腐質(zhì)霉屬（Humicola）、被孢霉屬（Mortierella）等?？傮w來(lái)看，不同樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”不同，同種“屬”在不同樣地間的豐度不同，但差異不明顯，說(shuō)明不同樣地的太子參根際土壤的微生物真菌群落趨于一致。

如表4所示，在細(xì)菌“屬”水平，可能是測(cè)序原因（由于微生物種類繁多，加之受到測(cè)序讀長(zhǎng)的顯示，所以在實(shí)際分析過(guò)程中，并非所有的OTU代表序列都能獲得“屬”水平的分類學(xué)信息），在前20個(gè)優(yōu)勢(shì)屬中，只鑒定得到7種，它們?yōu)樗釛U菌（Gp1、Gp2、Gp3），羅河桿菌屬（Rhodanobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、纖線桿菌屬（Ktedonobacter）、勒氏菌屬（Gaiella）；將每個(gè)菌屬在不同樣地進(jìn)行比較可以看出，芽單胞菌屬（Gemmatimonas）在Ⅱ的含量多于其他樣地；羅河桿菌屬（Rhodanobacter）在Ⅲ的含量明顯多于其他樣地；酸桿菌（Gp1）在5個(gè)樣地的含量均較高，而酸桿菌（Gp2、Gp3）在Ⅳ的含量高于其他4個(gè)樣地；纖線桿菌屬（Ktedonobacter）在Ⅴ、Ⅰ的含量較高，在Ⅲ的含量較低。同種“屬”在不同樣地間的豐度不同，結(jié)果表明，5個(gè)樣地的微生物菌屬豐度存在差異性，說(shuō)明不同樣地太子參根際 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不同。

2.4 5個(gè)樣地太子參土壤化學(xué)性質(zhì)和酚酸含量分析

從表5看出，不同樣地太子參根際土壤化學(xué)性質(zhì)均存在差異性。太子參根際土壤偏酸性，pH值為4.8～5.3。在Ⅱ和Ⅴ2個(gè)樣地，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀含量均較高；在樣地Ⅲ中全磷、速效鉀含量最高，而有機(jī)質(zhì)、全鉀指標(biāo)與其他4個(gè)樣地相比含量較低。從表6得出，有效態(tài)微量元素在樣地Ⅲ中的含量均較低。其中：有效態(tài)錳在Ⅳ中含量最高，為23.14 mg·kg?1；有效態(tài)銅、有效態(tài)鐵在Ⅰ中含量最高，分別為4.18 mg·kg?1和151.94 mg·kg?1；有效態(tài)鋅在Ⅱ中含量最高，為13.19 mg·kg?1；其中有效態(tài)錳和有效態(tài)銅含量不同樣地差異顯著。表明不同樣地太子參根際土壤化學(xué)性質(zhì)存在差異性，說(shuō)明不同樣地太子參的種植會(huì)對(duì)太子參根際土壤的化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。

表 3 不同樣地太子參根際土壤真菌群落中前20種優(yōu)勢(shì)分類單元及其相對(duì)豐度Table 3 Top 20 dominant taxa and their relative abundance of fungi community in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

如表7、8所示，5個(gè)樣地太子參根系分泌物中均含有對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸和肉桂酸。其中，5個(gè)樣地中對(duì)香豆酸、安息香酸、丁香酸的總含量高于其他6種，肉桂酸的含量最低；丁香酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸、香蘭素在5個(gè)樣地中含量差異明顯?？傊环铀嵩诓煌瑯拥睾坎煌?，同一樣地的不同酚酸含量也存在差異性。說(shuō)明不同樣地太子參根系分泌物中酚酸種類相同，但含量會(huì)有 所差異。

2.5 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜微生物群落的探究中。以上研究表明：不同樣地太子參根際土壤的微生物菌屬分布及豐度差異顯著。為進(jìn)一步探究太子參根際微生態(tài)環(huán)境中微生物間的相互作用，本研究通過(guò)對(duì)差異菌屬兩兩間相關(guān)系數(shù)的計(jì)算，構(gòu)建共變化網(wǎng)絡(luò)（圖5），在真菌菌屬共變化網(wǎng)絡(luò)中，核心菌屬是捷別爾達(dá)孢屬（Teberdinia）、稻曲菌屬（Villosiclava）；在細(xì)菌的共變化網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中，核心菌屬是酸桿菌（Gp1、Gp3）和羅思河小桿菌屬（ Rhodanobacter）。

2.6 不同樣地太子參根際土壤微生物群落分布、土壤化學(xué)性質(zhì)及酚酸典范對(duì)應(yīng)分析

選取真菌的前3優(yōu)勢(shì)“門”-子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）和細(xì)菌的前4優(yōu)勢(shì)“門”-變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi），探討太子參根際土壤微生物豐度、根際土壤化學(xué)性質(zhì)及酚酸類物質(zhì)的典范對(duì)應(yīng)分析。如圖6-A、6-B所示，子囊菌門（Ascomycota）豐度與根際土壤大部分化學(xué)性質(zhì)、酚酸物質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系，與全磷、有效磷、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；而擔(dān)子菌門（Basidiomycota）豐度與大部分根際土壤化學(xué)性質(zhì)、酚酸物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與全磷、有效磷、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸呈正相關(guān)關(guān)系；接合菌門（Zygomycota）豐度與有效態(tài)銅、銨態(tài)氮、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、安息香酸呈正相關(guān)關(guān)系。圖6-C和6-D所示，放線菌門（Actinobacteria）豐度與速效鉀、全磷呈正相關(guān)關(guān)系，與酚酸物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；綠彎菌門（Chloroflexi）豐度與有效態(tài)鐵、對(duì)羥基苯甲酸呈正相關(guān)關(guān)系；變形菌門（Proteobacteria）豐度與銨態(tài)氮、有效磷、水楊酸呈正相關(guān)關(guān)系；酸桿菌門（Acidobacteria）豐度與根際土壤大部分化學(xué)性質(zhì)和酚酸物質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系，與全磷、有效磷、速效鉀、水楊酸呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。典范對(duì)應(yīng)分析表明太子根際土壤微生物群落分布受土壤理化性質(zhì)及酚酸類物質(zhì)的影響，說(shuō)明太子參土壤化學(xué)性質(zhì)及酚酸類物質(zhì)參與了根際微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的演變。

表 4 不同樣地太子參根際土壤細(xì)菌群落中前20種優(yōu)勢(shì)分類單元及其相對(duì)豐度Table 4 Top 20 dominant taxa and their relative abundance of bacteria community in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

表 5 不同樣地太子參根際土壤化學(xué)性質(zhì)Table 5 Chemical properties of rhizosphere soil from P. heterophylla habitats

表 6 不同樣地太子參根際土壤中有效態(tài)微量元素的含量Table 6 Content of available trace elements in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

表 7 不同樣地太子參根系分泌物酚酸的含量Table 7 Content of phenolic acids in root exudates of P. heterophylla at different locations

表 8 不同樣地太子參根系分泌物酚酸的含量Table 8 Content of phenolic acids in root exudates of P. heterophylla at different locations

圖 5 太子參根際差異微生物共變化網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 Co-occurrent network of microorganisms in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

圖 6 太子參根際土壤微生物群落分布、化學(xué)性質(zhì)和酚酸物質(zhì)的典范對(duì)應(yīng)分析Fig. 6 Canonical correspondence analysis on community distribution, chemical properties and phenolic acids in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

3 討論與結(jié)論

許多作物都存在連作效應(yīng)，尤以藥用植物表現(xiàn)最為突出，約占70.00%的以根部入藥的藥用植物存在不同程度的連作效應(yīng)，如太子參、澤瀉、三七、地黃等均存在嚴(yán)重的連作效應(yīng)問(wèn)題[16]。根際是土壤與植物根系之間緊密結(jié)合的環(huán)境，同時(shí)也是土壤-根系-微生物三者緊密結(jié)合、相互影響的場(chǎng)所[17]。鄒立思[10]等研究發(fā)現(xiàn)，太子參根際土壤微生物以細(xì)菌為主，還包含放線菌及真菌，這與本研究不同樣地太子參根際土壤的細(xì)菌數(shù)目明顯多于真菌結(jié)論一致。5個(gè)樣地的優(yōu)勢(shì)屬中的鐮刀菌屬（Fusarium）和赤霉屬（Gibberella）為常見(jiàn)的真菌致病菌。在藥用植物中，鐮刀菌成為主要的致病菌對(duì)象[18]。薛彩云等[19]研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬對(duì)二年生的五味子造成嚴(yán)重的莖基腐病病害，會(huì)在生產(chǎn)上造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。劉西莉等[20]研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌可引起嚴(yán)重的根腐病，直接影響麻黃的產(chǎn)量和品質(zhì)。Chen等[21]、Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，連作太子參根際土壤隨著連作年限增加，致病菌鐮刀菌數(shù)量增高，酚酸混合物可促進(jìn)鐮刀菌菌絲和孢子生長(zhǎng)。說(shuō)明鐮刀菌屬是引起太子參連作效應(yīng)的一類致病真菌。如表3所示，5個(gè)地區(qū)均含有鐮刀菌屬，但每個(gè)地區(qū)的鐮刀菌豐度有所差別，其中Ⅳ樣地的鐮刀菌豐度最高，其后依次為Ⅱ、Ⅰ、Ⅴ，Ⅲ樣地的鐮刀菌豐度最低，且每個(gè)樣地的鐮刀菌含量與其根際土壤其他微生物物種數(shù)呈反比，暗示鐮刀菌影響太子參根際土壤其他微生物物種數(shù)組成，響應(yīng)太子參的連作效應(yīng)。赤霉菌屬是玉米、水稻和小麥等禾本科植株的主要致病真菌，可導(dǎo)致作物嚴(yán)重減產(chǎn)[23]。目前太子參的連作過(guò)程中關(guān)于赤霉菌的研究較少，對(duì)引起太子參連作效應(yīng)的致病真菌應(yīng)引起關(guān)注。被孢霉屬（Mortierella）和腐質(zhì)霉屬（Humicola）是一種常見(jiàn)的腐生真菌。稻曲菌屬（Villosiclava）可侵染水稻小穗引起穗部病害[24]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5個(gè)樣地的差異性真菌屬為毛殼菌屬（Chaetomium）、捷 別 爾 達(dá) 孢 屬（Teberdinia）、Sordariales_unclassified、田頭菇屬（Agrocybe）、稻曲菌屬（Villosiclava）等。而在真菌菌屬共變化網(wǎng)絡(luò)中，核心菌屬是捷別爾達(dá)孢屬（Teberdinia）、稻曲菌屬（Villosiclava）。說(shuō)明差異菌屬在太子參根際微生態(tài)環(huán)境中起到一定的作用。5個(gè)樣地太子參根際土壤細(xì)菌群落在“屬”分類水平的前20種優(yōu)勢(shì)菌屬中，酸桿菌門的酸桿菌（Gp1、Gp2、Gp3），可以降解植物殘?bào)w多聚物，參與鐵循環(huán)和光合作用等，是具有促進(jìn)作用潛力的一類菌[25]。芽單孢菌屬（Gemmatimonas）參與固氮過(guò)程[26]。

植物根際微生物的群落構(gòu)建受到根系分泌物、土壤化學(xué)性質(zhì)等的影響[27]?；ㄉ捣置谖镏械谋郊姿嵩黾恿烁H土壤中伯克霍氏菌的相對(duì)豐度[28]。Wu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，太子參根系分泌物酚酸和有機(jī)酸等物質(zhì)對(duì)于其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有重要影響。本研究中5個(gè)樣地的太子參根際土壤微生物群落分布與根際土壤化學(xué)性質(zhì)、根系分泌物酚酸類物質(zhì)都有一定的相關(guān)性。有研究表明，黏質(zhì)沙雷氏菌可對(duì)太子參組培苗產(chǎn)生致害作用，導(dǎo)致根部腐爛和葉片枯萎[30]；太子參根系分泌物酚酸類物質(zhì)促進(jìn)微生物病原菌黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）生長(zhǎng)并使其成為優(yōu)勢(shì)菌[31?32]。而此次的測(cè)序結(jié)果中并未檢測(cè)到黏質(zhì)沙雷氏菌，這可能與不同地區(qū)的太子參根際土壤微生物存在差異有關(guān)。

綜上所述，植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性對(duì)植物的健康生長(zhǎng)有著極其重要的作用。本文通過(guò)研究柘榮縣5個(gè)樣地的太子參根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，發(fā)現(xiàn)不同樣地微生物群落結(jié)構(gòu)及組成豐度存在共性及差異性，暗示真菌致病菌鐮刀菌屬等影響太子參根際土壤微生物結(jié)構(gòu)組成及豐度多樣性。同時(shí)，太子參根際土壤微生物群落分布受到根際土壤化學(xué)性質(zhì)及根系分泌物酚酸類物質(zhì)的影響，暗示太子參土壤連作效應(yīng)很可能歸因于根系分泌物參與調(diào)控根際微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性演變，導(dǎo)致病原菌增多。所得結(jié)果為后續(xù)連作太子參根際土壤微生物群落分布、太子參連作效應(yīng)及相關(guān)根際致病菌的研究奠定了一定的工作基礎(chǔ)。