簇生稻穗發(fā)育及細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)分析

陳麗萍，蔣家煥，鄭燕梅，朱永生，王穎姮，林 強，謝鴻光，羅 曦，蔡秋華，謝華安 ，張建福

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建 福州 350018；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南雜交水稻種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點實驗室/福州（國家）水稻改良分中心/福建省作物分子育種工程實驗室/福建省水稻分子育種重點實驗室/福建省作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種省部共建國家重點實驗室培育基地/雜交水稻國家重點實驗室華南研究基地，福建 福州 350003；3. 水稻國家工程實驗室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】水稻是全世界重要糧食作物之一，也是我國最主要的糧食作物。穗是水稻產(chǎn)量形成的關(guān)鍵部位，穗型是影響水稻產(chǎn)量的一個重要因素，穗粒數(shù)的增加可以直接提高水稻的產(chǎn)量，目前通過常規(guī)途徑來增加穗粒數(shù)和穗密度實現(xiàn)增產(chǎn)已有較大難度。簇生穗（Clustered Spikelets）是水稻穗部形成2～3粒籽粒簇生的一種異?，F(xiàn)象，是水稻穗部的一種突變，有雜交變異和理化誘變等多種來源途徑，將簇生稻（也稱為復(fù)粒稻、麥粒稻）的簇生性狀轉(zhuǎn)育到正常單粒稻中，能有效縮短穗長并增加其穗粒數(shù)和著穗密度，對創(chuàng)造簇生稻新材料及提高產(chǎn)量等都具有重要意義[1?2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】簇生穗通常表現(xiàn)為枝梗頂端同時著生2～3粒穎花，大多數(shù)為3粒，形狀呈“W”形排列[3]。美國科學(xué)家Jodon在1957年發(fā)現(xiàn)首個水稻主穗軸和一次枝梗頂端都著生2～3朵穎花的簇生穗突變體，此后又有多位學(xué)者對不同的水稻簇生穗材料進(jìn)行了遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)水稻簇生穗突變體主要歸結(jié)于兩類，一類是多數(shù)枝梗中下部位簇生2個或2個以上小穗，稱為枝梗小穗簇生突變體，定位于4號染色體上；另一類為枝梗頂端著生2～3粒籽粒的簇生穗突變體，定位于6號染色體上[4?8]。Jiang等[9]首次從一個9311簇生穗突變體中成功克隆了位于6號染色體上的簇生穗調(diào)控基因sped1-D，其編碼一個三角狀五肽重復(fù)蛋白，可能通過阻斷RFL、Lax、WOX3等穗發(fā)育相關(guān)基因來縮短小花花梗和次級枝梗長度，并影響水稻小花花粉育性。同年，Guo等[10]也在9311遺傳背景下克隆了位于4號染色體上的簇生穗調(diào)控基因CL4，其編碼一個假定的細(xì)胞色素P450蛋白CYP724B1，該蛋白參與油菜素內(nèi)酯的生物合成。Sped1-D和CL-4得以成功克隆與研究，使得我們對簇生穗基因的生物學(xué)功能有了初步的了解，但其具體的分子機理仍有待進(jìn)一步闡明。植物中常常存在一個基因可影響許多性狀的發(fā)育而引起多方面表型效應(yīng)的現(xiàn)象，并且單個性狀的發(fā)育也通常是由多個基因控制的一系列生化過程連續(xù)作用的結(jié)果。前人研究表明，水稻中常常存在多個基因共同對穗發(fā)育的某個節(jié)點起調(diào)控作用最終導(dǎo)致穗發(fā)育的異常：如OsMFT1通過抑制FZP和5個SEPALLATA-like基因的表達(dá)致使分枝分生組織向小穗分生組織的轉(zhuǎn)變被延遲，從而產(chǎn)生更多的穗分枝[11]；Gnp4通過與LAX相互作用一起參與調(diào)控水稻分生組織，從而控制水稻二次枝梗側(cè)穎花形成及籽粒長度[12]。GL3.1通過影響細(xì)胞周期蛋白CycT1;3的磷酸化來控制水稻籽粒大小和產(chǎn)量[13]。細(xì)胞的發(fā)育需要通過精確、保守的機制對細(xì)胞周期進(jìn)行適當(dāng)?shù)膱?zhí)行和調(diào)控。真核生物細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控的分子機制是高度保守的,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子包括細(xì)胞周期蛋白（cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑（CDK inhibitors，CKIs）、成視網(wǎng)膜瘤蛋白（Retinoblastomas，Rbs）同系物和E2F轉(zhuǎn)錄因子等在細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損失修復(fù)等有關(guān)腫瘤形成的過程中有重要作用[14]。動物中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子失調(diào)常常導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，形成腫瘤。植物中細(xì)胞周期相關(guān)基因發(fā)生變異也常常導(dǎo)致其小穗、花器官發(fā)育異常。多花小穗突變體mfs1小穗分生組織轉(zhuǎn)變到花分生組織延遲，出現(xiàn)一個額外的類穎殼器官和一個伸長的小穗軸，且護(hù)穎和內(nèi)稃退化[15]。KRP1在水稻種子形成過程中從細(xì)胞有絲分裂周期脫離時發(fā)揮重要作用，其過表達(dá)植株種子灌漿明顯降低[16]。細(xì)胞周期蛋白OsSDS的過表達(dá)突變體在營養(yǎng)生長階段與野生型沒有顯著差異，但在生殖生長階段卻表現(xiàn)出雌雄配子均無活性、小穗完全不育[17]?！颈狙芯壳腥朦c】相比于水稻正常穗在枝梗上的單粒著生，簇生穗是穗部的一種突變，屬于發(fā)育缺陷，目前2個已克隆的簇生穗基因都是獨立進(jìn)行研究的，具體的調(diào)控機理仍不夠清楚。在前期工作中，我們以簇生穗品種內(nèi)江P164和單粒稻品種9311為親本構(gòu)建定位群體，最終將簇生穗基因精細(xì)定位到6號染色體上，定位區(qū)間內(nèi)包含已克隆的簇生穗基因sped1-D的等位基因但變異位點不同，命名為OsCl-6[18]，簇生穗突變體主要表現(xiàn)為二次枝梗的數(shù)目及長度異常，目前已有不少基因被報道與二次枝梗發(fā)育及二次枝梗向花器官轉(zhuǎn)變相關(guān)，但這些基因與簇生穗調(diào)控基因是否有直接關(guān)聯(lián)也尚未見深入的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在通過qRT-PCR技術(shù)對簇生穗材料內(nèi)江P164與單粒稻材料9311中枝梗發(fā)育相關(guān)基因及細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，探索簇生稻中穗發(fā)育相關(guān)基因及細(xì)胞周期相關(guān)基因在表達(dá)量上的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步深入對簇生穗基因的了解，為高產(chǎn)水稻品種選育提 供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

內(nèi)江P164（Oryza sativa. Ssp. indica）為來自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的一個簇生穗自然突變體。9311（Oryza sativa. Ssp. indica）為江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的單粒稻秈稻品種。分別在2019年正季種植于福建福州水稻所網(wǎng)室大田及2019年晚季種植于南靖基地大田。

1.2 水稻RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

水稻幼穗RNA提取采用天漠公司的ZR Plant RNA MiniPrep試劑盒。

1.3 qRT-PCR分析

qRT-PCR使用Vazyme的SYBR qPCR Master Mix，20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)混合液的組分與體積分別為：ROX Mix （2 x） 10 μL，PCR上下游引物（10 μmol·L?1）各0.6 μL，cDNA 2 μL，剩余體積用ddH2O補足。以水稻actin基因（Os03g0718150）作為內(nèi)參。qRTPCR得到的結(jié)果用相對定量的方法進(jìn)行分析[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 9311和內(nèi)江P164的農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

為了更好地了解內(nèi)江P164和9311的生長特性，對2019年晚季種植于南靖基地大田的簇生穗品種內(nèi)江P164和單粒稻9311的農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于9311，簇生穗品種內(nèi)江P164的株高和穗長大于9311，一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)和著粒數(shù)密度均低于9311，內(nèi)江P164的穗發(fā)育異常主要體現(xiàn)在二次枝梗長度縮短且數(shù)目減少（表1）。

表 1 9311和內(nèi)江P164的農(nóng)藝性狀比較Table 1 Agronomic characteristics of 9311 and Neijiang P164

2.2 幼穗發(fā)育不同時期OsCl-6的表達(dá)量分析

目前國際上公認(rèn)的水稻花序發(fā)育過程分為9個時期，在第1～5時期表達(dá)的基因主要影響花序的枝梗發(fā)育，而在第6～9時期表達(dá)的基因則影響穎花的形成[20]。從內(nèi)江P164的簇生穗形態(tài)上判斷，一次枝梗發(fā)育并無明顯異常，而二次枝梗則較短且較少。為了更清楚地檢測OsCl-6在穗發(fā)育不同時期的表達(dá)情況，分別取種植于網(wǎng)室大田的9311和內(nèi)江P164的如下幾個時期的幼穗：（1）spl1：主穗軸形成期，莖頂端還未見白須尖，（2）spl2-4：一次枝梗原基形成和伸長期，莖頂端略見些許毛茸茸，幼穗長度小于2 mm，（3）spl5-6，莖頂端明顯毛茸茸，幼穗長度約2～5 mm，（4）spl7-8：幼穗長度為1～2 cm，分別進(jìn)行RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR分析。qRT-PCR結(jié)果顯示，簇生穗基因OsCl-6在幼穗發(fā)育過程中表達(dá)量先有一個逐步上調(diào)的過程，在二次枝梗形成和分化的第5～6階段表達(dá)量達(dá)到最高，隨后表達(dá)量開始下調(diào)，且在所取的幼穗發(fā)育4個時期中的表達(dá)量在內(nèi)江P164中均顯著高于93-11（圖1），這預(yù)示簇生稻內(nèi)江P164的二次枝梗發(fā)育異常很可能直接受OsCl-6的表達(dá)量調(diào)控，OsCl-6的表達(dá)量顯著上調(diào)或直接抑制其二次枝梗發(fā)育。

圖 1 幼穗發(fā)育不同時期OsCl-6的表達(dá)量分析Fig. 1 Expression of OsCl-6 in young panicles at developmental stages

2.3 細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)分析

由于內(nèi)江P164和9311的穗形態(tài)差異主要體現(xiàn)在二次枝梗的長度和數(shù)目上，內(nèi)江P164的二次枝?？s短且數(shù)目明顯較少，植物器官異常發(fā)育常常與細(xì)胞周期調(diào)控直接相關(guān)，為研究內(nèi)江P164和9311中細(xì)胞周期關(guān)鍵基因的表達(dá)是否存在顯著差異，本研究選取內(nèi)江P164和9311的2～5 mm幼穗樣品對28個細(xì)胞周期關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果顯示，28個細(xì)胞周期關(guān)鍵基因中大部分基因的表達(dá)量都較高，這也預(yù)示著在幼穗發(fā)育時期中這些基因是高度活躍的，CAK1A、CDKA1、CDKC;2、CDKE和CDKF;1等細(xì)胞周期依賴激酶（CDKs）在9311中的表達(dá)高于內(nèi)江P164，而CYCB2;1、CycB2;2和CycB1;1等B類細(xì)胞周期蛋白（cyclin）則在內(nèi)江P164中的表達(dá)高于9311（圖2）。CDKs是一組具有特征性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，協(xié)同周期蛋白cyclin，通過對絲氨酸/蘇氨酸蛋白的化學(xué)作用驅(qū)動細(xì)胞周期，能在所有真核細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞周期的整個過程，其活性既受與之結(jié)合的cyclin的調(diào)節(jié)，又和特異的磷酸化和去磷酸化有關(guān)[14]。內(nèi)江P164的簇生穗表型或受CDKs的表達(dá)量顯著下調(diào)及B類cyclin的表達(dá)量顯著上調(diào)直接調(diào)控。

圖 2 幼穗中細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig. 2 Expressions of cell cycle-related genes in young panicle

2.4 穗發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)分析

植物中常常存在一個基因可影響許多性狀的發(fā)育而引起多方面表型效應(yīng)的現(xiàn)象，并且單個性狀的發(fā)育也通常是由多個基因控制的一系列生化過程連續(xù)作用的結(jié)果。水稻中常常存在多個基因共同對穗發(fā)育的某個節(jié)點起調(diào)控作用最終導(dǎo)致穗發(fā)育的異常[11?13]。Jiang等[9]通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)，相比于野生型9311，簇生穗突變體sped1-D中穗發(fā)育相關(guān)基因Lax1、OsWOX3、RFL、Rf-1L等的表達(dá)量均顯著下調(diào)。為進(jìn)一步探索簇生穗基因OsCl-6和水稻中其他穗發(fā)育尤其是枝梗發(fā)育相關(guān)基因的關(guān)系，我們分別對9311和內(nèi)江P164的2～5 mm幼穗中與穗發(fā)育尤其是枝梗發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR分析。分析結(jié)果表明，OsCl-6、MFS1、Rf-1L、OsREL2和CL-4等基因在幼穗中的表達(dá)量較高，而OsWOX3、RFL、Lax、Lax2、FZP和MFS2等基因則在幼穗中表達(dá)量較低，且OsWOX3、Lax1、FZP和MFS2在簇生穗材料內(nèi)江P164的表達(dá)量顯著低于9311，MFS1在簇生穗材料內(nèi)江P164的表達(dá)量顯著高于9311，而Rf-1L、OsREL2、RFL和Lax2的表達(dá)量在9311和內(nèi)江P164無顯著差異（圖3）。因此OsCl-6或和上述表達(dá)量有顯著差異的基因直接或間接的協(xié)同對水稻的枝梗發(fā)育起調(diào)節(jié)作用。

圖 3 幼穗枝梗發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig. 3 Expressions of panicle branch development-related genes in young panicle

3 討論與結(jié)論

近些年來，以常規(guī)途徑直接增加穗粒數(shù)和穗密度來實現(xiàn)增產(chǎn)難度越來越大。通過聚合簇生性狀或調(diào)控穗特異表達(dá)基因來增加穗粒數(shù)和穗密度不失為一個可以嘗試的手段。育種家也一直在摸索利用簇生稻資源來創(chuàng)造水稻新品種。李經(jīng)勇等[21]將稗草總DNA通過花粉管通道法導(dǎo)入水稻恢復(fù)系渝恢1351并從中選取優(yōu)質(zhì)后代再結(jié)合傳統(tǒng)雜交手段創(chuàng)制了一批具有簇生穗表型是優(yōu)良恢復(fù)系。利用具有頂小穗3粒簇生的常規(guī)中秈稻突變體和常規(guī)早秈稻雜交、后代復(fù)交、并經(jīng)世代選育，俞法明等[22]獲得較對照增產(chǎn)的頂小穗2～5粒簇生的常規(guī)早秈稻新種質(zhì)。但目前在簇生稻品種的選育上還沒有明顯的進(jìn)展與突破。一方面與大部分簇生穗種質(zhì)資源常常伴隨結(jié)實率偏低有關(guān)，另一方面有關(guān)簇生穗形成的分子機理還尚未闡明，無法在生產(chǎn)中提供相應(yīng)的指導(dǎo)。目前已發(fā)現(xiàn)的簇生穗突變體多數(shù)還伴隨枝梗和穎殼發(fā)育異常、育性降低等其他表型。我們推測簇生穗調(diào)控基因很可能和其他穗發(fā)育相關(guān)基因直接或間接關(guān)聯(lián)協(xié)同調(diào)控水稻的穗發(fā)育，目前已分別有具體的研究表明水稻中根、分蘗、籽粒形狀、花粉育性等因某個細(xì)胞周期相關(guān)基因異常而直接影響導(dǎo)致對應(yīng)的組織發(fā)育異常，而穗發(fā)育處于上述組織發(fā)育的中間階段，因而推斷枝梗發(fā)育極有可能也直接受到細(xì)胞周期的影響。目前水稻中還沒有關(guān)于枝梗發(fā)育與細(xì)胞周期直接相關(guān)的研究。Fouad利用硅酸鹽分析方法，對水稻9個不同稻屬的CDKA編碼基因及其對應(yīng)蛋白進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)其中的Brachyantha具有一個修飾的SUC/CKS （CDC2/cyclin依賴性激酶調(diào)節(jié)亞基抑制因子）結(jié)合基序，并提出觀察到的這個變異可以通過傳統(tǒng)育種或分子方法來操縱細(xì)胞分裂和栽培水稻品種的生長[23]。本研究探索通過對穗發(fā)育尤其是枝梗發(fā)育相關(guān)基因及細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)

行分析，內(nèi)江P164中CDKs的表達(dá)量顯著下調(diào)而B類cyclin的表達(dá)量顯著上調(diào)，CDKs能在所有真核細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞周期的整個過程，其活性既受到和它結(jié)合的cyclin的調(diào)節(jié)，又與特異的磷酸化和去磷酸化有關(guān)，因而推測內(nèi)江P164的簇生穗表型很有可能也與磷酸化相關(guān)。后續(xù)可以進(jìn)一步通過磷酸化途徑入手，深入對這些差異基因深入研究，驗證其在簇生穗形成中的具體功能，將有助于進(jìn)一步闡明簇生穗的形成分子機理，為簇生稻遺傳育種提供參考。