肝臟活檢標本纖維化評估方法的研究進展

趙川 陳虹

·綜 述·

肝臟活檢標本纖維化評估方法的研究進展

趙川 陳虹

肝纖維化（hepatic fibrosis）是肝臟對抗各種慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，其實質(zhì)是肝組織中細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積。長期慢性刺激使纖維化持續(xù)發(fā)展，最終可發(fā)展至肝硬化甚至肝癌，大大增加患者死亡率。病理診斷目前仍然是診斷肝纖維化的金標準，對肝纖維化進行確切地評估不僅有助于掌握疾病嚴重程度，而且對判斷疾病預(yù)后、評價治療效果都有不可替代的作用。目前臨床常用的肝纖維化分期的評估系統(tǒng)各具優(yōu)缺點，隨著非線性光學(xué)顯微技術(shù)發(fā)展，新的肝纖維化定量分析方法逐漸成熟。本篇文章概述了肝臟活檢標本纖維化評估方法研究的新進展。

一、肝纖維化機制

肝纖維化是肝臟各種慢性損傷因素導(dǎo)致的一種共同的病理結(jié)局，這些慢性損傷因素包括病毒、肝內(nèi)膽汁淤積、代謝異常、自身免疫失調(diào)、藥物及毒物等。肝纖維化實質(zhì)是細胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積，使正常的肝臟結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，進而造成肝臟功能障礙及肝臟血流動力學(xué)異常。

（一）細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生

關(guān)于肝纖維化過程中ECM的細胞來源爭論已久，最近的研究表明慢性肝損傷中過度積累的ECM來源于多種細胞群，并認為肝臟纖維化細胞（肌成纖維細胞）在這一過程中起關(guān)鍵作用［1］。肌成纖維細胞（myofibroblasts，MFs）來源于肝星狀細胞（HSCs）、骨髓來源的肌成纖維細胞、匯管區(qū)成纖維細胞、膽管上皮細胞及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial mesenchymal transitions，EMT）［2，3］。不同病因所致纖維化具有不同的發(fā)病機制，因而參與纖維化的主要細胞也不盡相同。盡管有多種細胞成分可分化為MFs，但起核心作用的細胞仍然是HSCs［4］。

研究發(fā)現(xiàn)HSCs起源于中胚層來源的多能間充質(zhì)干細胞（MMPC）［5］。正常情況下HSCs處于靜止狀態(tài)，細胞中含有大量的維生素A和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）。當肝臟受到慢性損傷因素刺激時，凋亡的肝細胞、庫普弗細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、浸潤的炎細胞、淋巴細胞等分別通過不同機制激活HSCs［1］?；罨腍SCs釋放出維生素A及GFAP，同時具有了促纖維化、促炎性反應(yīng)、收縮性、驅(qū)化性、增殖性等特點；另外在各種因子刺激下HSCs可以向肌成纖維細胞分化，進而合成并分泌大量ECM參與肝纖維化的形成。

（二）肝纖維化中的細胞外基質(zhì)

1.細胞外基質(zhì)對纖維化的正反饋調(diào)節(jié)

肝纖維化過程中產(chǎn)生的ECM的主要成分是纖維狀膠原蛋白，這些膠原蛋白使ECM成為基底膜樣而取代了正常的低密度基質(zhì)［6］。ECM還包括透明質(zhì)酸、纖連蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白等成分。ECM成分能夠直接或間接與肝臟細胞相互作用，正反饋調(diào)節(jié)肝纖維化過程，包括：HSCs的激活、肝細胞微絨毛缺失、肝竇內(nèi)皮細胞窗孔消失、釋放細胞因子等，使肝臟在慢性損傷持續(xù)刺激下發(fā)生進行性纖維化［7］。

正常情況下異常的細胞外基質(zhì)可被逐漸降解，這一過程依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）之間的平衡。MMPs能促進ECM的降解，相反，TIMPs不僅抑制MMP對ECM的降解作用，并且抑制HSCs凋亡，促進ECM不斷積累［8］。當刺激因素持續(xù)存在時，ECM大量積累并且重塑異常，破壞肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，使MMPs活性降低而TIMPs活性增加，結(jié)果ECM降解減少，大量沉積于肝組織內(nèi)。

2.細胞外基質(zhì)對肝臟結(jié)構(gòu)的影響

在正常的肝組織中，細胞外基質(zhì)存在于肝竇內(nèi)皮下的Disse間隙中并形成基底膜樣結(jié)構(gòu)，正常內(nèi)皮下基質(zhì)對維持肝臟內(nèi)各種細胞的不同功能至關(guān)重要。隨著肝纖維化的發(fā)展，ECM中膠原和非膠原成分可增加至正常的3～5倍，并由低密度型膠原轉(zhuǎn)變?yōu)楦呙芏刃湍z原，使肝竇毛細血管化、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、假小葉形成，造成肝臟內(nèi)血流動力紊亂和肝細胞物質(zhì)交換障礙［9］。

二、組織病理學(xué)評估方法進展

肝纖維化是慢性肝臟疾病的一個共同的病理改變。肝纖維化的程度是判斷慢性肝臟疾病進展程度和評價疾病治療效果最好的指標［10］。因此準確、客觀地分析肝臟纖維化程度無論對科學(xué)研究還是對臨床治療都至關(guān)重要［11］。雖然目前肝纖維化的非創(chuàng)傷性評估方法在臨床應(yīng)用增加，包括血清生化診斷、影像學(xué)診斷、非創(chuàng)傷性綜合指標的診斷模型等，但這些方法僅能定性評估是否存在肝纖維化，或區(qū)分輕度肝纖維化與重度肝纖維化，但不能準確的區(qū)別肝纖維化的各個階段。肝臟活檢仍然是監(jiān)測肝纖維化進展的金標準［12］。肝臟活檢組織纖維化評估方法經(jīng)過不斷改進，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。隨著光學(xué)顯微技術(shù)的發(fā)展，新的顯微技術(shù)能夠?qū)Ω谓M織中膠原纖維精確測量，為纖維化評估提供了新的方法。

（一）起始階段

上世紀60年代末有學(xué)者開始對慢性肝病進展程度進行分期［13］，1977年該分期方法進行了改進［14］。1968年首次發(fā)表的分期方法將慢性肝炎分為慢性持續(xù)性和慢性進展性兩種［13］。Popper and Schaffner肯定了肝臟活檢在慢性肝炎的診斷和預(yù)后判斷中的價值，并強調(diào)炎癥分布區(qū)域的描述，包括：慢性小葉、慢性匯管區(qū)和慢性匯管周圍炎癥等，但后者沒能體現(xiàn)出病因的重要性［16］。在這一階段并沒有形成系統(tǒng)性的肝纖維化評估方法。

（二）發(fā)展階段

隨著對慢性肝臟疾病的病因?qū)W、發(fā)病機制、病理變化、臨床表現(xiàn)等的全面認識，對疾病進展程度的分期更加合理，主要考慮到病因、肝組織的炎癥分級和纖維化分期三個因素。1981～1996年間，在原有病理評分方法的基礎(chǔ)上進行改進，先后提出了五個慢性肝臟疾病嚴重程度的病理評分系統(tǒng)：HAI評分系統(tǒng)［17］、Scheuer評分系統(tǒng)［18］、Ishak評分系統(tǒng)［19］、Metavir評分系統(tǒng)［20］和Ishak改進的HAI系統(tǒng)［21］。目前廣泛應(yīng)用于臨床。

以上評估方法雖然能夠較為系統(tǒng)、客觀的對纖維化程度作出半定量評估，但這些評分系統(tǒng)基本上都是以慢性病毒性肝炎為模型建立的，應(yīng)用于其他病因所致肝纖維化的評估時有不同程度的局限性［22］。此外，上述方法是基于對肝組織病理切片的免疫組化染色結(jié)果的閱讀，由病理專家給出評分。因此除了肝臟穿刺活檢固有的創(chuàng)傷性之外，傳統(tǒng)的纖維化評估方法還存在讀片者本身及讀片者之間的主觀性差異、染色劑濃度影響及光漂白等缺點，使客觀性、精確性、可重復(fù)性等受到影響。

（三）新進展階段

近年來有文獻報道應(yīng)用非線性光學(xué)顯微技術(shù)——二次諧波產(chǎn)生（SHG）和雙光子激發(fā)熒光（TPEF），結(jié)合計算機分析系統(tǒng)對肝活檢標本進行全自動纖維化評估的方法［23］。這種方法基于肝組織自身熒光的存在，不需染料染色，克服了傳統(tǒng)評估方法的很多缺點，能夠更加準確、客觀、定量、快速地對纖維化做出評估。

1.SHG/TPEF光學(xué)原理簡介

外部可調(diào)節(jié)的鎖模藍色激光共聚焦圖像系統(tǒng)是SHG/ TPEF的技術(shù)基礎(chǔ)，如圖1所示。激光首先通過脈沖壓縮器（PC）和聲光調(diào)節(jié)器（AOM），分別用來減少激光的全速分散和能量衰變。然后激光經(jīng)分色鏡（DM），被折射的部分激光通過物鏡到達非染色組織切片。組織中產(chǎn)生的TPEF位置指示信號被該物鏡收集，并通過一個分色鏡和一個500～550 nm波長的帶通濾波片后被光電倍增管（PMT）記錄。SHG信號被一個聚光器收集，并在被PTM檢測前經(jīng)450nm波長的電通濾波片濾過。由于這種非線性光學(xué)過程內(nèi)在的光學(xué)選擇特性，不需使用共聚焦顯微鏡的針孔作用［24］。

2.組織標本圖像的采集、處理優(yōu)勢

利用膠原的內(nèi)在特性，SHG顯微技術(shù)可以更加敏感地獲取非染色肝組織中膠原的定量信息。其優(yōu)點是能夠檢測到膠原結(jié)構(gòu)及其在纖維化早期的重塑過程［25］。另有研究發(fā)現(xiàn)，抗纖維化治療后肝組織在傳統(tǒng)組織評分中未能發(fā)現(xiàn)明顯變化而SHG顯微技術(shù)則能檢測到膠原減少［26］。不僅如此，SHG顯微成像能夠描述組織切片中膠原的三維空間分布，可以精確描述膠原蛋白在不同區(qū)域的增加強度［27］。將SHG顯微技術(shù)與計算機系統(tǒng)相結(jié)合，可將組織圖像轉(zhuǎn)化為數(shù)字化信息，實現(xiàn)膠原的全自動定量分析。

圖1

在激光下肝細胞內(nèi)分子（NADPH、黃素等）產(chǎn)生的大量熒光可被TPEF記錄。肝損傷過程中由于肝細胞變性、壞死而使細胞核、胞漿、脂滴聚集區(qū)域缺乏熒光顆粒，在TPEF中顯示為暗區(qū)，因而TPEF適用于肝細胞形態(tài)的觀察［28］。

目前已有商品化的SHG/TPEF顯微儀器，可方便快速地采集組織信息并將組織圖像信息轉(zhuǎn)化成數(shù)字圖像與計算機相結(jié)合，直接分析組織切片中膠原和壞死性炎癥的情況［29］，對肝纖維化程度進行評估。新的纖維化評估方法具有以下優(yōu)點：不需要組織染色和人工閱讀病理切片，避免了染色劑、觀察者的影響而具有更好的可重復(fù)性；可根據(jù)不同病因所致纖維化模型調(diào)整分析參數(shù)、建立模型，使評估更加標準化；可將成像系統(tǒng)與計算機相連結(jié)合，實現(xiàn)全自動定量評估；可以獲得膠原的三維空間結(jié)構(gòu)及分布信息，使評估更加精確、連續(xù)。

三、小結(jié)與展望

肝纖維化是不同病因所致慢性肝臟疾病的一個共同的病理過程，其實質(zhì)是肝組織中ECM的過度積累。為判斷疾病嚴重程度、評價治療效果、判斷預(yù)后，必須準確、客觀地評估肝臟纖維化情況。傳統(tǒng)的評估方法各具優(yōu)缺點，SHG/TPEF顯微技術(shù)不僅克服了傳統(tǒng)方法的部分缺點，而且具有更多優(yōu)勢。

目前已有SHG/TPEF用于臨床慢性乙型肝炎肝纖維化的病理評估模型的報道，可用于乙肝肝纖維化評估，相信該技術(shù)會很快應(yīng)用于其他病因所致肝纖維化的評估中。另外由于SHG/TPEP的靈敏性、連續(xù)性等特點，不僅可用于疾病診斷、分期，還使治療效果的檢測更準確，并有助于新的抗纖維化藥物研發(fā)和優(yōu)化病人個體化治療方案。

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2014-12-19）

（本文編輯：魏清）

100039 武警總醫(yī)院移植研究所

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