HBx與p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中的表達

王宏利 沙小瑩 郭雅玲 張新昀 羅改云

HBx與p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中的表達

王宏利 沙小瑩 郭雅玲 張新昀 羅改云

目的 探討HBVx蛋白（HBV x protein，HBx）與p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中表達的相關(guān)性。方法 通過乙肝相關(guān)性肝細胞癌組織的病理標本和轉(zhuǎn)染乙肝病毒（HBV）x基因的人肝細胞株兩部分試驗，分別檢測HBx、Smyd2、p300/CBP的表達，分析HBx、Smyd2、p300/CBP之間表達的相關(guān)性。結(jié)果 較之癌旁組織，肝癌組織中HBx的表達顯著增高，Smyd2、p300/CBP的表達則顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，（均P＜0.05）。且經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，HBx與Smyd2和p300/CBP在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中的表達具有較高的一致性（P＜0.05）。結(jié)論 HBx與p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中的表達之間有一定相關(guān)性。

乙肝相關(guān)性肝細胞癌；HBV X蛋白；p300CBP；Smad2；相關(guān)性

乙型肝炎病毒（HBV）會導(dǎo)致原發(fā)性肝細胞癌（HCC）的發(fā)生，對人體的危害極大［1］。其中，HBV的x基因編碼的HBVx蛋白參與了HCC發(fā)生，并具有十分重要的作用。p53是一種細胞凋亡調(diào)節(jié)基因，可以誘導(dǎo)DNA損傷的細胞發(fā)生凋亡。從而達到清除基因損傷細胞，阻止細胞轉(zhuǎn)化的目的［2］。p53在突變之后可以發(fā)揮出抗凋亡的作用，并在HCC中呈現(xiàn)出不同的表達。本研究用免疫組織化學(xué)的方法分別檢測了HCC組織及癌旁組織中HBx、Smyd2、p300/CBP的表達。探討HBVx蛋白（HBV x protein，HBx）與p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中表達的相關(guān)性?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

資料和方法

一、一般資料

收集肝癌及癌旁組織標本各40份，所有病例臨床和病理資料均完整，標本經(jīng)10%Formalin固定，石蠟包埋，并予以5μm連續(xù)切片。研究獲得醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)部門同意。

二、方法

體外實驗：構(gòu)建表達乙肝病毒（HBV）X基因的人肝細胞株，用未表達乙肝病毒（HBV）X基因的人肝細胞株作為陰性對照。應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法分別檢測HCC組織及癌旁組織中HBx、Smyd2、p300/ CBP的表達。用到的試劑有：抗p300CBP抗體（購自：晶美公司）、抗Smad2抗體（購自：Santa Cruz公司）、S-P試劑盒、DAB試劑盒（均購自：北京中山生物技術(shù)開發(fā)公司）。

三、判定標準

參照蔣成英等［3］的判斷標準，染色強度判斷：（1）0分：細胞不著色；（2）1分：淺黃色；（3）2分：棕黃色；（4）3分：棕褐色。陽性細胞計數(shù)：隨機選擇5個高倍視野，（1）0分：染色細胞小于5%；（2）1分：染色細胞為5%～24%；（3）2分：染色細胞為25%～49%；（4）3分：染色細胞為50%～74%；（5）4分：染色細胞大于75%。陽性細胞計數(shù)乘以染色強度得分，（1）陰性：0分；（2）弱陽性（+）：1～4分；（3）中度陽性（++）：5～8分；（4）強陽性（+++）：9～12分。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

研究所得數(shù)據(jù)均輸入Excel表格，建立數(shù)據(jù)庫，并使用SPSS公司推出的SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，研究所得計數(shù)資料均進行χ2檢驗，計量資料均進行t檢驗，并以進行表示。并對P值進行檢測，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

經(jīng)統(tǒng)計和比較，兩組各基因蛋白表達情況存在差異，且經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，（均P＜0.05）。且經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，HBx與Smyd2和p300/CBP在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中的表達具有較高的一致性（P＜0.05）。具體結(jié)果如表1所示。

表1 兩組各基因蛋白表達情況分析

表1 兩組各基因蛋白表達情況分析

觀察項目癌旁組織肝癌組織P 05 Smyd2 15.2297±0.8871 5.7027±0.6330＜0.05 p300/CBP 12.9769±0.9274 5.2635±1.0047＜0. HBx 0.7281±0.2131 1.5591±0.2672＜0. 05

討 論

HBV在世界范圍內(nèi)傳播，估計全球感染者及攜帶者達3.5億之多，其中約有1.3億人在我國［4］。

HBV作為常見的人類易感病原體，和多種肝臟疾病之間存在十分密切的聯(lián)系，例如肝炎和肝纖維化以及肝癌等。尤其在乙肝相關(guān)性HCC相關(guān)發(fā)生機制的研究過程中，經(jīng)常會涉及到各種致癌基因和生長因子以及腫瘤抑制因子還有相關(guān)信號通路等［5］。研究發(fā)現(xiàn)，HBx可以通過與肝細胞核內(nèi)外各種蛋白分子的相互作用對肝細胞造成各種影響，例如影響癌基因、抑癌基因的表達及活性，最終導(dǎo)致肝細胞的癌變［6］。

p53是一種抗癌基因，因編碼一種分子質(zhì)量為53k Da的蛋白質(zhì)而得名。p53蛋白質(zhì)能夠遏制細胞的增殖，具有遏制癌細胞的作用，可以作為重要的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控150多種基因的表達［7，8］。p53是機體內(nèi)最重要一種抑癌因子，當p53正常發(fā)揮功能時，它參與細胞分裂的調(diào)控。而當某些原因例如基因突變使得p53蛋白功能出現(xiàn)異常時，則會引起失控性細胞分裂最終有可能導(dǎo)致癌癥發(fā)生［9］。HBx與P53相互作用關(guān)系一直是乙肝相關(guān)性肝細胞癌研究中的熱點問題，陳釗宏等［10］通過IHG特殊免疫組織化學(xué)法檢測手術(shù)切除經(jīng)病理證實為原發(fā)性肝癌的HCC組織及正常肝組織中AFB1-DNA加合物的暴露情況，并按照是否同時存在HBV暴露進行分組，并對各組間p53蛋白的表達情況利用免疫組化S-P法檢測進行比較，并檢測其p53基因第7外顯子249密碼子的突變情況。最終結(jié)論認為，HCC的發(fā)生過程中AFB1暴露與p53第7外顯子249位點的突變密切關(guān)系相關(guān)。如果同時存在乙肝病毒暴露的協(xié)同作用的情況下突變率更高，p53基因的突變可能是造成HCC中p53蛋白高表達的重要因素之一。近年來，隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，人們將組蛋白的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于p53的研究，發(fā)現(xiàn)可能多種類型的翻譯后修飾作用調(diào)節(jié)了p53的穩(wěn)定，從而影響了P53的多種功能。這種蛋白修飾對于P53功能的影響與肝癌的形成以及乙肝病毒在這種修飾中的作用是目前研究的發(fā)展趨勢。Smyd2是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，可以對p53蛋白進行修飾。Smyd2蛋白的修飾位點為Lys370。Smyd2蛋白通過在Lys370位點對p53蛋白進行甲基化修飾，可以有效的對p53的轉(zhuǎn)錄激活功能予以抑制［11］。因此，同組蛋白一樣，Lys殘基的甲基化修飾同樣會對p53的轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)生影響，對其產(chǎn)生激活或者抑制。這也是少數(shù)的在組蛋白以外的蛋白中發(fā)現(xiàn)的，通過甲基化可以對其蛋白活性進行調(diào)節(jié)的實驗［12］。乙?；瘯53依賴的細胞凋亡反應(yīng)產(chǎn)生十分重大的影響，并對積極的影響到p53的穩(wěn)定性。如果DNA出現(xiàn)損傷，CBP并會聯(lián)合p300一起進行作用，保持p53的穩(wěn)定性，并顯著提高其與特異DNA序列進行結(jié)合的能力［13］。另外，CBP還可以和p300共同作用，促使MDM2的乙?；?，從而有效降低MDM2對p53的泛素化作用，促進p53穩(wěn)定性的提高［14，15］。本研究最終結(jié)果顯示，較之癌旁組織，肝癌組織中HBx的表達顯著增高，Smyd2、p300/ CBP的表達則顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，（均P＜0.05）。提示Smyd2、p300/CBP的低表達可能促進了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。且研究結(jié)果還顯示，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，HBx與Smyd2和p300/CBP在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中的表達具有較高的一致性。即說明，Smyd2、p300/CBP的低表達與HBx的表達之間存在一定的聯(lián)系，關(guān)于具體的影響機制，值得在今后的研究中予以進一步分析探討。

綜上所述，HBx與p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中表達之間具有一定的相關(guān)性，可以用于對乙肝與肝癌發(fā)病關(guān)系的研究，以更好的探索肝癌的防治措施，指導(dǎo)臨床治療。

1 洪清琦.HBx在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達與臨床意義及其調(diào)控組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3表達的機制研究.中山大學(xué)，2010.

2 何云，牛子長，梁紅霞，等.HBVX蛋白及血管生成素-2與乙型肝炎相關(guān)性肝細胞癌的關(guān)系研究.傳染病信息，2012，25：276-277，291.

3 蔣成英，陳麗，戴廣海.肝細胞癌中survivinEGFR和VEGF的表達及臨床意義.臨床腫瘤學(xué)雜志，2010，15：779-783.

4 龔玲，景釗，鄒長林，等.乙肝相關(guān)性肝癌組織中p27、p53及增殖細胞核抗原的表達.中國基層醫(yī)藥，2007，14：96-98.

5 王蘭天.乙肝病毒相關(guān)性肝細胞癌發(fā)生機制.國際病毒學(xué)雜志，2010，17：178-183.

6 吳武佳，陳李影慧，宋晨源，等.CCRK在肝細胞癌組織中的表達及其與HBx的關(guān)系.軍事醫(yī)學(xué)，2013，37：110-113.

7 崔利園，張釗瑞，費洪榮，等.乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白促進HepG2細胞遷移并調(diào)節(jié)β-catenin表達.中國病理生理雜志，2012，28：1128-1131.

8 孫長宇.乙肝病毒X基因在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中作用及機制.鄭州大學(xué)，2011.

9 Dai Y，Cros MP，Pontoizeau C，et al.Dow nregulation of transcription factor E4F1 in hepatocarcinoma cells：HBV-dependent effects on autophagy，proliferation and metabolism. Carcinogenesis，2014，35：635-50.

10 陳釗宏，黎樂群，齊魯楠，等.乙肝病毒/黃曲霉毒素B1雙暴露相關(guān)性肝細胞癌的p53基因249位點突變與p53蛋白表達的關(guān)系.中國癌癥防治雜志，2011，03：1-5.

11 祝玲玲，朱平安，蔡蘭蘭，等.乙肝病毒HBx-d382與HBx-d431突變體特異性抗體檢測方法的建立及臨床應(yīng)用.中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2014，280：262-264.

12 Feitelson M A，Bonamassa B，Arzumanyan A.The roles of hepatitis B virus-encoded X protein in virus replication and the pathogenesis of chronic liver disease.Expert Opin Ther Targets，2014，18：293-306.

13 Kim JH，Alam MM，Park DB，et al.The Effect of Metformin Treatment on CRBP-I Level and Cancer Development in the Liver of HBx Transgenic Mice.Korean J Physiol Pharmacol，2013，17：455-461.

14 閃明海，胡愛麗，楊琴，等.寧夏地區(qū)乙型肝炎病毒基因BCP區(qū)A1762T/G1764A突變與肝細胞癌的相關(guān)性.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，36：148-150.

15 劉海鷗.乙型肝炎病毒大S蛋白（LHBs）和X蛋白（HBx）對肝癌發(fā)生的轉(zhuǎn)移的調(diào)控及其功能的研究［D］.復(fù)旦大學(xué)，2012.

2014-09-16）

（本文編輯：馮珉）

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目 項目編號：2014K11-01-01-15

710061 西安市第八醫(yī)院肝病6科