SDF-1/CXCR4激活ERK和PI3K/AKT通路介導(dǎo)髓核致炎根性疼痛

魏 明，高鳳嬌，楊 琳，孫來(lái)保，鄒學(xué)農(nóng)，黃文起

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510080；2.番禺區(qū)中心醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 511400；3.廣東省骨科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510700）

根性疼痛是指脊神經(jīng)的背根和/或背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）受到刺激而引起的疼痛。它是腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）最常見的臨床癥狀［1］。LDH 導(dǎo)致根性疼痛的機(jī)制有機(jī)械壓迫學(xué)說(shuō)、炎癥免疫學(xué)說(shuō)等，其中炎癥免疫學(xué)說(shuō)越來(lái)越受到重視。突出的髓核組織可引起化學(xué)刺激，并誘發(fā)炎癥免疫反應(yīng)產(chǎn)生IL-6、IL-1β、TNF-α 等細(xì)胞因子，刺激傳入神經(jīng)纖維，導(dǎo)致痛覺的外周敏化；同時(shí)這些因子在脊髓中表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致痛覺的中樞敏化［2］。但目前LDH 導(dǎo)致根性疼痛的確切機(jī)制并不完全清楚?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell derived factor-1，SDF-1），因最初發(fā)現(xiàn)由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌而得名，它又稱趨化因子CXC 配體12（chemokine CXC ligand 12，CXCL12）。趨化因子CXC 受體4（CXCR4）是SDF-1的特異性受體。SDF-1 與CXCR4 廣泛地表達(dá)于多種細(xì)胞和組織中，并在炎癥、腫瘤等疾病中起著至關(guān)重要的作用［3］。文獻(xiàn)報(bào)道，在完全弗式佐劑誘導(dǎo)炎性痛模型［4］、癌痛模型［5-6］、術(shù)后急性切口痛模型［7］中，阻斷SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路可以減輕模型的痛覺過(guò)敏，這提示SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路參與了多種類型疼痛的發(fā)生機(jī)制。研究表明，SDF-1/CXCR4 是通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）通路發(fā)揮作用：大鼠足跖切口急性疼痛模型中，SDF-1/CXCR4可激活ERK 通路，但不激活PI3K/AKT 通路［7］；蜜蜂毒注射痛敏預(yù)點(diǎn)燃模型中，SDF-1/CXCR4 同時(shí)激活ERK 和PI3K/AKT 通路［8］?？梢娫诓煌奶弁茨Ｐ椭校琒DF-1/CXCR4 對(duì)ERK 和PI3K/AKT 通路的作用是不一樣的。目前，在髓核致炎根性疼痛的發(fā)病機(jī)制中，SDF-1/CXCR4 是否參與，其是否通過(guò)激活ERK 和PI3K/AKT 通路發(fā)揮作用尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在探討SDF-1/CXCR4 通路在髓核致炎根性痛大鼠模型中的作用及其機(jī)制，為闡明LDH 引起根性疼痛的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

SDF-1、GAPDH、Tubulin、GFAP、Neun、CD11b一抗，HRP 標(biāo)記的IgG 二抗，對(duì)照IgG（abcam，美國(guó)）；CXCR4、磷酸化ERK（Phospho-ERK，pERK）、磷酸化AKT（Phospho-AKT，pAKT）一抗（Affinity，中國(guó)）；FITC 熒光二抗（Invitrogen，美國(guó)）；SDF-1 中和抗體（US Biological，美國(guó)）；AMD3100、U0126、LY294002（MCE，中國(guó)）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma，美國(guó)）；Von Frey 纖維絲（Stoelting，美國(guó)）；Biorad ChemiDoc MP 凝膠成像系統(tǒng)（Biorad，美國(guó)）；倒置熒光顯微鏡（Leica，美國(guó)）；PE-10導(dǎo)管（Smiths medical，英國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠（200～280 g）由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK（粵）2016-0029。分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度55%～65%，維持大鼠12 h/12 h 晝夜節(jié)律。本研究所有實(shí)驗(yàn)操作均符合中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)要求并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用原則進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

本研究分為三個(gè)部分。實(shí)驗(yàn)一：26 只大鼠隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組。檢測(cè)每組6 只大鼠手術(shù)前后的機(jī)械撤足閾值（paw withdrawl threshold，PWT）變化；假手術(shù)組術(shù)后第14 天和模型組術(shù)后第3、7、14 天各3 只大鼠術(shù)后脊髓SDF-1、CXCR4、pERK，pAKT 表達(dá)變化；模型組2 只大鼠脊髓行免疫熒光化學(xué)染色將SDF-1、CXCR4分別與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD11b和神經(jīng)元標(biāo)志蛋白Neun 共染。實(shí)驗(yàn)二：54 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、溶劑組、AMD3100 組、SDF-1 中和抗體組、對(duì)照IgG 組，分別行假手術(shù)、建模、建模后連續(xù)5 d 鞘內(nèi)注射50 g/L DMSO 10 uL、CXCR4 抑制劑AMD3100 10 μg、SDF-1 中和抗體5 μg，對(duì)照組Ig G 5μg（給藥劑量參考文獻(xiàn)報(bào)道［9-10］和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。檢測(cè)每組6只大鼠手術(shù)前后的PWT變化；每組3只大鼠檢測(cè)脊髓中pERK和pAKT表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)三：18 只大鼠隨機(jī)分為溶劑組、U0126組、LY294002 組，分別建模后連續(xù)5 d 鞘內(nèi)注射50 g/L DMSO 10 μL、MEK 的抑制劑U0126 10 μg，PI3K抑制劑LY294002 10 μg（給藥劑量參考文獻(xiàn)報(bào)道［9-11］和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。檢測(cè)每組6 只大鼠手術(shù)前后的PWT變化。

1.4 鞘內(nèi)置管

在實(shí)驗(yàn)二和實(shí)驗(yàn)三中，在假手術(shù)和建模前，參照Liu等［12］描述的方法對(duì)大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠（50 mg/kg，ip.），切開皮膚暴露L3～4 椎間隙，將PE-10 導(dǎo)管向頭側(cè)置入約2 cm 到達(dá)腰膨大水平。將導(dǎo)管經(jīng)皮下隧道固定至大鼠頭部?jī)啥g，關(guān)閉切口。術(shù)后剔除手術(shù)損傷致下肢運(yùn)動(dòng)功能障礙的大鼠，并于鞘內(nèi)注射2%利多卡因10 μL 以驗(yàn)證導(dǎo)管位置，剔除導(dǎo)管位置錯(cuò)誤的大鼠。鞘內(nèi)置管手術(shù)后5 d再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 模型建立

參考文獻(xiàn)［13］建立動(dòng)物模型。用戊巴比妥鈉麻醉大鼠（50 mg/kg，ip.），在髂嵴附近做正中縱切口，頓性分離左側(cè)椎旁肌，切除行L5 和L6 關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)和L5 椎板，暴露L5 DRG。取尾椎2 個(gè)節(jié)段自體髓核。模型組將獲取的髓核組織覆蓋于左側(cè)L5 DRG。假手術(shù)組僅行L5 DRG 的暴露，取尾部髓核組織但不將其置于L5 DRG。逐層縫合組織關(guān)閉切口。

1.6 PWT的測(cè)定

將大鼠放置在箱底為金屬網(wǎng)的透明有機(jī)玻璃箱中至少15 min，使其充分適應(yīng)測(cè)試環(huán)境并處于安靜狀態(tài)。采用Up-Down 方法［14］，用Von Frey 纖維絲（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14 g）對(duì)大鼠后肢左腳足心部進(jìn)行機(jī)械性刺激，每次刺激持續(xù)時(shí)間為6～8 s。大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或撤離刺激時(shí)出現(xiàn)撤足或舔足現(xiàn)象，則為陽(yáng)性反應(yīng)。以2.041g刺激強(qiáng)度為初始刺激強(qiáng)度，若撤足反應(yīng)為陽(yáng)性，則選擇相鄰遞減的刺激強(qiáng)度給予刺激；若撤足反應(yīng)為陰性，則選擇相鄰遞增的刺激強(qiáng)度給予刺激。以第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)的前一點(diǎn)為起點(diǎn)連續(xù)6 次的刺激結(jié)果。使用計(jì)算機(jī)程序根據(jù)測(cè)試計(jì)算出PWT。

1.7 Western Blot實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一術(shù)后第3、7、14天，每組3只大鼠用于檢測(cè)蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二中術(shù)后第7天每組3只大鼠檢測(cè)pERK、pAKT 表達(dá)變化。戊巴比妥鈉（70 mg/kg，ip.）深麻醉大鼠后斷頭處死，在冰面上迅速取出大鼠L4-L6節(jié)段脊髓。加入蛋白裂解液，勻漿和裂解30 min，裂解后的樣品4°C 14 000g離心10 min，取上清液，行BCA 法蛋白定量。配平并變性蛋白。SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%BSA 中封閉1 h，隨后加入一抗孵育，4°C 過(guò)夜。漂洗后加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1h。洗膜后加入ECL 發(fā)光液顯色曝光。使用Biorad ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯色拍照，最后采用Image J 進(jìn)行條帶的灰度分析。

1.8 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

用2%戊巴比妥（60～80 mg/kg）深度麻醉大鼠后，經(jīng)主動(dòng)脈快速灌注200 mL 生理鹽水后，繼而40 g/L 多聚甲醛灌注固定30 min。將L4～6 脊髓節(jié)段取出，40 g/L 多聚甲醛后固定24 h，然后依次用10%、20% 和30% 蔗糖溶液梯度脫水3 d。做連續(xù)冠狀冰凍切片（20 μm/片），切片漂洗、封閉后加入一抗，4 ℃孵育12 h，漂洗后加入熒光二抗，室溫孵育2 h。漂洗、裱片、封片，加入抗熒光淬滅劑后在倒置熒光顯微鏡下觀察攝片。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)SPSS 20.0（SPSS Inc.，USA）進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。PWT 數(shù)據(jù)應(yīng)用重復(fù)測(cè)量的方差分析檢驗(yàn)差異。對(duì)Western Blot 數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓核自體移植導(dǎo)致大鼠機(jī)械痛敏，脊髓中SDF-1、CXCR4、pERK、pAKT表達(dá)上調(diào)

PWT 測(cè)試結(jié)果顯示（圖1A）：經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，模型組與假手術(shù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54.55，P＜0.001；F=703.9，P＜0.001）；進(jìn)一步采用Sidak 法作兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組術(shù)后第1、3、7、14、21 天PWT 較術(shù)前降低（P均＜0.001），且與假手組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.001）。Western blot 結(jié)果顯示（圖2A-D）：經(jīng)單因素方差分析，模型組SDF-1、CXCR4、pERK、pAKT 蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=15.98，P=0.045；F=26.37，P=0.035；F=82.87，P=0.008；F=65.04，P=0.010），進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)模型組SDF-1、CXCR4、pERK，pAKT蛋白術(shù)后比假手術(shù)組表達(dá)上調(diào)（術(shù)后第3天P=0.029，P=0.016，P=0.006，P＜0.001；術(shù)后第7 天P=0.035，P=0.022，P=0.003，P=0.015；術(shù)后第14 天P=0.031，P=0.021，P=0.011，P=0.001）。免疫熒光雙染結(jié)果顯示，SDF-1 主要在神經(jīng)元分布（圖3），而CXCR4 主要在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分布（圖4）。

2.2 鞘內(nèi)注射SDF-1 中和性抗體或CXCR4 抑制劑AMD3100 減輕髓核自體移植引起的痛覺過(guò)敏，并下調(diào)脊髓中pERK、pAKT表達(dá)水平

PWT 測(cè)試結(jié)果顯示（圖1B）：經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=188.9，P＜0.001；F=76.21，P＜0.001）；進(jìn)一步采用Sidak法作兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組、溶劑組和對(duì)照Ig G 組PWT 在術(shù)后第1、3、5、7 天比假手組降低（P均＜0.001）；AMD3100組和SDF-1中和抗體組的PWT比模型組（第3 天：P＜0.001vs.AMD3100 組或SDF-1 中和抗體組；第5 天：P＜0.001vs.AMD3100 組，P=0.008vs.SDF-1 中和抗體組；第7 天：P＜0.001vs.AMD3100組，P=0.004vs.SDF-1中和抗體組），溶劑組（第3、5天：P均＜0.001vs.AMD3100 組或SDF-1 中和抗體組；第7 天：P＜0.001vs.AMD3100 組，P=0.004vs.SDF-1 中和抗體組）或?qū)φ誌g G 組（第3、5、7 天：P均＜0.001vs.AMD3100 組或SDF-1 中和抗體組）提高；與假手術(shù)組比較，AMD3100 組和SDF-1 中和抗體組的PWT 仍下降（P均＜0.001）。Western blot 結(jié)果顯示（圖2E，F(xiàn)）：經(jīng)單因素方差分析，各組間pERK（F=29.91，P＜0.001）和pAKT（F=38.37，P＜0.001）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組和溶劑組中pERK 和pAKT 比假手術(shù)組表達(dá)上調(diào)（P均＜0.001）；與模型組或溶劑組比較，AMD3100 組pERK（P=0.001vs.模型組，P=0.003vs.溶劑組）和pAKT（P＜0.001vs.模型組，P=0.001vs.溶劑組）表達(dá)下調(diào)；與模型組或溶劑組比較，SDF-1中和抗體組的pERK（P=0.002vs.模型組，P=0.005vs.溶劑組）和pAKT（P均＜0.001）表達(dá)下調(diào)；與假手術(shù)組比較，AMD3100 組和SDF-1 中和抗體組的pERK（P=0.048，P=0.029）和pAKT（P=0.014，P=0.040）表達(dá)仍上調(diào)。

圖1 各組大鼠PWT變化情況Fig.1 PWT for rats in different groups

圖2 各組大鼠脊髓蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expression in spinal cord of rats in different groups

2.3 鞘內(nèi)注射MEK 的抑制劑U0126 或PI3K 抑制劑LY294002減輕髓核自體移植引起的痛覺過(guò)敏

PWT 測(cè)試結(jié)果顯示（圖1C）：經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=88.58，P＜0.001；F=15.7，P＜0.001）；進(jìn)一步采用Sidak 法作兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與溶劑組相比U0126 組和LY294002組PWT 在術(shù)后升高（術(shù)后第3 天：P=0.04，P=0.001；術(shù)后第5 天P=0.009，P=0.04；術(shù)后第7 天：P=0.008，P=0.005）。

3 討論

SDF-1/CXCR4 通路被證明參與多種類型疼痛的形成和發(fā)展。有研究結(jié)果顯示，大鼠單次足底或鞘內(nèi)注射SDF-1 后可出現(xiàn)持續(xù)的痛覺過(guò)敏，給予CXCR4 的siRNA 或AMD 3100 可減輕痛敏［15］；在神經(jīng)病理性疼痛的模型如坐骨神經(jīng)分支選擇切斷大鼠模型或坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠模型中，其DRG 及脊髓中SDF-1 和CXCR4 的表達(dá)均發(fā)生上調(diào)，在鞘內(nèi)注射SDF-1 中和抗體或AMD3100 可減輕模型的痛敏［16-17］；另外，在完全弗式佐劑誘導(dǎo)炎性痛模型［4］、癌痛模型［5-6］、術(shù)后急性切口痛模型［7］、再缺血再灌注疼痛模型［18］，化療藥引起的疼痛［10-19］等模型中，均有報(bào)道顯示SDF-1/CXCR4 參與了痛敏的形成和發(fā)展。但目前文獻(xiàn)中尚無(wú)SDF-1/CXCR4在髓核致炎根性疼痛模型中作用的相關(guān)報(bào)道。在本研究中，鞘內(nèi)給予SDF-1 中和抗體或CXCR4抑制劑AMD3100 阻斷SDF-1/CXC4 信號(hào)通路可減輕髓核自體移植引起的痛覺過(guò)敏，說(shuō)明在髓核致炎根性疼痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，SDF-1/CXCR4 也參與其中。

圖3 SDF-1與星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元雙染結(jié)果Fig.3 Co-localization of SDF-1 and astrocyte，microglia or neuron in the spinal cord

圖4 CXCR4與星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元雙染結(jié)果Fig.4 Co-localization of CXCR4 and astrocyte，microglia or neuron in the spinal cord

神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用參與了疼痛的中樞敏化機(jī)制［20-21］。在本研究中，免疫熒光雙染顯示SDF-1 主要分布在神經(jīng)元，而CXCR4 主要分布在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。這與Liu等［15］報(bào)道的在脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛模型中的研究結(jié)果一致。這提示，在髓核致炎根性痛大鼠模型中，神經(jīng)元分泌的SDF-1 可能作用于自身或膠質(zhì)細(xì)胞的CXCR4，從而參與疼痛的形成和發(fā)展。

有文獻(xiàn)報(bào)道，SDF-1/CXCR4 通過(guò)其下游的ERT 和PI3K/AKT 通路發(fā)揮其生物學(xué)作用。在不同的疼痛模型中，SDF-1/CXCR4 激活的下游通路有所差異。大鼠足跖切口急性疼痛模型中，預(yù)先鞘內(nèi)注射CXCR4 拮抗劑AMD3100 可以抑制ERK1/2 的激活，卻不能抑制AKT 的激活［7］；脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛模型和BV 注射痛敏預(yù)點(diǎn)燃模型中，ERK 和PI3K/AKT 通路則均被激活［8］。本研究證明，在髓核自體移植根性疼痛模型中，SDF-1/CXCR4同時(shí)激活了ERK和PI3K/AKT通路而介導(dǎo)痛覺過(guò)敏的產(chǎn)生。

細(xì)胞信號(hào)通路中，存在著廣泛的環(huán)形反饋環(huán)路和交互作用。體外實(shí)驗(yàn)中，給予LY294002 或GDC0941（PI3K 抑制劑）可以抑制ERK 的激活；而給予PD98059（MEK 抑制劑），可以抑制AKT 激活［22-23］；AKT 也可以在B-Raf 水平上調(diào)節(jié)Raf/MEK/ERK通路［24］。即抑制ERK或PI3K/ATK其中一條通路，另外一條通路也可被抑制。這說(shuō)明ERK和PI3K/AKT 通路間存在交互作用。然而，在本研究的實(shí)驗(yàn)二中，并未檢測(cè)U0126 組和LY294002 組中脊髓pERK 和pAKT 的表達(dá)情況，因此并不能顯示在髓核致炎根性疼痛大鼠模型中ERK 和PI3K/AKT通路之間相互作用的情況，它們之間的關(guān)系有待進(jìn)一步的研究探討。

綜上所述，本研究證明髓核致炎根性疼痛的大鼠模型中，SDF-1/CXCR4 通過(guò)激活ERK 和PI3K/AKT 通路介導(dǎo)疼痛的發(fā)生與發(fā)展。這為闡明LDH導(dǎo)致根性疼痛的發(fā)生機(jī)制提供了新的證據(jù)。