梁旭陽(yáng),徐 萍,呂勝祥,張志梅,王 璐,張樹賢,任 玲,馬艷芹
(1.南京醫(yī)科大學(xué)連云港臨床學(xué)院//連云港市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇連云港 222061;2.南京醫(yī)科大學(xué)上海松江臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科,上海 201600)
作為一種世界上每年新增死亡人數(shù)排在第七位的惡性腫瘤[1],食管癌最常見的病理類型是鱗狀細(xì)胞癌,且其早期診斷困難,預(yù)后較差。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)食管癌發(fā)生、發(fā)展的病理生理機(jī)制尚未完全闡明,因此,深入了解食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的病理生理機(jī)制,為食管癌早診、早治尋找有效措施,對(duì)降低食管癌患者的病死率、延長(zhǎng)其生存時(shí)間及提高其生活質(zhì)量具有重要臨床意義。具有多種調(diào)節(jié)功能的Toll 樣受體(TLR)/髓樣分化因子88(MyD88)信號(hào)傳導(dǎo)通路,在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)揮了重要作用[2]。MyD88 是TLR 信號(hào)通路中關(guān)鍵的中轉(zhuǎn)蛋白,通過其承前啟后地傳導(dǎo)信號(hào)作用,刺激了下游促炎癥因子和和抗凋亡因子的表達(dá),最終激活了免疫系統(tǒng)的先天免疫應(yīng)答反應(yīng),進(jìn)而影響了腫瘤患者臨床發(fā)展與預(yù)后[3-5]。感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等均與MyD88 有較為明確的關(guān)系,且MyD88 被認(rèn)為是干預(yù)治療這些疾病的重要靶點(diǎn)。作為DNA 多聚酶輔助蛋白的增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclea rantigen,PCNA),存在于細(xì)胞核中,在DNA的合成中起重要作用。作為判定細(xì)胞增殖活性的內(nèi)源性標(biāo)記物,PCNA 反映了腫瘤的惡性傾向。有研究顯示抑制TLR4 的表達(dá),可以抑制癌細(xì)胞的PCNA 表達(dá),進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[6]。作為血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的刺激因子,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種可以直接激活血管生成,并使血管通透性增加的蛋白質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)TLR4 可以通過調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá)水平而影響腫瘤血管的生成,但是其具體機(jī)制尚不清楚[7]。故本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)TLR4、MyD88及PCNA 與VEGF在食管鱗癌組織中的蛋白表達(dá)水平,分析探討MyD88 與TLR4 及其PCNA、VEGF 的相互關(guān)系及與食管鱗癌患者臨床生物學(xué)特性的關(guān)系。
1.1.1 臨床資料 收集我院病理樣本庫(kù)中,2011年01 月至2014 年09 月的食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床數(shù)據(jù)及所有石蠟標(biāo)本72 例,其中癌組織為A 組,對(duì)照組B 組為正常組織(經(jīng)病理證實(shí)無鱗癌細(xì)胞的癌組織緣外6 cm 組織)。72 例患者在行食管癌根治術(shù)前均未行放射和化學(xué)治療,且均由具有高級(jí)職稱的病理醫(yī)師確診為食管鱗癌。所有患者年齡均在43~74 歲之間,平均年齡為62 歲,其中有62 例男性,10 例女性;患者鱗癌組織分化情況:14 例高分化,48 例高中及中分化,10 例中低及低分化鱗癌;患者癌組織浸潤(rùn)深度情況:12 例局限在黏膜及黏膜下層,14 例浸潤(rùn)至固有肌層,46 例浸潤(rùn)至外膜及鄰近結(jié)構(gòu);患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:26 例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,46例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。臨床分期(以2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)制訂的食管癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)第7 版為依據(jù))情況:其中有8例患者屬于臨床分期Ⅰ期,21例屬于臨床Ⅱa期,24例屬于臨床Ⅱb期,11例屬于Ⅲa 期、3 例屬于Ⅲb 期、4 例屬于Ⅲc 期、只有1 例屬于Ⅳ期。本研究為回顧性研究,研究開始前已通過倫理委員會(huì)審批。
1.1.2 主要試劑 我們的MyD88 多克隆抗體、PCNA 單克隆抗體、VEGF 單克隆抗均屬于兔抗人抗體,且均購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司;EnVision 免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司。
文章采用免疫組化EnVision 二步法。首先制作連續(xù)石蠟切片,其厚度為4 μm;在溫度設(shè)置為70 ℃的恒溫烤箱中加熱3 min;在二甲苯和梯度酒精中進(jìn)行脫蠟與水化,然后在高壓鍋中應(yīng)用檸檬酸緩沖修復(fù)液進(jìn)行抗原熱修復(fù)(修復(fù)液濃度0.01 mol/L、pH6.0),冷卻至室溫;應(yīng)用濃度為3%的H2O2孵育,10 min 后應(yīng)用PBS 洗滌,再滴加一抗(一抗稀釋比:TLR4 為1:200、MyD88 為1:300、PCNA 為1:200、VEGF為1:200);在4 ℃恒溫環(huán)境下過夜后,再滴加二抗;室溫孵育15 min 后,滴加DAB 溶液進(jìn)行顯色,用蘇木素進(jìn)行復(fù)染;最后進(jìn)行分化,脫水,透明,中性樹膠封片等操作。陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性癌組織切片,陰性對(duì)照中用PBS溶液代替一抗即可。
所有染色后的組織切片,在雙盲條件下,由我院兩位病理科醫(yī)生進(jìn)行判讀。根據(jù)食管鱗狀細(xì)胞,在高倍顯微鏡下隨機(jī)選擇不少于1000 個(gè)定位明確(TLR4蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)、MyD88定位于細(xì)胞漿、PCNA 定位于細(xì)胞核、VEGF 定位于細(xì)胞漿)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒的的鱗癌細(xì)胞,按照染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:無色計(jì)為0 分,淡黃色計(jì)為1 分,棕黃色計(jì)為2 分,棕褐色計(jì)為3 分;陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤10.0%計(jì)為0 分,11.0%~25.0%計(jì)為1 分,26.0%~50.0%計(jì)為2 分,51.0%~75.0%計(jì)為3 分,≥76.0%計(jì)為4 分。總積分為上述兩項(xiàng)評(píng)分的和,陽(yáng)性表達(dá)定義為總積分≥5分。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為SPSS 19.0 版本,采用百分比表示計(jì)數(shù)資料,應(yīng)用卡方檢驗(yàn)或Fisher′s 確切概率法來進(jìn)行組間比較;TLR4、MyD88、PCNA、VEGF在食管鱗癌組織中的蛋白表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)關(guān)系的分析,采用逐步Logistic 回歸分析,相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析。以α=0.05 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
我們的之前研究[8]顯示TLR4 蛋白表達(dá)主要定位在食管鱗癌細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜中,而細(xì)胞核中幾乎不表達(dá),陽(yáng)性細(xì)胞主要呈棕黃色至棕褐色,癌旁正常組織中較少見染色陽(yáng)性細(xì)胞,提示在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中TLR4 蛋白呈高平表達(dá)(圖1AB)。統(tǒng)計(jì)分析顯示在食管鱗癌和癌旁正常組織中,TLR4 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.7% vs 29.17%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。
圖1 TLR4在食管鱗癌組織和癌旁組織中的蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of TLR4 in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues
MyD88 蛋白表達(dá)主要定位于食管鱗癌細(xì)胞的胞漿中,陽(yáng)性細(xì)胞呈淡黃色至棕黃色,癌旁正常組織中較少見染色陽(yáng)性細(xì)胞,說明食管鱗癌細(xì)胞中MyD88蛋白呈過度表達(dá)(圖2A-B)。統(tǒng)計(jì)分析顯示,MyD88 蛋白表達(dá)在食管鱗癌和癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.44%vs22.22%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)。
圖2 MyD88在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.2 Protein expression of MyD88 in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues
PCNA 蛋白表達(dá)定位于食管鱗癌細(xì)胞核中,陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色至棕褐色,較少陽(yáng)性染色細(xì)胞出現(xiàn)在癌旁正常組織中,說明食管鱗癌細(xì)胞中PCNA 蛋白呈高表達(dá)(圖3A、B)。本研究顯示食管鱗癌和癌旁正常組織中,PCNA 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率分別為43.06%vs6.94%,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。
圖3 PCNA在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.3 Protein expression of PCNA in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues
VEGF 蛋白表達(dá)定位于食管鱗癌細(xì)胞漿中,陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色至棕褐色,較少陽(yáng)性染色細(xì)胞出現(xiàn)于癌旁正常組織,說明食管鱗癌細(xì)胞中VEGF 蛋白亦有過度表達(dá)(圖4A、B)。本研究顯示在食管鱗癌和癌旁正常組織中,PCNA 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性表達(dá)分別率為61.11%vs16.67%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)。
圖4 VEGF在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.4 Protein expression of VEGF in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues
我們應(yīng)用逐步Logistic 回歸分析方法分析該72例食管鱗癌組織中TLR4、MyD88、PCNA、VEGF 的蛋白表達(dá)水平與臨床生物學(xué)因素的關(guān)系,得出:食管鱗癌組織中TLR4的蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)(P=0.005;P=0.032),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與年齡、性別、癌組織分化程度及浸潤(rùn)深度不相關(guān);MyD88 蛋白表達(dá)水平隨著臨床TNM 分期的增加而逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005),亦與年齡、性別、癌組織分化程度及浸潤(rùn)深度不相關(guān)(P>0.05)。同樣可見,PCNA的蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)與臨床TNM 分期呈正相關(guān)(P=0.000),與患者年齡、性別、癌組織分化程度及浸潤(rùn)深度無關(guān)(P>0.05)。食管鱗癌組織中VEGF的蛋白表達(dá)與年齡、性別、分化程度及浸潤(rùn)深度亦無關(guān)(P>0.05),但隨著臨床TNM 分期的增加而逐漸升高(P=0.003;表1)。
我們的研究表明TLR4在食管鱗癌組織中呈高表達(dá)[8]。本次研究在食管鱗癌中將TLR4 和MyD88的表達(dá)情況共同分析得出:72 例食管鱗癌組織中,TLR4的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為66.67%(48/72),MyD88為69.44%(50/72),兩者蛋白表達(dá)同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性與陰性的比率分別為59.72%和23.61%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),食管鱗癌組織中TLR4 和MyD88 的蛋白表達(dá)呈正相關(guān),且其相關(guān)性有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.618,P<0.01)。
本次研究顯示,在食管鱗癌組織中PCNA 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率是43.06%(31/72),MyD88 和PCNA同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性和陰性的比率分別為41.67%和29.17%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,食管鱗癌組織中MyD88 和PCNA 的蛋白表達(dá)亦呈正相關(guān),且相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.516,P<0.01)。在食管鱗癌組織中VEGF 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率為61.11%(44/72),MyD88 和VEGF 蛋白同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性和陰性的比率分別為58.33%和27.78%。通過分析發(fā)現(xiàn),食管鱗癌組織中MyD88 和VEGF蛋白表達(dá)有正相關(guān)性,且其相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.708,P<0.01)。
近年的許多研究資料表明,惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與慢性炎癥之間存在密不可分的關(guān)系。在持續(xù)反復(fù)的慢性炎癥刺激下,惡性腫瘤的發(fā)生率可增加,同時(shí)炎癥相關(guān)的調(diào)節(jié)因子與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。
Toll 樣受體是1 型跨膜蛋白,主要存在于免疫細(xì)胞中,包括樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,可檢測(cè)侵襲性致病微生物[10]。通過激活免疫細(xì)胞,TLR 能夠產(chǎn)生內(nèi)源性或外源性免疫反應(yīng)。TLR4是TLR 的一個(gè)子類型,先前的研究顯示TLR4 在各種惡性腫瘤中均有表達(dá),包括胃癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌和淋巴瘤,特別是TLR4的Asp299Gly基因多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[11]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn),高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、TLR4在食管癌組織中高表達(dá),并在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。作為TLRs 信號(hào)途徑中普遍存在的接頭分子MyD88,是一種胞漿內(nèi)蛋白質(zhì),一旦接收到腫瘤抗原信息,MyD88 可被TLR4 激活,引起NF-κB 核轉(zhuǎn)位,最終激活基因轉(zhuǎn)錄[12]。越來越多的證據(jù)表明,MyD88也是免疫抑制和腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵分子,在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[13-15]。本研究提示:在食管鱗癌組織中TLR4 和MyD88 蛋白均呈高水平表達(dá),且表達(dá)與患者性別、年齡、癌組織浸潤(rùn)深度及分化程度無關(guān),但隨著TNM 分期的增加而逐漸升高(P=0.032,P=0.005;表1)。
表1 TLR4、MyD88、PCNA、VEGF蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理因素的Logistic回歸分析Table 1 Logistic regression analysis of TLR4,MyD88,PCNA,VEGF protein expression and clinicopathological factors of ESCC
惡性腫瘤的發(fā)生是一種復(fù)雜的目前還不完全清楚的改變,其涉及多個(gè)基因分子的改變。反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA),是一種酸性非組胺核蛋白。其僅在增殖細(xì)胞中合成與表達(dá),是DNA 復(fù)制合成修復(fù)過程中的必需物質(zhì)。PCNA 基因表達(dá)在腫瘤細(xì)胞增殖活躍及DNA 復(fù)制加速時(shí)明顯增強(qiáng),與細(xì)胞增殖狀態(tài)明顯相關(guān),可作為一項(xiàng)評(píng)估細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)[16]。Kii 等[17]報(bào)道Ⅱ~Ⅲ期食管鱗癌的PCNA 陽(yáng)性表達(dá)率為37%,但未提及PCNA 表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性。同樣,我們的研究顯示在食管鱗癌細(xì)胞中PCNA 蛋白呈高水平表達(dá),且該表達(dá)與TNM 分期呈正相關(guān)(P=0.000),但與患者年齡、性別、癌組織浸潤(rùn)深度及分化程度均無關(guān)(表1),表明PCNA 蛋白的高表達(dá)可能促進(jìn)了食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展。
腫瘤細(xì)胞對(duì)基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)及間質(zhì)結(jié)締組織的侵襲,產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶,新生血管形成等,是惡性腫瘤對(duì)鄰近組織發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的幾個(gè)主要的環(huán)節(jié)。血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及擴(kuò)散的一個(gè)重要先決條件。作為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和分化最重要的分子之一,VEGF,其在體外具有促細(xì)胞分裂的作用,在體內(nèi)具有促血管生成的作用。通過降低VEGF 表達(dá),可以抑制腫瘤組織血管生成,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而起到治療腫瘤的作用。有研究報(bào)道,VEGF 與骨肉瘤、胃癌、卵巢癌和肺癌等實(shí)體瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)[18-22]。已被美國(guó)批準(zhǔn)用于治療多種惡性腫瘤的人源化抗VEGF 單克隆抗體(Avastin),能中和VEGF 的生理作用[23]。我們的研究發(fā)現(xiàn),在食管鱗癌組織中VEGF 的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),且與患者的臨床分期顯著相關(guān)(P=0.003),但與患者年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度及腫瘤分化程度無關(guān),表明VEGF 的蛋白高表達(dá)可能促進(jìn)了食管鱗癌的進(jìn)展,其促血管生成的作用可能有助于食管癌細(xì)胞侵入淋巴管,在淋巴結(jié)形成轉(zhuǎn)移灶。
我們的研究得出,在食管鱗癌組織中MyD88和TLR4、PCNA 以及VEGF 的蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.01),產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是TLR4-MyD88 信號(hào)通路的激活,激發(fā)了PCNA 和VEGF 的表達(dá),但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。本結(jié)果表明,TLR4、MyD88 及PCNA、VEGF 在食管鱗癌組織中呈顯著高表達(dá),并且具有相關(guān)性,提示TLR4 和MyD88 信號(hào)傳導(dǎo)通路在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中均發(fā)揮重要作用。TLR4-MyD88 信號(hào)通路有可能作為反映食管癌預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)及抗食管癌的重要靶點(diǎn),聯(lián)合檢測(cè)二者的表達(dá)水平,對(duì)食管癌的臨床診斷及預(yù)后有重要作用,有助于為患者制定個(gè)體化臨床治療方案。本研究不足之處在于TLR4-MyD88信號(hào)通路調(diào)節(jié)PCNA、VEGF表達(dá)的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)2021年3期