TLR4和MyD88在食管鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義

梁旭陽，徐 萍，呂勝祥，張志梅，王 璐，張樹賢，任 玲，馬艷芹

（1.南京醫(yī)科大學(xué)連云港臨床學(xué)院//連云港市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇連云港 222061；2.南京醫(yī)科大學(xué)上海松江臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，上海 201600）

作為一種世界上每年新增死亡人數(shù)排在第七位的惡性腫瘤［1］，食管癌最常見的病理類型是鱗狀細(xì)胞癌，且其早期診斷困難，預(yù)后較差。目前，國內(nèi)外對(duì)食管癌發(fā)生、發(fā)展的病理生理機(jī)制尚未完全闡明，因此，深入了解食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的病理生理機(jī)制，為食管癌早診、早治尋找有效措施，對(duì)降低食管癌患者的病死率、延長(zhǎng)其生存時(shí)間及提高其生活質(zhì)量具有重要臨床意義。具有多種調(diào)節(jié)功能的Toll 樣受體（TLR）/髓樣分化因子88（MyD88）信號(hào)傳導(dǎo)通路，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)揮了重要作用［2］。MyD88 是TLR 信號(hào)通路中關(guān)鍵的中轉(zhuǎn)蛋白，通過其承前啟后地傳導(dǎo)信號(hào)作用，刺激了下游促炎癥因子和和抗凋亡因子的表達(dá)，最終激活了免疫系統(tǒng)的先天免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而影響了腫瘤患者臨床發(fā)展與預(yù)后［3-5］。感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等均與MyD88 有較為明確的關(guān)系，且MyD88 被認(rèn)為是干預(yù)治療這些疾病的重要靶點(diǎn)。作為DNA 多聚酶輔助蛋白的增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclea rantigen，PCNA），存在于細(xì)胞核中，在DNA的合成中起重要作用。作為判定細(xì)胞增殖活性的內(nèi)源性標(biāo)記物，PCNA 反映了腫瘤的惡性傾向。有研究顯示抑制TLR4 的表達(dá)，可以抑制癌細(xì)胞的PCNA 表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［6］。作為血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的刺激因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種可以直接激活血管生成，并使血管通透性增加的蛋白質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)TLR4 可以通過調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá)水平而影響腫瘤血管的生成，但是其具體機(jī)制尚不清楚［7］。故本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)TLR4、MyD88及PCNA 與VEGF在食管鱗癌組織中的蛋白表達(dá)水平，分析探討MyD88 與TLR4 及其PCNA、VEGF 的相互關(guān)系及與食管鱗癌患者臨床生物學(xué)特性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 臨床資料 收集我院病理樣本庫中，2011年01 月至2014 年09 月的食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床數(shù)據(jù)及所有石蠟標(biāo)本72 例，其中癌組織為A 組，對(duì)照組B 組為正常組織（經(jīng)病理證實(shí)無鱗癌細(xì)胞的癌組織緣外6 cm 組織）。72 例患者在行食管癌根治術(shù)前均未行放射和化學(xué)治療，且均由具有高級(jí)職稱的病理醫(yī)師確診為食管鱗癌。所有患者年齡均在43～74 歲之間，平均年齡為62 歲，其中有62 例男性，10 例女性；患者鱗癌組織分化情況：14 例高分化，48 例高中及中分化，10 例中低及低分化鱗癌；患者癌組織浸潤深度情況：12 例局限在黏膜及黏膜下層，14 例浸潤至固有肌層，46 例浸潤至外膜及鄰近結(jié)構(gòu)；患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：26 例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，46例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。臨床分期（以2009年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）制訂的食管癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)第7 版為依據(jù)）情況：其中有8例患者屬于臨床分期Ⅰ期，21例屬于臨床Ⅱa期，24例屬于臨床Ⅱb期，11例屬于Ⅲa 期、3 例屬于Ⅲb 期、4 例屬于Ⅲc 期、只有1 例屬于Ⅳ期。本研究為回顧性研究，研究開始前已通過倫理委員會(huì)審批。

1.1.2 主要試劑 我們的MyD88 多克隆抗體、PCNA 單克隆抗體、VEGF 單克隆抗均屬于兔抗人抗體，且均購于美國Abcam 公司；EnVision 免疫組化試劑盒購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

文章采用免疫組化EnVision 二步法。首先制作連續(xù)石蠟切片，其厚度為4 μm；在溫度設(shè)置為70 ℃的恒溫烤箱中加熱3 min；在二甲苯和梯度酒精中進(jìn)行脫蠟與水化，然后在高壓鍋中應(yīng)用檸檬酸緩沖修復(fù)液進(jìn)行抗原熱修復(fù)（修復(fù)液濃度0.01 mol/L、pH6.0），冷卻至室溫；應(yīng)用濃度為3%的H2O2孵育，10 min 后應(yīng)用PBS 洗滌，再滴加一抗（一抗稀釋比：TLR4 為1：200、MyD88 為1：300、PCNA 為1：200、VEGF為1：200）；在4 ℃恒溫環(huán)境下過夜后，再滴加二抗；室溫孵育15 min 后，滴加DAB 溶液進(jìn)行顯色，用蘇木素進(jìn)行復(fù)染；最后進(jìn)行分化，脫水，透明，中性樹膠封片等操作。陽性對(duì)照為已知陽性癌組織切片，陰性對(duì)照中用PBS溶液代替一抗即可。

1.3 結(jié)果判定

所有染色后的組織切片，在雙盲條件下，由我院兩位病理科醫(yī)生進(jìn)行判讀。根據(jù)食管鱗狀細(xì)胞，在高倍顯微鏡下隨機(jī)選擇不少于1000 個(gè)定位明確（TLR4蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)、MyD88定位于細(xì)胞漿、PCNA 定位于細(xì)胞核、VEGF 定位于細(xì)胞漿）出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒的的鱗癌細(xì)胞，按照染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無色計(jì)為0 分，淡黃色計(jì)為1 分，棕黃色計(jì)為2 分，棕褐色計(jì)為3 分；陽性細(xì)胞百分比≤10.0%計(jì)為0 分，11.0%～25.0%計(jì)為1 分，26.0%～50.0%計(jì)為2 分，51.0%～75.0%計(jì)為3 分，≥76.0%計(jì)為4 分?？偡e分為上述兩項(xiàng)評(píng)分的和，陽性表達(dá)定義為總積分≥5分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為SPSS 19.0 版本，采用百分比表示計(jì)數(shù)資料，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)或Fisher′s 確切概率法來進(jìn)行組間比較；TLR4、MyD88、PCNA、VEGF在食管鱗癌組織中的蛋白表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)關(guān)系的分析，采用逐步Logistic 回歸分析，相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析。以α=0.05 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織中TLR4、MyD88、PCNA 及VEGF的蛋白表達(dá)情況

我們的之前研究［8］顯示TLR4 蛋白表達(dá)主要定位在食管鱗癌細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞膜中，而細(xì)胞核中幾乎不表達(dá)，陽性細(xì)胞主要呈棕黃色至棕褐色，癌旁正常組織中較少見染色陽性細(xì)胞，提示在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中TLR4 蛋白呈高平表達(dá)（圖1AB）。統(tǒng)計(jì)分析顯示在食管鱗癌和癌旁正常組織中，TLR4 蛋白的陽性表達(dá)率分別為66.7% vs 29.17%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031）。

圖1 TLR4在食管鱗癌組織和癌旁組織中的蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of TLR4 in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues

MyD88 蛋白表達(dá)主要定位于食管鱗癌細(xì)胞的胞漿中，陽性細(xì)胞呈淡黃色至棕黃色，癌旁正常組織中較少見染色陽性細(xì)胞，說明食管鱗癌細(xì)胞中MyD88蛋白呈過度表達(dá)（圖2A-B）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，MyD88 蛋白表達(dá)在食管鱗癌和癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率分別為69.44%vs22.22%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011）。

圖2 MyD88在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.2 Protein expression of MyD88 in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues

PCNA 蛋白表達(dá)定位于食管鱗癌細(xì)胞核中，陽性細(xì)胞呈棕黃色至棕褐色，較少陽性染色細(xì)胞出現(xiàn)在癌旁正常組織中，說明食管鱗癌細(xì)胞中PCNA 蛋白呈高表達(dá)（圖3A、B）。本研究顯示食管鱗癌和癌旁正常組織中，PCNA 蛋白表達(dá)的陽性率分別為43.06%vs6.94%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）。

圖3 PCNA在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.3 Protein expression of PCNA in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues

VEGF 蛋白表達(dá)定位于食管鱗癌細(xì)胞漿中，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色至棕褐色，較少陽性染色細(xì)胞出現(xiàn)于癌旁正常組織，說明食管鱗癌細(xì)胞中VEGF 蛋白亦有過度表達(dá)（圖4A、B）。本研究顯示在食管鱗癌和癌旁正常組織中，PCNA 蛋白表達(dá)的陽性表達(dá)分別率為61.11%vs16.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022）。

圖4 VEGF在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.4 Protein expression of VEGF in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues

2.2 食管鱗癌TLR4、MyD88、PCNA、VEGF 蛋白表達(dá)水平和臨床病理因素的關(guān)系

我們應(yīng)用逐步Logistic 回歸分析方法分析該72例食管鱗癌組織中TLR4、MyD88、PCNA、VEGF 的蛋白表達(dá)水平與臨床生物學(xué)因素的關(guān)系，得出：食管鱗癌組織中TLR4的蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)（P=0.005；P=0.032），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與年齡、性別、癌組織分化程度及浸潤深度不相關(guān)；MyD88 蛋白表達(dá)水平隨著臨床TNM 分期的增加而逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005），亦與年齡、性別、癌組織分化程度及浸潤深度不相關(guān)（P＞0.05）。同樣可見，PCNA的蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)與臨床TNM 分期呈正相關(guān)（P=0.000），與患者年齡、性別、癌組織分化程度及浸潤深度無關(guān)（P＞0.05）。食管鱗癌組織中VEGF的蛋白表達(dá)與年齡、性別、分化程度及浸潤深度亦無關(guān)（P＞0.05），但隨著臨床TNM 分期的增加而逐漸升高（P=0.003；表1）。

2.3 食管鱗癌組織中MyD88 與TLR4 及PCNA、VEGF陽性表達(dá)的相關(guān)性分析

我們的研究表明TLR4在食管鱗癌組織中呈高表達(dá)［8］。本次研究在食管鱗癌中將TLR4 和MyD88的表達(dá)情況共同分析得出：72 例食管鱗癌組織中，TLR4的蛋白表達(dá)陽性率為66.67%（48/72），MyD88為69.44%（50/72），兩者蛋白表達(dá)同時(shí)表達(dá)陽性與陰性的比率分別為59.72%和23.61%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中TLR4 和MyD88 的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，且其相關(guān)性有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.618，P＜0.01）。

本次研究顯示，在食管鱗癌組織中PCNA 蛋白表達(dá)的陽性率是43.06%（31/72），MyD88 和PCNA同時(shí)表達(dá)陽性和陰性的比率分別為41.67%和29.17%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，食管鱗癌組織中MyD88 和PCNA 的蛋白表達(dá)亦呈正相關(guān)，且相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.516，P＜0.01）。在食管鱗癌組織中VEGF 蛋白表達(dá)的陽性率為61.11%（44/72），MyD88 和VEGF 蛋白同時(shí)表達(dá)陽性和陰性的比率分別為58.33%和27.78%。通過分析發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中MyD88 和VEGF蛋白表達(dá)有正相關(guān)性，且其相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.708，P＜0.01）。

3 討論

近年的許多研究資料表明，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與慢性炎癥之間存在密不可分的關(guān)系。在持續(xù)反復(fù)的慢性炎癥刺激下，惡性腫瘤的發(fā)生率可增加，同時(shí)炎癥相關(guān)的調(diào)節(jié)因子與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］。

Toll 樣受體是1 型跨膜蛋白，主要存在于免疫細(xì)胞中，包括樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，可檢測(cè)侵襲性致病微生物［10］。通過激活免疫細(xì)胞，TLR 能夠產(chǎn)生內(nèi)源性或外源性免疫反應(yīng)。TLR4是TLR 的一個(gè)子類型，先前的研究顯示TLR4 在各種惡性腫瘤中均有表達(dá)，包括胃癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌和淋巴瘤，特別是TLR4的Asp299Gly基因多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［11］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、TLR4在食管癌組織中高表達(dá)，并在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［8］。作為TLRs 信號(hào)途徑中普遍存在的接頭分子MyD88，是一種胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)，一旦接收到腫瘤抗原信息，MyD88 可被TLR4 激活，引起NF-κB 核轉(zhuǎn)位，最終激活基因轉(zhuǎn)錄［12］。越來越多的證據(jù)表明，MyD88也是免疫抑制和腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵分子，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［13-15］。本研究提示：在食管鱗癌組織中TLR4 和MyD88 蛋白均呈高水平表達(dá)，且表達(dá)與患者性別、年齡、癌組織浸潤深度及分化程度無關(guān)，但隨著TNM 分期的增加而逐漸升高（P=0.032，P=0.005；表1）。

表1 TLR4、MyD88、PCNA、VEGF蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理因素的Logistic回歸分析Table 1 Logistic regression analysis of TLR4，MyD88，PCNA，VEGF protein expression and clinicopathological factors of ESCC

惡性腫瘤的發(fā)生是一種復(fù)雜的目前還不完全清楚的改變，其涉及多個(gè)基因分子的改變。反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），是一種酸性非組胺核蛋白。其僅在增殖細(xì)胞中合成與表達(dá)，是DNA 復(fù)制合成修復(fù)過程中的必需物質(zhì)。PCNA 基因表達(dá)在腫瘤細(xì)胞增殖活躍及DNA 復(fù)制加速時(shí)明顯增強(qiáng)，與細(xì)胞增殖狀態(tài)明顯相關(guān)，可作為一項(xiàng)評(píng)估細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)［16］。Kii 等［17］報(bào)道Ⅱ～Ⅲ期食管鱗癌的PCNA 陽性表達(dá)率為37%，但未提及PCNA 表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性。同樣，我們的研究顯示在食管鱗癌細(xì)胞中PCNA 蛋白呈高水平表達(dá)，且該表達(dá)與TNM 分期呈正相關(guān)（P=0.000），但與患者年齡、性別、癌組織浸潤深度及分化程度均無關(guān)（表1），表明PCNA 蛋白的高表達(dá)可能促進(jìn)了食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展。

腫瘤細(xì)胞對(duì)基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)及間質(zhì)結(jié)締組織的侵襲，產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，新生血管形成等，是惡性腫瘤對(duì)鄰近組織發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的幾個(gè)主要的環(huán)節(jié)。血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及擴(kuò)散的一個(gè)重要先決條件。作為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和分化最重要的分子之一，VEGF，其在體外具有促細(xì)胞分裂的作用，在體內(nèi)具有促血管生成的作用。通過降低VEGF 表達(dá)，可以抑制腫瘤組織血管生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而起到治療腫瘤的作用。有研究報(bào)道，VEGF 與骨肉瘤、胃癌、卵巢癌和肺癌等實(shí)體瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)［18-22］。已被美國批準(zhǔn)用于治療多種惡性腫瘤的人源化抗VEGF 單克隆抗體（Avastin），能中和VEGF 的生理作用［23］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌組織中VEGF 的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，且與患者的臨床分期顯著相關(guān)（P=0.003），但與患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度及腫瘤分化程度無關(guān)，表明VEGF 的蛋白高表達(dá)可能促進(jìn)了食管鱗癌的進(jìn)展，其促血管生成的作用可能有助于食管癌細(xì)胞侵入淋巴管，在淋巴結(jié)形成轉(zhuǎn)移灶。

我們的研究得出，在食管鱗癌組織中MyD88和TLR4、PCNA 以及VEGF 的蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)（P＜0.01），產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是TLR4-MyD88 信號(hào)通路的激活，激發(fā)了PCNA 和VEGF 的表達(dá)，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。本結(jié)果表明，TLR4、MyD88 及PCNA、VEGF 在食管鱗癌組織中呈顯著高表達(dá)，并且具有相關(guān)性，提示TLR4 和MyD88 信號(hào)傳導(dǎo)通路在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中均發(fā)揮重要作用。TLR4-MyD88 信號(hào)通路有可能作為反映食管癌預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)及抗食管癌的重要靶點(diǎn)，聯(lián)合檢測(cè)二者的表達(dá)水平，對(duì)食管癌的臨床診斷及預(yù)后有重要作用，有助于為患者制定個(gè)體化臨床治療方案。本研究不足之處在于TLR4-MyD88信號(hào)通路調(diào)節(jié)PCNA、VEGF表達(dá)的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。