基于化學(xué)遺傳的慢性應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥小鼠模型的構(gòu)建

鄧藝雯，張寅航，徐興浩，蟻焌哲，張小然，黃瑋俊

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究中心，廣東廣州 510080）

［J SUN Yat-sen Univ（Med Sci），2021，42（3）：346-354］

抑郁癥（depressive disorder）是一種常見的精神類疾病，核心癥狀是情感低落（depressed mood）、興趣減退或快感缺失（anhedonia）。此外，還可伴有精力減退、易怒、注意力障礙、食欲下降、睡眠和認(rèn)知障礙能力下降等癥狀，嚴(yán)重者常反復(fù)出現(xiàn)消極的自殺觀念和行為［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，抑制癥還與Ⅱ型糖尿病、冠脈系統(tǒng)疾病、骨質(zhì)疏松、腸易激綜合征、癌癥、帕金森病、癡呆、癲癇等多種常見疾病的發(fā)病密切相關(guān)［2-9］，影響著世界約16%人口的健康［10］。抑郁癥嚴(yán)重威脅人類健康，它的病因?qū)W和影響因素的探究因而成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。一般認(rèn)為應(yīng)激，特別是慢性應(yīng)激，是誘發(fā)抑郁癥的重要環(huán)境危險(xiǎn)因子之一。據(jù)報(bào)導(dǎo)，慢性應(yīng)激可降低前額皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)受體的敏感性，誘發(fā)神經(jīng)元的活性受損［11］；過度激活中腦腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元［12］；抑制海馬區(qū)神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)分泌，改變神經(jīng)元的突觸結(jié)構(gòu)，加速神經(jīng)元的萎縮［11，13］。上述中樞核團(tuán)的功能和器質(zhì)性病損，正是抑郁癥發(fā)病的重要病理學(xué)基礎(chǔ)。建立抑郁癥的動(dòng)物模型是慢性應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥具體機(jī)制研究的關(guān)鍵一環(huán)。目前最常用的造模方式是使用慢性溫和不可預(yù)見性的刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS），模擬慢性應(yīng)激［14］。這種方法造模的成功率不高，造模的效果也不甚穩(wěn)定［15-16］。因?yàn)檠铀韪雇鈧?cè)區(qū)頭端（rostral ventrolateral medulla，RVLM）是中樞在應(yīng)激中調(diào)節(jié)外周交感神經(jīng)系統(tǒng)的核心部位［17］，所以我們使用化學(xué)遺傳技術(shù)，對小鼠RVLM 進(jìn)行持續(xù)的刺激，模擬機(jī)體對慢性應(yīng)激的反應(yīng)，系統(tǒng)觀察小鼠的行為學(xué)、血壓及主要炎癥因子的變化情況，為優(yōu)化慢性應(yīng)激誘發(fā)抑郁癥的動(dòng)物建模方法提供參考。現(xiàn)將結(jié)果介紹如下。

1 材料與方法

1.1 RVLM腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠的建立

SPF 級雄性Dbh-cre 純合子C57/BL6 小鼠，10～12周齡，體質(zhì)量22～26 g，飼養(yǎng)在中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度為（50±5）%，自由攝取食物和飲水，自然晝夜節(jié)律，新到動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為降低個(gè)體差異對實(shí)驗(yàn)的影響，首先用曠場實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評分，取得分接近的30 只小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)規(guī)定。

使用異氟烷麻醉后，將小鼠以俯臥位置于腦立體定位儀上，確定注射部位RVLM 的立體定向坐標(biāo)，以電動(dòng)磨鉆穿透相應(yīng)腦區(qū)表面顱骨形成直徑約1.5 mm 的孔洞，用微量注射泵及1 μL 的Hamilton微注射器在小鼠的雙側(cè)RVLM 注射腺病毒載體AAV2/9-hSyn-DIO-hM3D（Gq）-mCherry（造模組）或AAV2/9-hSyn-DIO-mCherry（對照組）300 μL（Taitools，中國），勻速10 min 注射完畢，注射后留針5 min。操作過程中，在小鼠身體下方放置加熱墊，使小鼠體溫維持在（37.0±0.5）℃。每天定時(shí)予造模小鼠經(jīng)腹腔注射給藥氯氮平N-氧化物（clozapine N-oxide，CNO）溶液，具體流程為每天給藥1次（給藥量為1mg/kg），共2 周，以提高神經(jīng)元的敏感性；再每天給藥3 次，共2 周，以強(qiáng)化神經(jīng)元的興奮效果（圖1A）。完成造模流程后，我們進(jìn)行后續(xù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2 小鼠的血壓檢測

使用BP-98A 大小鼠無創(chuàng)血壓儀（softron，日本），用尾壓光電容積脈波測量法間接無創(chuàng)測量老鼠的血壓和心率的記錄。測量時(shí)，取連續(xù)測量5～8次的收縮壓和心率值，求其平均值。

1.3 小鼠的曠場實(shí)驗(yàn)

將小鼠放入由不透明材料制成的長寬高為50 cm×50 cm × 50 cm，周壁、箱底為藍(lán)色的敞箱內(nèi)，曠場區(qū)域被等分為16 格，其中中央4 格定義為中心區(qū)，其余為外圍區(qū)，實(shí)驗(yàn)時(shí)保證區(qū)域四角光線均勻。視頻記錄10 min 內(nèi)小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)箱中的活動(dòng)。每只動(dòng)物只進(jìn)行1 次行為測定測定指標(biāo)；水平運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)進(jìn)入總次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間和中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離。

1.4 小鼠的蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)

在隔噪音、安靜的房間內(nèi)給予每只小鼠事先定量好的水瓶，并于24 h后稱重計(jì)算液體消耗量。第1 個(gè)24 h，測定動(dòng)物正常飲水量；第2 個(gè)24 h 測試含糖飲水；第3 個(gè)24 h 測試含糖飲水。排除位置偏好干擾，計(jì)算動(dòng)物的蔗糖水偏好百分比（糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%）。

1.5 小鼠的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)主要測定小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。先以較低轉(zhuǎn)速（10 r/min，）對所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練以消除恐懼感，每天3 次，每次5 min，間隔時(shí)間10 min 以上，連續(xù)3 d。第4 天正式實(shí)驗(yàn)，將小鼠放在轉(zhuǎn)棒儀上，轉(zhuǎn)速從12 r/min 開始，在6 min 內(nèi)加速到25 r/min，利用轉(zhuǎn)棒儀的分析軟件自動(dòng)記錄每只小鼠從開始到從轉(zhuǎn)動(dòng)棒上掉落下來的時(shí)間，即為轉(zhuǎn)棒潛伏期時(shí)間。連續(xù)進(jìn)行3 次試驗(yàn)（間隔10 min），取最長時(shí)間并記錄。

1.6 小鼠的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

測定指標(biāo)為不動(dòng)時(shí)間，即在水面漂浮、只有維持身體平衡必備的輕微活動(dòng)或是身體垂直于水面只有鼻露出水面的時(shí)間記錄為不動(dòng)時(shí)間。首先向4 L 燒杯內(nèi)注入溫度為（23±2）℃，深約20 cm 的水，使小鼠在水中尾部不能觸碰杯底。每只小鼠單獨(dú)測試。每次強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的總時(shí)間為6 min。測試時(shí)將小鼠輕放入水中，首先讓其適應(yīng)游泳2 min，從第2 min 開始記錄后續(xù)4 min 內(nèi)小鼠在水中停止掙扎、呈漂浮狀態(tài)的時(shí)間總和。

1.7 小鼠外周血主要炎性因子的檢測

眼眶后靜脈叢取血，常溫靜置30 min，1 500×g離心10 min 后取25 μL 血清，用LEGENDPlex Mouse Inflammation Panel 試劑盒（BioLegend，德國），按照制造商提供的說明書，通過流式細(xì)胞儀（BECKMAN COULTER，美國）測量炎性因子濃度。所獲數(shù)據(jù)使用LEGENDplex 數(shù)據(jù)分析軟件（BioLegend，德國）進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理，P＜0.05 則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 RVLM腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠的成功建立

立體定位注射表達(dá)載體3周后取7只小鼠進(jìn)行血壓和腦片檢測，判斷RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠是否成功建立。檢測結(jié)果如圖1C所示，7只小鼠的雙側(cè)RVLM 腦區(qū)均特異性表達(dá)紅色熒光，提示M3D（Gq）和mCherry 紅色熒光蛋白在RVLM 去甲腎上腺能神經(jīng)元中穩(wěn)定表達(dá)。經(jīng)腹腔向小鼠注射CNO（Clozapine N-oxide，給藥量為1 mg/kg）溶液后1 h，檢測小鼠的血壓及心律。結(jié)果顯示，對照組的心率（HR）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和平均脈壓（MBP）分別是（489.8±61.49）次/min、（102.8±7.45）mmHg、（50.44±10.17）mmHg 和（67.91±7.45）mmHg，造模組則為（473.0±123.40）次/ min、（115±12.81）mmHg、（68.78±11.53）mmHg 和（84.2±11.67）mmHg。其中，造模組的舒張壓（P＜0.01）和平均脈壓差（P＜0.01）與對照組比均顯著升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1D）。結(jié)果提示造模小鼠的RVLM 去甲腎上腺能神經(jīng)元成功被CNO激活。

圖1 RVLM腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠的成功建立Fig.1 Chemical genetic mice of RVLM were established successfully

2.2 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的曠場實(shí)驗(yàn)變化

結(jié)果如圖2-B、C所示，造模組的水平運(yùn)動(dòng)總距離（P＜0.001）、中央?yún)^(qū)進(jìn)入總次數(shù)（P＜0.001）、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間（P＜0.001）和中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離（P＜0.001）與對照組比均顯著降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組的水平運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)進(jìn)入總次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間和中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離分別是（26199±4613）mm、（27.1±7.34）s、（71.5±25.9）次和（3376±601.8）mm，造模組則為（6561±3239）mm、（2.63±1.51）s、（9.52±6.645）次和（529±532.4）mm。結(jié)果提示，造模小鼠出現(xiàn)了探索和運(yùn)動(dòng)能力減退的抑郁癥典型癥狀。

圖2 造模小鼠的曠場實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)變化Fig.2 Behavioral changes of model mice in open field experiment

2.3 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)變化

結(jié)果如圖3 所示，造模組的蔗糖水偏好系數(shù)與對照組比均顯著降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對照組的基線總液體消耗量、蔗糖水消耗量、純水消耗量和蔗糖水偏好系數(shù)分別是（54.74±6.17）g、（54.39±1.06）g、（2.71±1.72）g 和（0.95±0.035）%，造模組則為（56.16±7.07）g、（42.84±11.04）g、（7.24±1.80）g 和（0.85±0.042）%。結(jié)果說明造模組小鼠出現(xiàn)了明顯的快感缺失，這和曠場實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的。

圖3 造模小鼠的蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)變化Fig.3 Behavioral changes of model mice in sucrose preference experiment

2.4 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)變化

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)反映動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。據(jù)報(bào)導(dǎo)，慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥動(dòng)物模型會(huì)在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)不佳［18］。因此，我們也進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4 所示，對照組和造模組的轉(zhuǎn)棒潛伏時(shí)間分別為（366.8±55.2）s、（70.7±49.9）s。造模組小鼠的轉(zhuǎn)棒潛伏期時(shí)間明顯低于對照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。這提示造模小鼠除了出現(xiàn)抑郁癥2 大典型癥狀外，還出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的減退。

圖4 造模小鼠的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)變化Fig.4 Behavioral changes of model mice in rotarod experiment

2.5 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)變化

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中小鼠靜止?fàn)顟B(tài)持續(xù)的時(shí)間越長，提示小鼠的抑郁癥程度越嚴(yán)重［19］。如圖5 所示，對照組和造模組的靜止?fàn)顟B(tài)持續(xù)時(shí)間分別為（173.2±64.8）s、（185.2±35.6）s，造模組的靜止時(shí)間較對照組的絕對差值在（12.0±26.4）s。結(jié)果顯示造模組的靜止時(shí)間較對照組稍有增多，但差異并不顯著，組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 造模小鼠的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)變化Fig.5 Behavioral changes of model mice in forced swimming experiment

2.6 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的血壓變化

慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥會(huì)伴有血壓偏高［20］。完成造模流程后，我們觀察造模小鼠的心率和血壓情況，結(jié)果如圖6A 所示，對照組的心率（HR）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和平均脈壓差（MBP）分別是（470.2±55.82）次/ min、（104.4±8.168）mmHg、（54.15±1.485）mmHg 和（72.03±1.73）mmHg，造模組則為（604.1±37.33）次/ min、（114.2±8.241）mmHg、（62.05±6.10）mmHg和（79.91±6.00）mmHg。其中，造模組的心率（P＜0.01）、收縮壓（P＜0.05）、舒張壓（P＜0.05）和平均脈壓差（P＜0.05）與對照組比均顯著升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的外周血主要炎性因子變化

慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥還會(huì)伴有炎性因子的釋放紊亂［19-21］。因此我們檢測了機(jī)體外周血主要的炎性因子水平，這包括IFN-γ、TNF-α、IL1-β 和IL-10。結(jié)果顯示，對照組的這4 種炎性因子的濃度分別為（23.4±13.1）pg/mL、（22.3±6.6）pg/mL、（189.8±126.8）pg/mL、（552.3±393.6）pg/mL，造模組則分別為（190.0±100.2）pg/mL、（32.6±11.5）pg/mL、（163.3±87.8）pg/mL、（1508.2±531.6）pg/mL。造模組外周血的IFN-γ（P＜0.05）和IL-10（P＜0.05）濃度均比對照組顯著升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6B）。

圖6 小鼠模型血壓和外周血炎性因子的變化Fig.6 The changes of blood pressure and inflammatory factors between the model and control group

3 討論

慢性溫和不可預(yù)見性的刺激（CUMS）法迄今已廣泛使用近30 年［14］。能較好的誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生消極情緒、快感缺失等抑郁癥的經(jīng)典表現(xiàn)。有報(bào)導(dǎo)指出CUMS 法造模的成功率并不高，只有約30%［15-16，22］，因此，我們需要優(yōu)化造模方法，以求提高抑郁癥動(dòng)物建模的效率和穩(wěn)定性。

我們建立了基于化學(xué)遺傳的慢性應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥的小鼠模型，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絕大部分造模小鼠均表現(xiàn)出探索和運(yùn)動(dòng)能力減退、快感缺失等抑郁癥經(jīng)典表現(xiàn)，且較對照組的差異非常明顯。曠場實(shí)驗(yàn)綜合反映了抑郁癥對動(dòng)物探索和運(yùn)動(dòng)能力的影響［23］，造模組小鼠較對照組在水平運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)進(jìn)入總次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間和中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離這四項(xiàng)指標(biāo)均顯著下降（P＜0.001），轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)反映了抑郁癥對動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的影響［21］，蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)反映了抑郁癥對動(dòng)物快感缺失程度的影響［20，24］。后2 個(gè)實(shí)驗(yàn)的核心指標(biāo)——轉(zhuǎn)棒潛伏時(shí)間（P＜0.001）和蔗糖水偏好系數(shù)（P＜0.001）均呈現(xiàn)與曠場實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果。據(jù)調(diào)查，蔗糖偏好或曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果在CUMS 法造模動(dòng)物中較為穩(wěn)定［14-16］，依然有至少25%的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告說這2 個(gè)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性不佳［14-16］。我們造模的成功率和穩(wěn)定性在這2個(gè)實(shí)驗(yàn)均有較好的表現(xiàn)，較CUMS 法可能有一定的優(yōu)勢。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，雖然造模組的絕對靜止時(shí)間稍多于對照組，但差異并不顯著。這可能是因?yàn)槲覀兊脑炷r(shí)間還不夠長所致。據(jù)報(bào)導(dǎo)，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在CUMS 法造模動(dòng)物中表現(xiàn)也極不穩(wěn)定［14-16］。

慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥往往伴有血壓偏高，外周血IFN-γ、TNF-α、IL1-β 等炎性因子增加，IL-10等抑炎因子減少等癥狀［19-21］。提示CUMS法造模動(dòng)物的炎性因子和血壓調(diào)節(jié)因子，如一氧化氮（NO）、血清素（serotonin）等合成發(fā)生紊亂的研究多有報(bào)導(dǎo)［25-29］。因此，我們在完成造模流程后也觀察了造模小鼠的血壓及炎性因子的改變情況。結(jié)果顯示，造模組的心率（P＜0.01）和血壓（P＜0.05）均較對照組顯著上調(diào)；炎性因子方面，造模組的IFN-γ（P＜0.01）和抑炎因子IL-10（P＜0.05）水平較對照組顯著上調(diào)。上述結(jié)果提示，我們的方法與CUMS 法一樣，可以誘發(fā)血壓偏高和炎性因子釋放紊亂等抑郁癥的常見伴隨癥狀。

綜上所述，我們建立了基于化學(xué)遺傳的慢性應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥小鼠模型，該模型在誘發(fā)抑郁癥經(jīng)典癥狀，及血壓偏高、炎性因子釋放紊亂等抑郁癥伴隨癥狀上均表現(xiàn)出較高的成功率和穩(wěn)定性。相關(guān)研究為優(yōu)化慢性應(yīng)激誘發(fā)抑郁癥的動(dòng)物模型建模方法，提高建模效率和穩(wěn)定性提供了有參考價(jià)值的科學(xué)依據(jù)。