血清UCH-L 1和GFAP水平對(duì)新生兒窒息后腦損傷的診斷價(jià)值*

魏超平，張芳萍，孫裕平

(山東省青島市婦女兒童醫(yī)院：1.NICU；2.神經(jīng)內(nèi)科 266000)

新生兒窒息由于腦組織嚴(yán)重受損可引發(fā)包括窒息后缺氧缺血性腦病(HIBD)在內(nèi)的腦部疾病，臨床表現(xiàn)為神經(jīng)發(fā)育異常、中樞神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、智力低下及視聽障礙等[1-2]。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，我國(guó)每年嚴(yán)重腦損傷新生兒超過(guò)60萬(wàn)，致殘率高達(dá)27%以上，嚴(yán)重威脅新生兒健康及社會(huì)人口素質(zhì)[3]。生物標(biāo)志物檢測(cè)作為一種與細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖相關(guān)的新興檢測(cè)技術(shù)受到越來(lái)越多的關(guān)注。神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞攜帶的細(xì)胞骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物。在新生兒窒息后HIBD中，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均會(huì)受到不同程度損傷。泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)則是一類神經(jīng)元細(xì)胞高特異性表達(dá)蛋白[4-5]。本研究旨在通過(guò)應(yīng)用UCH-L1和GFAP水平評(píng)估新生兒窒息后HIBD的預(yù)后，為臨床診療提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2019年1月本院收治的新生兒窒息后HIBD患兒120例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《新生兒窒息診斷和分度標(biāo)準(zhǔn)建議(2013年版)》規(guī)定的HIBD相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)胎齡34～39周，出生體重大于2 500 g。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴隨感染性疾病、先天性心臟病、神經(jīng)系統(tǒng)畸形；(2)低血糖腦病或膽紅素腦病等其他原因造成的腦損傷。根據(jù)臨床檢查及顱腦超聲結(jié)果將HIBD患兒分為輕度組(意識(shí)清醒，無(wú)腦細(xì)胞損傷，腦電圖正常，n=61)、中度組(意識(shí)遲鈍、肌張力低下，中度腦細(xì)胞損傷、腦水腫，部分有顱內(nèi)出血，n=34)和重度組(生后即有淺昏迷或昏迷，呼吸暫停，肌張力松弛，皮層腦細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷或壞死，伴有顱內(nèi)出血，n=25)。其中，輕度組：男30例，女31例；胎齡35～39周，平均(38.22±5.35)周。中度組：男19例，女15例；胎齡34～39周，平均(38.31±5.44)周。重度組：男14例，女11例；胎齡34～39周，平均(38.16±5.74)周。另選取同期健康新生兒115例作為對(duì)照組，其中，男58例，女57例，胎齡35～39周，平均(38.78±6.44)周。4組新生兒性別、胎齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集及檢測(cè)

采集4組新生兒出生后6 h、3 d外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min，收集上清液置于-70 ℃待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)UCH-L1、GFAP水平。(1)UCH-L1檢測(cè)：試劑盒購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司，檢測(cè)儀器采用美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的Bio-Rad 680酶標(biāo)儀。將待測(cè)樣品用稀釋液C稀釋至合適濃度，將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)血清樣品取100 μL加入孔板，室溫孵育2.5 h；每孔加入洗滌液300 μL充分洗滌后吸去液體，每孔繼續(xù)加入備用生物素標(biāo)記的抗UCH-L1抗體100 μL，室溫孵育1 h，充分洗滌后依次加入Item G、Item H，最后加入終止液；盡快將孔板置于酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)選擇450 nm，檢測(cè)各孔吸光度值，UCH-L1測(cè)定范圍為0.50～180.00 ng/mL，正常參考值為0.70～1.10 ng/mL。(2)GFAP檢測(cè)：試劑盒及檢測(cè)儀器同上。使用檢測(cè)緩沖液將待測(cè)樣品稀釋，將稀釋樣品取100 μL加入孔板，同時(shí)設(shè)置一系列標(biāo)準(zhǔn)品孔，室溫下孵育2 h，洗滌液充分洗滌后，每孔依次加入抗GFAP抗體、酶溶液、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液及終止液，待溶液由藍(lán)變黃后置于酶標(biāo)儀下檢測(cè)，測(cè)試波長(zhǎng)450 nm，GFAP測(cè)定范圍為0.03～50.00 ng/mL。正常參考值為0.10～1.20 ng/mL

1.2.2觀察指標(biāo)

(1)比較有、無(wú)HIBD后遺癥患兒出生后6 h、3 d的血清UCH-L1、GFAP水平；(2)采用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估血清UCH-L1、GFAP對(duì)新生兒窒息后HIBD早期預(yù)測(cè)價(jià)值；(3)新生兒出生后6 h、3 d的血清UCH-L1、GFAP與Gesell發(fā)育量表(GDS)評(píng)分相關(guān)性分析。

1.2.3隨訪

HIBD患兒給予相應(yīng)治療，好轉(zhuǎn)出院后進(jìn)行為期12個(gè)月的隨訪，隨訪內(nèi)容包括神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)、視力聽力檢查、生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)等，評(píng)估其是否出現(xiàn)后遺癥。隨訪12個(gè)月后，采用GDS對(duì)患兒神經(jīng)功能檢查進(jìn)行評(píng)估[7]，發(fā)育商小于或等于75分提示患兒出現(xiàn)智力殘疾，或癲癇發(fā)作，可視為發(fā)生后遺癥。根據(jù)是否發(fā)生后遺癥將HIBD患兒分為無(wú)后遺癥組和有后遺癥組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 4組新生兒不同時(shí)間UCH-L1、GFAP水平比較

出生后6 h、3 d，4組新生兒血清UCH-L1、GFAP水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，HIBD重度組血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均最高，對(duì)照組水平最低，各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輕度組、中度組、重度組在生后3 d血清UCH-L1水平明顯低于生后6 h，而血清GFAP水平明顯高于生后6 h(P<0.05)，見表1。

表1 4組新生兒出生后6 h、3 d的UCH-L1和GFAP水平比較

2.2 有、無(wú)后遺癥患兒UCH-L1、GFAP水平比較

隨訪12個(gè)月，120例HIBD患兒中無(wú)后遺癥86例(無(wú)后遺癥組，71.67%)，GDS評(píng)分為(80.62±7.71)分；有后遺癥34例(有后遺癥組，28.33%)，GDS評(píng)分為(73.45±7.38)分，兩組患兒GDS評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有后遺癥組血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均明顯高于無(wú)后遺癥組(P<0.05)，見表2。

表2 有、無(wú)后遺癥患兒UCH-L 1、GFAP水平比較

2.3 血清UCH-L1、GFAP對(duì)HIBD早期預(yù)測(cè)價(jià)值

出生后6 h血清UCH-L1預(yù)測(cè)新生兒窒息后HIBD的靈敏度為85.34%，特異度為88.93%，曲線下面積(AUC)為0.916(95%CI：0.870～0.962，P=0.028)；出生后6 h血清GFAP預(yù)測(cè)新生兒窒息后HIBD的靈敏度為81.27%，特異度為83.61%，AUC為0.872(95%CI：0.714～0.896，P=0.013)，見圖1。

圖1 血清UCH-L 1、GFAP預(yù)測(cè)新生兒窒息后 HIBD ROC曲線

2.4 血清UCH-L 1、GFAP水平與GDS評(píng)分相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，出生后6 h新生兒血清UCH-L1、GFAP水平與GDS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.576，P=0.001；r=-0.739，P=0.014)；出生后3 d血清UCH-L1、GFAP水平與GDS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.626，P<0.001；r=-0.457，P=0.003)。

3 討 論

HIBD是導(dǎo)致圍生期新生兒腦損傷的常見疾病，目前HIBD造成的腦損傷主要依賴病史、體格檢查，結(jié)合磁共振成像(MRI)或頭顱CT等檢查確定[8]。不同的檢測(cè)方法有著不同的限制性，如體格檢查存在偏高的假陰性率；MRI或CT不僅價(jià)格昂貴，還需要患兒保持一定時(shí)間的鎮(zhèn)靜狀態(tài)，并使得患兒接受多次電離輻射存在二次腦損傷的可能，且影像學(xué)改變無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腦功能改變，部分神經(jīng)影像學(xué)檢測(cè)正常而患兒臨床癥狀卻較為嚴(yán)重[9]。因此，尋找合適的HIBD腦損傷生物標(biāo)志物以期更早地發(fā)現(xiàn)新生兒腦損傷具有十分重要的意義。

UCH-L1是一種高度特異性表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞的蛋白，其在血液中的水平升高通常與腦神經(jīng)細(xì)胞損傷或血腦屏障破壞有關(guān)。UCH-L1升高已被普遍認(rèn)為是包括早期重型顱腦損傷及急性腦缺血性疾病在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的標(biāo)志物[10]。黃瑋玲等[11]將130例早產(chǎn)兒分為腦白質(zhì)損傷組、腦室周圍-腦室內(nèi)出血組及無(wú)腦損傷組，比較各組血清UCH-L1水平發(fā)現(xiàn)，腦白質(zhì)損傷組、腦室周圍-腦室內(nèi)出血組血清UCH-L1水平均明顯高于無(wú)腦損傷組。WELCH等[12]對(duì)251例輕度創(chuàng)傷性腦損傷患者進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)相較于S100B蛋白，血清UCH-L1識(shí)別正常、異常CT表現(xiàn)的靈敏度、特異度均更優(yōu)。GFAP是一種特異性酸性蛋白，多存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，被認(rèn)為是該細(xì)胞的特有標(biāo)志物，在維持細(xì)胞形態(tài)及功能上均有重要作用，當(dāng)中樞神經(jīng)受損后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生，GFAP迅速合成，體內(nèi)水平隨之升高[13]。陳長(zhǎng)春等[14]研究發(fā)現(xiàn)，足月新生兒HIBD發(fā)病后不同時(shí)間、不同嚴(yán)重程度腦脊液GFAP水平均存在差異。不過(guò)腦脊液需腰椎穿刺獲取，相關(guān)報(bào)道并不多。但動(dòng)物模型顯示，腦損傷小鼠腦組織的UCH-L1及GFAP表達(dá)較對(duì)照組明顯升高[15]。

基于以往研究基礎(chǔ)，為了進(jìn)一步探究血清UCH-L1和GFAP水平對(duì)新生兒窒息后HIBD的影響及早期預(yù)測(cè)價(jià)值，本研究將120例HIBD患兒分為輕度組、中度組及重度組，并與同期健康新生兒作比較，結(jié)果顯示，出生后6 h、3 d，對(duì)照組、輕度組、中度組、重度組血清UCH-L1、GFAP水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，HIBD重度組血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均最高，對(duì)照組水平最低；輕度組、中度組、重度組血清UCH-L1水平在出生后3 d明顯較出生后6 h降低(P<0.05)，血清GFAP水平較出生后6 h明顯升高(P<0.05)。提示腦損傷早期神經(jīng)元受到一定影響，星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了HIBD病理、生理早期修復(fù)，血清UCH-L1在出生3 d后較出生6 h時(shí)降低，可能是由于出生后患兒腦神經(jīng)元細(xì)胞破壞逐漸緩解，釋放的血清UCH-L1開始減少[16]；而GFAP在出生3 d后較出生后6 h時(shí)升高，可能是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞后期仍處于活化狀態(tài)起著修復(fù)作用。經(jīng)過(guò)為期12個(gè)月的隨訪，有后遺癥組患兒血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均明顯高于無(wú)后遺癥組。提示血清UCH-L1、GFAP與HIBD患兒預(yù)后有一定關(guān)系。出生后6 h血清UCH-L1、GFAP預(yù)測(cè)新生兒HIBD的靈敏度分別為85.34%、81.27%，特異度分別為88.93%、83.61%，AUC分別為0.916、0.872；出生后6 h、3 d新生兒血清UCH-L1、GFAP水平與GDS評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

綜上所述，血清UCH-L1、GFAP在HIBD患兒出生后6 h即明顯升高，其水平與患兒腦損傷嚴(yán)重程度及預(yù)后有一定關(guān)系，對(duì)HIBD新生兒進(jìn)行UCH-L1、GFAP檢測(cè)有助于作出早期腦損傷判斷，可為臨床后續(xù)治療提供參考依據(jù)。