序貫調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的骨修復(fù)材料構(gòu)建及其體外成管化作用研究*

程 鵬，賀思豪，艾秋池，周江玲，侯天勇，邢軍超

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科/全軍矯形外科中心/陸軍軍醫(yī)大學(xué)組織工程研究與開發(fā)中心,重慶 400038)

大段骨缺損是臨床骨組織損傷救治的一大難題，重要原因之一在于缺乏有效可靠的具有組織重建功能的骨修復(fù)材料。既往骨修復(fù)材料的研發(fā)重點(diǎn)關(guān)注其成骨能力，往往忽略血管化這一成骨活動(dòng)的基礎(chǔ)條件[1-2]。有研究表明，移植骨的成骨活動(dòng)總是與血管化過程密切相關(guān)，血管化的程度甚至直接決定了骨移植的成敗[3-4]。早期良好的血管化不僅為移植材料輸送氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)、移除代謝廢物，還為宿主成骨相關(guān)細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)等的遷移定植提供必需的條件[5-6]。在骨缺損缺血區(qū)的血管及骨重建過程中，局部炎癥因子的協(xié)同作用調(diào)節(jié)的巨噬細(xì)胞極化扮演重要角色。巨噬細(xì)胞分為經(jīng)典激活途徑巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)和替代激活途徑巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)，在組織修復(fù)早期，M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮促炎功能，在后期M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎、促進(jìn)損傷組織修復(fù)和血管生長的作用[7]。為此，本研究利用藻酸鹽緩釋系統(tǒng)和生物素-親和素系統(tǒng)耦聯(lián)脫鈣骨基質(zhì)(DBM)構(gòu)建骨修復(fù)材料，實(shí)現(xiàn)干擾素(IFN)-γ和白細(xì)胞介素(IL)-4的序貫釋放，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化從而促進(jìn)血管生成，為其在骨缺損修復(fù)治療中的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)購自美國ATCC公司(PCS-800-012)，人外周血來源單核巨噬細(xì)胞購自美國ATCC公司(CRL-9855)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)、0.25%胰蛋白酶、特優(yōu)胎牛血清(FBS)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、IMDM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；海藻酸鈉、Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1、Biotin-sulfo-LC-LC-NHS、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司；重組人IL-4、IFN-γ蛋白購自美國PeproTec公司；抑制劑購自美國Selleck公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

(1)EPC的培養(yǎng)：細(xì)胞復(fù)蘇后加入新鮮ECM，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，于5% CO2，37 ℃恒溫孵箱孵育24 h后見細(xì)胞貼壁生長，換液后以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次以去除未貼壁細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基，隔天換液至細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)傳代，取P3代對數(shù)生長期的細(xì)胞使用。(2)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)：培養(yǎng)基為含10% FBS的IMDM培養(yǎng)基，細(xì)胞解凍、離心、棄上清液后加入新鮮培養(yǎng)基并接種于超低吸附培養(yǎng)瓶(美國Corning)中，于5% CO2，37 ℃恒溫孵箱孵育24 h后換液，隔天換液至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)傳代，傳代后培養(yǎng)基中加入10 ng/mL的巨噬細(xì)胞克隆集落刺激因子(M-CSF)，隔天換液至第5天，取細(xì)胞使用。

1.2.2材料構(gòu)建

將材料分為4組：空白對照組(Ctrl組)、單純IFN-γ組(IFN組)、單純IL-4組(IL-4組)、IL-4加IFN-γ組(聯(lián)合組)。(1)DBM的制備：按照本課題前述方法制備支架，依托陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨庫，以云南小香豬脛骨、股骨近遠(yuǎn)端松質(zhì)骨塊，制備支架材料。在密閉玻璃容器中加入 0.6 mol/L鹽酸，支架投入其中浸泡脫鈣。常溫浸泡 24 h，每8小時(shí)更換鹽酸1次，當(dāng)皮質(zhì)骨呈半透明能彎曲的彈性狀態(tài)，松質(zhì)骨塊呈海綿狀壓縮后自動(dòng)恢復(fù)原狀，將骨塊取出，以無菌蒸餾水反復(fù)沖洗、浸泡，直至pH值為7，吸出浸泡液將DBM支架材料置于離心管中，300×g 離心 5 min，對DBM進(jìn)行輻照處理以滅菌，真空冷凍干燥機(jī)干燥后分裝備用。(2)DBM的生物素化：取 DBM支架于PBS浸泡后修剪大小約3 mm×3 mm×3 mm，將其浸泡于10 mmol/L Biotin-sulfo-LC-LC-NHS中1 h，PBS沖洗3次以清除未附著的生物素，70%乙醇溶液浸泡消毒10 min，以PBS洗凈后浸泡在PBS中，4 ℃浸泡 24 h。(3)蛋白生物素化：調(diào)整重組人IL-4蛋白溶液濃度為1 mg/mL，向其中加入10 mmol/L Sulfo-NHS-Biotin粉末，室溫放置1 h完成蛋白生物素化，PBS透析移除未附著的生物素，無菌過濾后存于4 ℃?zhèn)溆谩?4)支架-蛋白耦聯(lián)：將生物素化的DBM支架浸泡于172 μg/mL的親和素溶液中1 h，PBS沖洗3次，再將IL-4組與聯(lián)合組浸泡于生物素化的IL-4溶液1 h，IFN組和Ctrl組浸泡于PBS溶液中1 h，PBS沖洗3次。由于親和素可提供4個(gè)高親和力的生物素結(jié)合位點(diǎn)供其特異性結(jié)合，使得IL-4與支架之間的非共價(jià)連接十分牢固。(5)復(fù)合材料構(gòu)建：制備含重組人IFN-γ蛋白的海藻酸鈉溶液(IFN-γ 1 mg/mL，海藻酸鈉80 mg/mL)，以其浸泡IL-4耦聯(lián)的支架材料30 min，Ctrl組與IL-4組浸泡在不含IFN-γ的海藻酸鈉溶液中30 min，浸泡于10.1 mg/mL氯化鈣溶液中10 min，重復(fù)以上步驟3次，見材料表面有淺白色絮狀物附著，去離子水洗凈后-80 ℃凍存干燥備用，電鏡下觀察材料的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.3緩釋動(dòng)力檢測

取聯(lián)合組復(fù)合材料放置在10 mL的DMEM/F12培養(yǎng)基中，放置在37 ℃恒溫箱中，每天更換液體并收集培養(yǎng)基，以10 000 r/min離心10 min，取上清液通過ELISA試劑盒測定IL-4與IFN-γ水平，計(jì)算累計(jì)釋放量。

1.2.4復(fù)合材料對巨噬細(xì)胞極化的影響

取M-CSF刺激5 d的巨噬細(xì)胞，以1×106/mL的濃度采用雙面靜置接種法接種于各組材料，加入培養(yǎng)基，培育3 d后更換培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)1、4、7 d收集培養(yǎng)基，通過ELISA檢測其中蛋白水平。相同時(shí)間點(diǎn)取各組材料，液氮研磨后提取mRNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后行實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、趨化因子受體7(CCR7)、趨化因子配體18(CCL18)、血小板衍生生長因子(PDGF-BB)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等引物序列見表1。擴(kuò)增條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s，57 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)。

表1 RT-PCR引物序列(5′-3′)

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)

取EPC以ECM重懸制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL。在24孔板中組裝Transwell小室，于下室按照實(shí)驗(yàn)分組，分別加入700 μL各組培育3 d后的培養(yǎng)基。按照實(shí)驗(yàn)分組于Transwell上室中分別加入200 μL含單細(xì)胞懸液、含Axinitib(VEGFR2抑制劑)或含SB225002(IL-8抑制劑)預(yù)處理EPC的單細(xì)胞懸液。將Transwell小室置于5%CO2、37 ℃的孵箱內(nèi)，遷移6 h后終止。以無菌棉簽擦拭碳酸酯膜上層以去除未遷移的細(xì)胞。用PBS沖洗碳酸酯膜3次。以4%的多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗3次。0.5%Triton-X100破膜10 min，PBS沖洗3次后以DAPI工作液(1 μg/mL)避光染色5～8 min，PBS沖洗3次。熒光顯微鏡下每個(gè)碳酸酯膜隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×200)分別計(jì)數(shù)，計(jì)算并比較每組細(xì)胞遷移數(shù)量。

1.2.6管腔形成實(shí)驗(yàn)

將Matrigel膠置于4 ℃過夜使其緩慢融化，加入至96孔板中(50 μL/孔)，37 ℃的孵箱內(nèi)靜置30 min，以各組孵育7 d的培養(yǎng)基制備濃度為2×105/mL的EPC單細(xì)胞懸液，每孔加入50 μL細(xì)胞懸液，37 ℃孵箱內(nèi)孵育8 h后鏡檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 材料性狀

DBM外觀如圖1A所示，IFN-γ藻酸鹽混合溶液與氯化鈣溶液反復(fù)浸泡后可在支架孔隙表面形成淺白色膠狀物(圖1B)。掃描電鏡結(jié)果顯示Ctrl組支架孔隙率均一，微孔表面較為光滑(圖1C)，IL-4、IFN組可見蛋白基質(zhì)均勻皺縮分布在支架表面(圖1D、E)，聯(lián)合組由于IFN-γ藻酸鹽混合溶液與氯化鈣溶液的反應(yīng)形成凝膠樣褶皺，見圖1F。

A、B：支架大體觀；C：Ctrl組；D：IL-4組；E：IFN組；F：聯(lián)合組。

2.2 復(fù)合材料的緩釋動(dòng)力

復(fù)合材料與IFN-γ和IL-4的結(jié)合穩(wěn)定。復(fù)合材料通過藻酸鹽緩釋系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)與IFN-γ外層負(fù)載達(dá)到早期釋放的效果，IFN-γ在前4 d穩(wěn)定快速釋放，4 d內(nèi)釋放接近完全；復(fù)合材料通過生物素-親和素系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)IL-4的內(nèi)層耦聯(lián)達(dá)到緩釋效果，IL-4在前3 d無明顯釋放，在第4～7天快速穩(wěn)定釋放，此后每天少量釋放，至第13天釋放完全，見圖2。

圖2 IFN-γ及IL-4緩釋動(dòng)力(n=5)

2.3 復(fù)合材料對巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，IFN-γ早期的釋放使聯(lián)合組與IFN組巨噬細(xì)胞向M1型極化，在培育第1天，IFN-γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放M1型標(biāo)志物TNF-α，表現(xiàn)出M1型極化的部分趨勢；第4天，IFN-γ的釋放使得巨噬細(xì)胞表達(dá)M1型標(biāo)志物CCR7、TNF-α及IL-1β；第7天，M1型標(biāo)志物表達(dá)水平相比Ctrl組無明顯差異。在第1、4天，耦聯(lián)炎癥因子的3組中細(xì)胞均高表達(dá)IL-8，在第7天，IL-8的表達(dá)在各組間無明顯差異。IL-4在第4～7天的穩(wěn)定釋放使IL-4組巨噬細(xì)胞向M2型極化，在培育第1天，IL-4組細(xì)胞即高表達(dá)M2型標(biāo)志物CD206，證實(shí)IL-4可誘導(dǎo)M2型細(xì)胞極化；在第4天，IL-4組細(xì)胞CD206表達(dá)明顯升高，而聯(lián)合組與Ctrl組無明顯差異；在第7天，IL-4組細(xì)胞CD206與Ctrl組無明顯差異，而聯(lián)合組CD206表達(dá)明顯升高；在第4、7天，聯(lián)合組由于IL-4的釋放導(dǎo)致M2型標(biāo)志物CCL18及PDGF-BB表達(dá)水平明顯升高。對于VEGF表達(dá)而言，聯(lián)合組細(xì)胞在第1天表達(dá)VEGF，明顯高于IL-4組，與IFN組水平相當(dāng)，聯(lián)合組細(xì)胞VEGF表達(dá)水平在第4天達(dá)到高峰，在第7天仍高表達(dá)，且明顯高于其他3組，見圖3。ELISA結(jié)果顯示，在培育第1天和第4天，IFN-γ的釋放導(dǎo)致巨噬細(xì)胞高表達(dá)M1型標(biāo)志物TNF-α、IL-1β及趨化因子IL-8；IL-4的釋放導(dǎo)致巨噬細(xì)胞高表達(dá)M2型標(biāo)志物CCL18、PDGF-BB；在第4天和第7天，由于IL-4的釋放，復(fù)合材料明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化標(biāo)志物的分泌。對于VEGF的表達(dá)變化趨勢，ELISA結(jié)果與PCR結(jié)果較為一致，見圖4。

a:P<0.05,與Ctrl組比較;b:P<0.05,與IL-4組比較;c:P<0.05,與IFN組比較;d:P<0.05,與聯(lián)合組比較。

2.4 復(fù)合材料對血管生成的影響

管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-4及聯(lián)合組條件培養(yǎng)基可顯著促進(jìn)管腔形成；阻斷VEGF受體(Axitinib)均可明顯抑制聯(lián)合組條件培養(yǎng)基的促血管生成作用，阻斷IL-8(SB225002)對聯(lián)合組條件培養(yǎng)基的促血管生成作用影響甚微，見圖5。

2.5 復(fù)合材料對EPC遷移的影響

Transwell細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，IFN組及聯(lián)合組條件培養(yǎng)基可明顯促進(jìn)EPC遷移；盡管聯(lián)合組VEGF表達(dá)量較高，阻斷VEGF受體(Axitinib)后未見EPC的遷移發(fā)生明顯改變；而阻斷IL-8(SB225002)可明顯抑制聯(lián)合組條件培養(yǎng)基對EPC的募集作用，見圖6。

a:P<0.05,與Ctrl組比較;b:P<0.05,與IL-4組比較;c:P<0.05,與IFN組比較;d:P<0.05,與聯(lián)合組比較。

圖4 巨噬細(xì)胞蛋白表達(dá)變化(n=5)

A：Ctrl組；B：IFN組；C：IL-4組；D：聯(lián)合組；E：聯(lián)合組+Axitinib組；F：聯(lián)合組+SB225002。

A：Ctrl組；B：IFN組；C：IL-4組；D：聯(lián)合組；E：聯(lián)合組+Axitinib組；F：聯(lián)合組+SB225002；a：P<0.05,與Ctrl組比較。

3 討 論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體的重要免疫細(xì)胞，具有吞噬病原、抗原遞呈和分泌多種細(xì)胞因子等功能。除了在免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，巨噬細(xì)胞在血管生成及骨生成過程中也扮演著不可或缺的角色[8-9]。研究表明，當(dāng)宿主巨噬細(xì)胞缺失時(shí)，移植物內(nèi)的血管生成無法進(jìn)行，而充分的血管發(fā)生對于骨的發(fā)育及修復(fù)必不可少[10-11]。在不同的組織微環(huán)境、細(xì)胞因子作用下，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)性分子及功能的不同，巨噬細(xì)胞可極化成M1和M2型。在IFN-γ為代表的眾多因子的作用下，巨噬細(xì)胞極化為M1型，而在IL-4等因子作用下，其向M2型極化。在組織損傷修復(fù)過程中，早期損傷局部產(chǎn)生的炎癥因子導(dǎo)致巨噬細(xì)胞以M1型為主，爾后M2型為巨噬細(xì)胞的主要存在形式[12-13]?；诰奘杉?xì)胞在免疫防御、血管生成、骨生成方面的重要作用及其不同極化狀態(tài)下的不同生理功能，通過移植材料調(diào)節(jié)宿主巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，從而改善其移植環(huán)境內(nèi)血管化水平的促組織修復(fù)方式極有可能更適合于臨床大段骨缺損的救治。因此，骨移植材料如能順序、可控地激活M1及M2型巨噬細(xì)胞，將充分調(diào)動(dòng)宿主自身的抗感染及組織損傷后修復(fù)能力，這不僅符合當(dāng)今醫(yī)學(xué)界推崇的原位組織工程理念，還將為臨床大段骨缺損的治療提供新的思路。

為此，本研究利用藻酸鹽緩釋系統(tǒng)和鏈霉素-親和素系統(tǒng)耦聯(lián)DBM構(gòu)建了復(fù)合材料。藻酸鹽是在海藻中提取的天然多糖碳水化合物，為一種天然纖維素，無毒副作用，來源豐富、價(jià)格低廉，且具有良好的生物相容性和可降解性[14]。藻酸鹽在鈣離子溶液中可即刻形成熱穩(wěn)定凝膠，其作為控釋系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用[15]。親和素與生物素有著極強(qiáng)的親和性，此外還能與一些含生物素的大分子蛋白結(jié)合，因此，生物素化的DBM支架和IL-4可由親和素提供過高親和力結(jié)合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)較為牢固的非共價(jià)連接。結(jié)果顯示，復(fù)合材料可實(shí)現(xiàn)IFN-γ與IL-4的序貫釋放。既往有學(xué)者采用氣體發(fā)泡-粒子瀝濾的方法制備了多聚-L-谷氨酸(PLG)支架，實(shí)現(xiàn)了促血管生成因子如VEGF及促成熟因子PDGF-BB的序貫釋放，成功地改善了支架的血管生成能力，并揭示了細(xì)胞因子有序作用的重要性[16]。血管生成過程復(fù)雜，對眾多生長因子和信號(hào)分子有著嚴(yán)格的時(shí)間和劑量要求，使得針對單一或少數(shù)細(xì)胞因子的控釋產(chǎn)生的作用存疑[17]。而巨噬細(xì)胞主要通過分泌因子的方式調(diào)控血管生成，其對成骨相關(guān)細(xì)胞如EPC、MSC、成骨細(xì)胞等的生物學(xué)行為均有著重要的調(diào)控作用。因此，通過材料序貫調(diào)控巨噬細(xì)胞的分泌功能可能對血管生成及骨修復(fù)形成級(jí)聯(lián)放大的調(diào)控作用。本研究結(jié)果證實(shí)，復(fù)合材料可在序貫釋放細(xì)胞因子的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的序貫調(diào)節(jié)，即在4 d內(nèi)，巨噬細(xì)胞以M1型為主，而后以M2型為主；體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與組織損傷修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)變化時(shí)間較為吻合，亦體現(xiàn)了材料的仿生學(xué)特征。

在血管生成的過程中，EPC的遷移是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在組織損傷信號(hào)的引導(dǎo)下，EPC由骨髓動(dòng)員至外周循環(huán)，再遷移至損傷部位促進(jìn)局部新血管的形成，此外EPC已被證實(shí)在多種動(dòng)物模型中具有促進(jìn)成骨細(xì)胞形成從而促進(jìn)骨修復(fù)的作用[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合材料可明顯促進(jìn)EPC向巨噬細(xì)胞的遷移，提示復(fù)合材料具有良好的促血管生成作用。EPCs的遷移受到多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，比如PI3K/Akt，SDF-1/CXCR4/eNOS等，本課題組前期研究證實(shí)，在骨缺損模型中，EPC向移植物遷移的主要信號(hào)途徑為CXCR2-Src-PKL/Vav2-Rac1通路[5]。IL-8是CXCR2的一種高親和力配體，最初被描述為一種炎性趨化因子，可以趨化白細(xì)胞。有研究表明，IL-8可與G-CSF協(xié)同作用，通過結(jié)合CXCR1和CXCR2來調(diào)節(jié)EPC的動(dòng)員進(jìn)而促進(jìn)骨的修復(fù)[3,18]。SB225002為CXCR2的高選擇性抑制劑，在本研究中，發(fā)現(xiàn)復(fù)合材料對EPC向巨噬細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用可被SB225002阻斷，提示CXCR2及其配體在其中的關(guān)鍵作用，也從另一方面論證了通過調(diào)控巨噬細(xì)胞旁分泌功能促進(jìn)血管生成的可行性。除了通過分泌作用調(diào)控成骨細(xì)胞形成等過程外，EPC促進(jìn)血管生成的主要方式在于分化為內(nèi)皮細(xì)胞，直接促進(jìn)血管再生。EPC通過向內(nèi)皮細(xì)胞分化及促進(jìn)成骨細(xì)胞形成進(jìn)而促進(jìn)血管化和骨修復(fù)。本研究中，觀察到聯(lián)合組條件培養(yǎng)基可明顯促進(jìn)血管生成，而阻斷VEGFR2可明顯抑制此作用，說明了VEGF在巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)血管生成過程中的重要作用；而VEGF在聯(lián)合組持續(xù)高表達(dá)，亦反證了復(fù)合材料良好的促血管生成能力。此外，在眾多的細(xì)胞因子中，VEGF和PDGF-BB的促血管生成作用最具代表性，VEGF的主要作用為募集內(nèi)皮細(xì)胞啟動(dòng)血管生成，而PDGF-BB主要參與血管生成后期管腔形成及周細(xì)胞募集過程，二者在血管生成過程中相繼大量表達(dá)從而使血管生成過程有序進(jìn)行[19-20]。本研究制備的復(fù)合材料通過調(diào)控巨噬細(xì)胞由M1向M2的極化，使得VEGF和PDGF-BB的表達(dá)高峰可以相繼出現(xiàn)。

綜上所述，血管化是骨移植成功的關(guān)鍵，而炎性反應(yīng)在其中起重要作用。如果骨缺損局部的炎癥微環(huán)境可以通過材料的制備技術(shù)和工藝加以合理控制，那么未來的材料將有希望徹底擺脫細(xì)胞的束縛、借助宿主的自我修復(fù)功能完成重建。為此，本研究構(gòu)建了可序貫調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的復(fù)合材料，通過體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了其促血管生成能力，可為骨缺損的治療提供新的思路，在骨缺損的應(yīng)用及研究中具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值。