白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能*

陳曉燕，王 禮，李 嘯

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400037； 2.重慶市高新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科 400039)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是造成癡呆的最主要原因。其起病隱匿，早期癥狀不明顯，然而隨著病程進(jìn)展，惡化迅速，易衍變成不可逆的損害。β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失是AD的主要病理表現(xiàn)，其中Aβ沉積導(dǎo)致的過度炎癥水平是AD的主要發(fā)病機(jī)制之一[1]。而中樞固有免疫細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞則可以通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)的炎癥水平參與AD的發(fā)生與發(fā)展，其中當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化時(shí)，會(huì)引起過度的炎性反應(yīng)，而當(dāng)其向M2型極化時(shí)，則可以有效地抑制炎性反應(yīng)[2]。最新研究表明，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化可有效改善AD小鼠模型的認(rèn)知功能障礙[3]。白藜蘆醇(RSV)作為一種天然的多酚類物質(zhì)，其主要來源于花生、葡萄等植物中，有研究表明其具有抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗衰老等作用[4]。而RSV能否通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化來改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙目前尚少有報(bào)道。本研究采用APP/PS1轉(zhuǎn)基因的經(jīng)典AD模型小鼠，給予RSV處理，觀察其對(duì)APP/PS1小鼠認(rèn)知功能的改善作用及小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞極化水平的影響，并探討其中相關(guān)的分子機(jī)制，為AD 的防治提供新思路和新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要材料與試劑

RSV(美國Sigma公司)，沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)抗體(英國Abcam公司)，離子鈣接頭蛋白1(Iba-1)抗體(英國Abcam公司)，GAPDH抗體(美國Boster公司)，熒光二抗( 美國Life Technologies公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa 公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，白細(xì)胞介素(IL)-6，IL-1β、IL-10、Arginase1、GAPDH引物(上海生工公司)等。合成引物序列見表1。

表1 合成引物序列

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9月齡的雄性 APP/PS1小鼠及同窩野生型(WT)雄性小鼠購買自南京模式動(dòng)物中心，所有的小鼠都飼養(yǎng)在適宜濕度(50%左右)及適宜溫度(21 ℃左右)的潔凈環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，水與食物供給充足，自由進(jìn)食。有關(guān)動(dòng)物的相關(guān)實(shí)驗(yàn)流程與規(guī)范都按照陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及保護(hù)的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與藥物處理

共納入45只雄性小鼠，其中15只WT小鼠為對(duì)照組(WT組)，另外30只APP/PS1小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表的方法將其分為AD模型組(AD組)與AD RSV治療組(AD+RSV組)，每組15只。參照文獻(xiàn)[4]報(bào)道的方法，給予AD+RSV組小鼠腹腔注射RSV(40 mg/kg)，總共注射28 d。WT組與AD組小鼠給予等劑量的生理鹽水。

1.2.2Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

在給藥結(jié)束后，采用Morris水迷宮行為學(xué)系統(tǒng)對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力進(jìn)行檢測。參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行，小鼠在正式檢測前接受1 d的適應(yīng)性訓(xùn)練，以消除不同實(shí)驗(yàn)組中對(duì)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)每個(gè)象限之間的偏好，再對(duì)小鼠進(jìn)行4 d正式的實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，讓它們找到一個(gè)隱藏的平臺(tái)，習(xí)慣于游泳和找到對(duì)應(yīng)的平臺(tái)，每天進(jìn)行4次訓(xùn)練，每次訓(xùn)練60 s，讓小鼠每次在平臺(tái)上停留20 s。在第5天的時(shí)候，為了評(píng)估小鼠對(duì)有平臺(tái)象限的記憶水平，進(jìn)行正式檢測，并移除平臺(tái)。記錄每只小鼠搜索到正確象限的時(shí)間，并測量進(jìn)入正確象限的次數(shù)。

1.2.3免疫組織化學(xué)(IHC)與免疫熒光檢測

小鼠行為學(xué)檢測后，取材，利用4%多聚甲醛固定24 h，接著用30%蔗糖+4%多聚甲醛脫水48 h后，用冰凍切片機(jī)進(jìn)行組織切片。用0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗小鼠腦組織切片，加入相對(duì)應(yīng)的一抗(兔抗SIRT1、鼠抗Iba-1)，并放入到4 ℃冰箱中孵育12 h，用PBS漂洗，加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗(488抗鼠、Cy3抗兔)，接著放入37 ℃中繼續(xù)孵育2 h，用PBS漂洗，IHC采用SABC繼續(xù)孵育1 h后，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。免疫熒光的則直接利用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色細(xì)胞核，繼續(xù)用PBS漂洗，貼片，干燥，封片。采用熒光顯微鏡拍照，并統(tǒng)計(jì)海馬中Iba-1陽性細(xì)胞及Iba-1與SIRT1雙陽性細(xì)胞的密度。每組共采用4個(gè)樣本進(jìn)行檢測。

1.2.4Western blot檢測

將海馬組織在冰上分離出來，按照100 μL/mg加入組織裂解液，利用組織破碎機(jī)進(jìn)行充分研磨，離心后取上清液。并采用二喹啉甲酸(BCA)法測出蛋白濃度。配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，在每個(gè)凝膠孔中加入各組對(duì)應(yīng)的蛋白樣品，放入電泳槽中進(jìn)行 SDS-PAGE，接著進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，再將膜放入到5%的脫脂奶粉溶液中常溫下封閉3 h，分別加入SIRT1和GAPDH的抗體，放在4 ℃條件下孵育12 h，并用TBST清洗，加入對(duì)應(yīng)的二抗，在37 ℃孵箱中孵育2 h，并用TBST清洗，加入發(fā)光液曝光，將聚偏氟乙烯(PVDF)膜上的水吸干，用Bio-Rad ChemiDoc MP多功能成像系統(tǒng)顯影采圖。用 ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，以 GAPDH為內(nèi)參算出SIRT1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，并以WT組為對(duì)照，分別計(jì)算出AD組和AD+RSV組的相對(duì)表達(dá)量，每組采用4個(gè)樣本進(jìn)行檢測。

1.2.5實(shí)時(shí)定量PCR

在冰上分離海馬組織，并放入到1.5 mL無酶管中，每管分別加入1 mL的Trizol，利用組織破碎機(jī)充分研磨，接著每管中加入200 μL的氯仿，蓋好蓋子進(jìn)行劇烈震蕩15 s再放置3 min，離心，吸取上層無色水相層，轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)無酶管中，并加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，在室溫條件下靜置10 min，離心，去掉上清液，用75%乙醇洗滌沉淀，室溫放置晾干，每管中加入20 μL的無酶水溶解RNA，采用紫外分光光度儀檢測RNA濃度和純度。接著按照說明書上的方法去除DNA雜質(zhì)，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后分別加入對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。每組共檢測4個(gè)樣本。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠認(rèn)知功能相關(guān)指標(biāo)比較

利用Morris水迷宮行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，在訓(xùn)練的第3、4天，AD組的小鼠找到平臺(tái)所需要的時(shí)間較WT組明顯增加(P<0.05)，而在訓(xùn)練的第3、4天，AD+RSV組小鼠找到平臺(tái)所需的時(shí)間較AD組明顯降低(P<0.05)。在第5天撤去平臺(tái)后，AD組小鼠比WT組小鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間明顯降低(P<0.05)，且進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)也明顯減低(P<0.05)；與AD組小鼠比較，AD+RSV組小鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間及進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)均明顯增加(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與WT組比較；b：P<0.05，與AD+RSV組比較。

2.2 各組小鼠海馬中炎癥因子相對(duì)表達(dá)水平比較

利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)小鼠海馬中的炎癥因子檢測發(fā)現(xiàn)，與WT組小鼠比較，AD組小鼠海馬中的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的促炎因子IL-6與IL-1β表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。與AD組小鼠比較，AD+RSV組小鼠海馬中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的炎癥因子IL-6與IL-1β的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，同時(shí)AD+RSV組小鼠海馬中M2型小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)抗炎因子IL-10與Arginase1的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，見圖2。

2.3 各組小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞上SIRT1相對(duì)表達(dá)水平比較

利用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，AD組小鼠海馬中的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較WT組小鼠明顯增加(P<0.05)，而相對(duì)于AD組，AD+RSV組小鼠海馬中的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量無明顯的變化(P>0.05)，見圖3。同時(shí)，利用免疫熒光雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)，AD組小鼠海馬中SIRT1與Iba-1雙標(biāo)的數(shù)量較WT組明顯降低(P<0.05)，而AD+RSV組小鼠海馬中SIRT1與Iba-1雙標(biāo)的數(shù)量較AD組明顯增加(P<0.05)。采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于AD組，D+RSV組小鼠海馬中SIRT1的相對(duì)表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與WT組比較；b：P<0.05，與AD+RSV組比較。

A、B、C：WT組、AD組、AD+RSV組小鼠海馬中Iba-1表達(dá)(IHC，×50)；D：各組小鼠海馬中Iba-1陽性細(xì)胞比較；a：P<0.05，與WT組比較。

A、B、C：WT組、AD組、AD+RSV組小鼠海馬中Iba-1和SIRT1免疫熒光雙標(biāo)染色(×200，箭頭代表Iba-1和SIRT1雙陽性細(xì)胞)；D：各組小鼠海馬中Iba-1與SIRT1雙陽性細(xì)胞百分比比較；E：Western blot；F：SIRT1蛋白半定量分析；a：P<0.05，與AD組比較。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型，給予RSV處理后，可以上調(diào)AD小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞上SIRT1的表達(dá)，促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，減輕腦內(nèi)的炎性反應(yīng)，進(jìn)而有效地改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙。本研究提示，RSV可作為治療AD的潛在藥物，通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞上SIRT1的表達(dá)使其向M2型極化可能是治療AD的一個(gè)新靶點(diǎn)。

眾所周知，炎性反應(yīng)在AD的發(fā)生發(fā)展中扮演著極其關(guān)鍵的作用[6]。在AD的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，Aβ和tau蛋白的聚集可以引起腦內(nèi)過度的炎性反應(yīng)，釋放大量的促炎因子，包括IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等，進(jìn)而觸發(fā)大腦的神經(jīng)過度退化進(jìn)程[7]。另外，一項(xiàng)基于網(wǎng)絡(luò)的AD相關(guān)基因整合分析顯示，免疫/小膠質(zhì)細(xì)胞基因網(wǎng)絡(luò)與AD神經(jīng)病理學(xué)的聯(lián)系最為緊密[8]。同時(shí)，在臨床AD患者中研究發(fā)現(xiàn)，其腦內(nèi)的炎癥水平明顯高于健康者[9-10]。而小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞系統(tǒng)中極其關(guān)鍵的一種免疫細(xì)胞，可以及時(shí)應(yīng)對(duì)大腦中的有害刺激,其中就包括Aβ等錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。但如果這種刺激未得到及時(shí)解決，小膠質(zhì)細(xì)胞的慢性激活將減弱其正常生理功能，變?yōu)檫^度活化狀態(tài)，即M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，會(huì)過度表達(dá)促炎的標(biāo)志物，比如IL-1β、TNF-α、CD36、CD14、CD11c和MHC-Ⅱ等，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)元造成損傷[11-12]。然而，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞處于抗炎保護(hù)狀態(tài)，即M2型時(shí)，可以釋放抗炎因子(IL-10，TGF-β)、細(xì)胞生長因子(IGF-1，F(xiàn)GF，CSF1)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF，BDNF，GDNF)，進(jìn)而起到抗炎與神經(jīng)保護(hù)作用[13]。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)，在AD的發(fā)生、發(fā)展中扮演至關(guān)重要的作用。而有研究表明，SIRT1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)能夠起到調(diào)節(jié)作用，當(dāng)上調(diào)SIRT1水平可以有效地使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，從而起到抗炎及神經(jīng)保護(hù)的作用[14-15]，這也在本研究中得到了證實(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)RSV處理后可以上調(diào)SIRT1的表達(dá)水平，進(jìn)而使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。有研究發(fā)現(xiàn)，采用干預(yù)手段，如殼多糖酶處理，可以通過使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化進(jìn)而改善AD大鼠的認(rèn)知功能障礙[16]。以上研究也進(jìn)一步證實(shí)了小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)在AD的發(fā)生、發(fā)展及治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化水平，進(jìn)而為AD的治療提供新靶點(diǎn)。

RSV作為一種多酚類化合物，其可以通過激活SIRT1基因來影響機(jī)體的代謝及表觀遺傳，進(jìn)而起到抗炎、抗氧化、抗衰老等功能[17]。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予正常的老年患者連續(xù)服用26周的RSV，可以明顯地增加其海馬中的神經(jīng)發(fā)生與神經(jīng)功能連接，進(jìn)而改善老年患者的記憶認(rèn)知功能[18]。而SIRT1作為RSV的一個(gè)靶向調(diào)控基因，在AD的病理生理機(jī)制中也扮演關(guān)鍵作用。有研究表明，上調(diào)SIRT1的水平，可以有效地降低AD模型小鼠腦中的Aβ蛋白水平，進(jìn)而改善其認(rèn)知功能[19]。在本研究中，通過RSV處理上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞上的SIRT1水平，可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能，進(jìn)一步闡述了RSV改善AD模型小鼠認(rèn)知功能障礙的相關(guān)機(jī)制。

綜上所述，本研究從小膠質(zhì)細(xì)胞極化的角度探討了RSV對(duì)AD模型小鼠的治療作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，RSV處理可以有效地上調(diào)AD模型小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞上SIRT1的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，減輕AD小鼠腦內(nèi)的過度炎性反應(yīng)，進(jìn)而改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能障礙。該研究可為下一步治療AD患者提供新的方向與靶點(diǎn)，并為RSV應(yīng)用于臨床治療AD患者提供理論依據(jù)。