肉羊鮮精常溫保存技術(shù)的研究

張良斌，賀心康，劉自運，柴 局，布魯呼木圖，張新杰，翟太宇，張仙保*

（1.包頭市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古包頭014013；2.包頭市九原區(qū)家畜改良工作站，內(nèi)蒙古包頭014000；3.包頭市九原區(qū)動物檢疫監(jiān)督所，內(nèi)蒙古包頭014000；4.包頭市城鄉(xiāng)統(tǒng)籌一體化促進中心，內(nèi)蒙古包頭014000）

隨著畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)肉羊是適應(yīng)國際市場的需要。我國的肉羊產(chǎn)業(yè)起步較晚，目前還沒有形成肉羊的繁育體系。肉羊品種多為地方品種，產(chǎn)肉性能較差、羊肉品質(zhì)也較低、市場的競爭力相對較弱。近年來，我國已引入德國肉用美利奴、南非肉用美利奴、杜泊、薩?？?、特克塞爾、無角道賽特等優(yōu)質(zhì)肉羊品種，利用引入的肉羊品種與當(dāng)?shù)鼐d羊品種雜交進行改良，取得較好的養(yǎng)殖生產(chǎn)效果[1]。為提高引進肉用種公羊的利用率，逐漸擴大肉用羊的繁育數(shù)量，采用鮮精低溫保存的方法進行人工授精是比較直接有效的方法。鮮精低溫保存技術(shù)延長肉羊精子的存活時間，提高了優(yōu)良種公羊精液的利用率，擴大配種范圍[2]。但是，采用低溫保存的精液解凍之后，精子的活性以及精子的完整率均較低，對于后期受精率有較大影響[3]，且冷凍保存的條件較為苛刻，通常是在4℃低溫保存[4-5]，輸精需要攜帶冰箱，導(dǎo)致工作人員的工作強度較大、成本較高。

養(yǎng)殖生產(chǎn)中，為解決精液保存問題，本試驗通過參考鮮精低溫保存技術(shù)[6]，以卵黃和海藻糖作為單一變量進行研究，從而確定肉羊鮮精常溫保存配方，保證運輸與人工授精的時間和精子活率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

卵黃（雞蛋）購自當(dāng)?shù)爻?，自生產(chǎn)日期不超過15 d。

三羥基氨基甲烷（Tris）、檸檬酸鈉、維生素C、還原型谷胱甘肽、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷（ATP）、青霉素、鏈霉素、海藻糖均購自北京酷來搏科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 精液的采集

試驗羊由包頭市九原區(qū)鑫泰農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司提供，為膘情中等、體質(zhì)健康、性欲旺盛的無角多賽特種羊，卵黃組和海藻糖組各5只，每只羊做3個重復(fù)。

使用假陰道法采集精液，確保精液不受污染，將采集的精液在放置顯微鏡下觀察并測定精子的活率，鏡檢合格后進行常規(guī)品質(zhì)評定。精子活率大于80%、無異味、色澤純白或灰白，作為試驗樣品。

1.2.2 精液活率的測定

將檢測合格的種公羊精液與37℃預(yù)熱的稀釋液按照1∶3的比例進行稀釋，稀釋過程中要保證溫度穩(wěn)定在37℃左右，以免溫差造成精子活率下降。分別比較在保存第1、2、3、4 d精子的活率，保存方式為常溫（20~25℃）保存。

精子活率檢測：將稀釋精液搖勻后取10μL中層精液滴于經(jīng)預(yù)熱的37℃恒溫血細胞計數(shù)板上，蓋片后置于顯微鏡下放大400倍，檢查精子總量和活精數(shù)量，計算精子活率。

1.2.3 精液緩沖劑的配制

卵黃組：取3~9 g Tris、0.8~2.8 g檸檬酸鈉、0.1~0.8 g維生素C、0.01~0.09 g還原型谷胱甘肽、0.06~0.28 g牛血清白蛋白、0.02~0.15 g ATP、10~80萬IU青霉素、5~30萬IU鏈霉素、海藻糖1.75 g加入20 mL雙蒸水，用玻璃棒攪拌均勻。將雞蛋打入干凈燒杯（雞蛋不可打散），用沒有針頭的注射器插入蛋黃內(nèi)吸取蛋黃液加入上一步配制的液體中，組配制好的溶液加入雙蒸水配制為100 mL的溶液，用玻璃棒攪拌混勻。蛋黃分5組，每組加入量分別為5、10、15、20、25 mL。

海藻糖組：卵黃15 mL，海藻糖分為6組，每組加入量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g；剩余物質(zhì)的含量與卵黃組成分一致。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 25.0軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用鄧肯氏法對組間數(shù)據(jù)進行多重比較，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含量海藻糖對肉羊精子活率的影響（見表1）

使用血液計數(shù)板按照24 h間隔對精液進行檢測，共檢測4 d的樣本。

由表1可知，24 h檢測顯示，6個不同含量的海藻糖條件下精子活率均高于80%，96 h檢測結(jié)果顯示，6個不同含量的海藻糖條件下精子活率均高于40%，其中海藻糖含量在2 g時，精子活率最高，達52.56%。24、48、96 h時，海藻糖含量為2 g時，肉羊精子活力最高（P<0.05）；72 h時，海藻糖含量為1.5 g時，肉羊精子活力最高（P<0.05）。

表1 不同含量海藻糖對肉羊精子活率的影響Tab.1 Effects of different trehalose content on sheep sperm motility 單位：%

2.2 不同含量卵黃對肉羊精子活率的影響（見表2）

由表2可知，24 h檢測結(jié)果顯示，5個含量卵黃條件的精子活率均高于80%，10 mL卵黃含量下，高達92.37%；96 h檢測結(jié)果顯示，5個含量卵黃條件下的精子活率均高于40%，其中卵黃含量為10 mL時，精子活率最高，達56.04%。

表2 不同含量卵黃對肉羊精子活率的影響Tab.2 Effect of different egg yolk content on sheep sperm motility 單位：%

3 討論

20世紀50年代，-79℃條件下，綿羊精液保存技術(shù)獲得較高的存活率[7]，但產(chǎn)羔率僅5%，說明冷凍后的精液雖然有較高的存活率，但是精子的受精能力卻遭到嚴重破壞。在0~4℃的低溫保存下，綿羊精子可存活長達167 h[3-4]。費俊陽等[6]研究表明，在0℃冰水混合的條件下，精子保存12 d的活率在70%以上?？追不⒌萚8]報道，鮮精常溫保存（20~25℃）中稀釋液的成分主要包括糖類、奶類、卵黃、緩沖物質(zhì)、抗生素及其他成分。本試驗中，糖類選擇海藻糖，海藻糖能有效維持細胞內(nèi)生物膜、蛋白質(zhì)、活性肽的穩(wěn)定性和完整性。海藻糖不僅是穩(wěn)定性的雙糖，在代謝過程中也是主要提供能量的物質(zhì)；還能有效保護DNA，保證精子基因的完整性[9-10]。由于當(dāng)前市場上的牛奶大多含有防腐劑等成分，會影響精子的活性，使用鮮奶保存精液的限制性較大。因此，選擇雞蛋維持精子活力、保護精子頂體等，雞蛋即不含化學(xué)添加物，又能保證無菌性[11]。

本試驗選擇11月份進行試驗，主要是在本地區(qū)該時間段是養(yǎng)殖場進行同期發(fā)情和人工授精等的交配期，該時期進行試驗?zāi)軌蚺c生產(chǎn)實際應(yīng)用緊密結(jié)合。本試驗從2019年2月開始。前期包括對采精方式進行探索，包括使用附睪孵育法、電刺激采經(jīng)法以及假陰道采精法。3種方法中，附睪孵育法對于試驗要求比較嚴格。據(jù)報道，公羊附睪的精子要比射出精液的精子對冷刺激適應(yīng)性強[12-13]。但是，由于精子含量以及精子的活躍狀態(tài)均明顯比另外2種方法差，因此該試驗方法首先被淘汰。電刺激采精[14]由于具有麻痹性而且是被動射精，影響精液的品質(zhì)[15-16]，因此得到的精液濃度低，精子活性也較低。最終，本試驗選用假陰道采精法進行采精。

本次試驗結(jié)果相對穩(wěn)定。不同含量卵黃條件下，卵黃含量為10 mL時，精子活率的穩(wěn)定性以及第4 d數(shù)值均比較好，第4 d的精子活率在50%以上，符合實際生產(chǎn)中授精的活力必須高于40%。不同含量海藻糖條件下，海藻糖含量為2 g時，精子活率在4 d連續(xù)測試的活率處于5個含量梯度最高，并且降幅相對穩(wěn)定，在第4 d高于50%以上，也符合實際生產(chǎn)需求。研究發(fā)現(xiàn)，在72 h時1.5 g海藻糖條件下要比2 g含量下精子活率略高，可能由于在該時間段2 g海藻糖含量略大，精子內(nèi)外滲透壓要比1.5 g含量的高，對精子吸收外界的物質(zhì)均有影響，而低含量下的海藻糖會對精子受滲透壓的影響較小。高滲壓會使精子輕度脫水，減緩新陳代謝速度，使活性精子運動減少[17]，會引起細胞器和細胞膜受損[18]，導(dǎo)致細胞膜上的磷脂質(zhì)丟失嚴重[19]，并會改變胞內(nèi)pH值[20-21]，增加精子的死亡率。因此，下一步研究應(yīng)該考慮精子受滲透壓的影響，探討各種保存劑的最佳濃度。

4 結(jié)論

按照鮮精輸精精子活率必須達到40%以上的要求，根據(jù)試驗結(jié)果，卵黃的含量在10 mL的情況下精子活率較好，海藻糖在2 g含量下精子活率較好。