雞胚卵內(nèi)注射技術(shù)研究進(jìn)展

李元昊，龐舒琪，王鵬程，姜立山，陳立思，魏 紫，胡庭俊，于美玲

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

卵內(nèi)注射技術(shù)最初是肉雞場(chǎng)接種馬立克氏病毒疫苗的一種疫苗接種技術(shù)[1]。1992年，Embrex公司研發(fā)出第一臺(tái)自動(dòng)化卵內(nèi)注射器，每小時(shí)可以接種25 000~62 000個(gè)雞蛋。隨著雞胚注射技術(shù)快速發(fā)展，新型的注射制劑因能提高雞的免疫力、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力和生長(zhǎng)性能。近5年，卵內(nèi)注射外源物質(zhì)的研究主要集中于以下7個(gè)方向：疫苗、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、益生菌、益生元和合生元。

1 雞胚卵內(nèi)注射疫苗

隨著卵內(nèi)注射疫苗的深入，Peebles[2]研究表明，雞胚孵化后期卵內(nèi)注射疫苗安全可靠，且通過(guò)雞胚卵內(nèi)注射疫苗可以快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使新生雛雞更早獲得抗體保護(hù)。

1.1 馬立克氏病疫苗

1982年，Sharma等[3]發(fā)現(xiàn)，卵內(nèi)接種馬立克氏病疫苗的雛雞比孵化后，再接種馬立克氏病疫苗的雛雞抵抗馬立克氏病毒感染的能力更強(qiáng)，保護(hù)指數(shù)可達(dá)85。美國(guó)超過(guò)80%的雞場(chǎng)通過(guò)卵內(nèi)注射馬立克氏病疫苗控制馬立克氏病[4]。Peebles等[5]研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于皮下注射馬利克氏病疫苗，卵內(nèi)注射可以獲得更高的嫩肉比率。

1.2 球蟲(chóng)病疫苗

艾美球蟲(chóng)會(huì)在動(dòng)物腸道內(nèi)發(fā)育，引發(fā)疾病和死亡，導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率和體重增長(zhǎng)率降低，使禽類(lèi)易患繼發(fā)性疾病，如壞死性腸炎。Sokale等[6]發(fā)現(xiàn)雞胚注射時(shí)間影響球蟲(chóng)疫苗的注射位置，影響雛雞的質(zhì)量。雞胚卵內(nèi)注射高劑量的球蟲(chóng)疫苗會(huì)降低孵化后雛雞的生長(zhǎng)性能[7]；而注射適當(dāng)劑量的球蟲(chóng)疫苗無(wú)副作用，是預(yù)防該疾病的最佳方法。

1.3 雞毒支原體疫苗

雞毒支原體可感染不同日齡和不同品種的雞，造成雞產(chǎn)蛋量下降。Elliott等[8]發(fā)現(xiàn)，給孵育第18 d的雞胚卵內(nèi)注射雞毒支原體疫苗，在孵化后6周齡雞體內(nèi)仍然可以檢測(cè)到較高水平的抗體，與減毒支原體苗皮下注射相比，雞胚卵內(nèi)注射疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平更高。卵內(nèi)注射雞毒支原體減毒活疫苗可引起病原水平傳播[9]；雞胚卵內(nèi)注射最低劑量（1×CFU/只）的雞毒支原體疫苗才能保證胚胎孵化率和出生后存活率[10]。

2 雞胚卵內(nèi)注射維生素

維生素E最早被用于卵內(nèi)注射以增強(qiáng)肉雞的體液和細(xì)胞免疫能力。近幾年的研究對(duì)象主要為：維生素C、維生素D3和維生素E。

2.1 維生素C

維生素C具有抗氧化功能，對(duì)癌癥、男性不育、退行性神經(jīng)疾病等有治療作用，對(duì)精神焦慮癥有緩解作用[11-15]。研究表明，雞胚卵內(nèi)注射維生素C可以提高雛雞脾臟內(nèi)干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、抗腫瘤因子-α（TNF-α）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）的mRNA表達(dá)水平[16-17]，提高雛雞的抗氧化能力和免疫力。卵內(nèi)注射維生素C還能提高熱休克蛋白的分泌量，降低高飼育溫度帶來(lái)的雛雞堿中毒的風(fēng)險(xiǎn)[18]，減少由于高飼育溫度帶來(lái)的生產(chǎn)損失。在孵育第11 d的時(shí)候卵內(nèi)注射維生素C可以增加孵育第16 d和第18 d的熱休克蛋白和代謝基因的表達(dá)，降低孵化后期胚胎過(guò)熱的風(fēng)險(xiǎn)[19]。給孵育第11 d雞胚卵內(nèi)注射3 mg維生素C，可以提高肉雞生長(zhǎng)早期體內(nèi)維生素C的含量，改善肉雞生長(zhǎng)性能和肉品質(zhì)[20]。研究表明，雞胚卵內(nèi)注射維生素C對(duì)雞胚孵化率無(wú)影響[21]，但雞胚卵內(nèi)注射維生素C對(duì)雞胚孵化時(shí)間的影響有待進(jìn)一步研究。

2.2 維生素D3

維生素D3可參與小腸鈣吸收[22-23]、維持鈣穩(wěn)態(tài)[24-25]、調(diào)控成骨細(xì)胞增殖分化[26]、影響骨骼代謝、促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)發(fā)育。Hayakawa等[27]發(fā)現(xiàn)，卵內(nèi)注射維生素D3可提高雌性淺胸肌中類(lèi)胰島素一號(hào)（IGF-1）受體的mRNA表達(dá)水平，使肝臟IGF-1受體的維生素D3區(qū)域的mRNA的表達(dá)量升高。Fatemi等[28]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向孵育第18 d的雞胚注射維生素D3，可以提高雞胚胎血清中的25-羥基膽鈣化固醇（維生素D3在肝臟中的中間產(chǎn)物）的濃度；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于雞胚卵內(nèi)注射維生素D3，卵內(nèi)注射25-羥基膽固醇鈣化醇的卵黃沉積形態(tài)和肉雞的生長(zhǎng)性能更好，且不影響雞胚溫度[29]。

2.3 維生素E

維生素E是細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑，可以防止不飽和脂質(zhì)物質(zhì)氧化，從而保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化損傷。缺乏維生素E時(shí)，會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化直接損傷組織細(xì)胞[30]。雞胚注射維生素E可以提高雞胚的孵化率，并提高雛雞的出生體重[31]。Araújo等[31]通過(guò)對(duì)孵育第17 d的雞胚進(jìn)行羊膜腔注射維生素E，可提高雛雞出生體重，提高飼料轉(zhuǎn)化率，但沒(méi)有增加脾臟或法氏囊重量或脾臟白髓的百分比，且由于該試驗(yàn)并沒(méi)有測(cè)試熱應(yīng)激狀態(tài)下的肉雞防御系統(tǒng)狀態(tài)，因此該試驗(yàn)中雞胚注射維生素E沒(méi)有展現(xiàn)出改善防御系統(tǒng)的能力。

3 雞胚卵內(nèi)注射氨基酸

最初進(jìn)行卵內(nèi)注射氨基酸的目的是提高肉雞生長(zhǎng)性能。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)卵內(nèi)注射氨基酸可以提高肉雞免疫力和改善肉質(zhì)。近5年關(guān)于L-型精氨酸和含硫氨基酸的研究取得一些突破性進(jìn)展。

3.1 L-型精氨酸

L-型精氨酸是肉雞生長(zhǎng)的必需氨基酸，但由于雞體內(nèi)缺乏合成L-型精氨酸的相關(guān)酶，因而雞無(wú)法通過(guò)內(nèi)源性合成獲得L型精氨酸[32]。通過(guò)卵內(nèi)注射適當(dāng)劑量的L-型精氨酸能提高雛雞的孵化率、免疫力、存活率[33]，還可以增加雞蛋內(nèi)部的胚胎肌肉量，從而增加雞胚重量[34]。多項(xiàng)研究表明，卵內(nèi)注射L型精氨酸可以提高雛雞的飼料轉(zhuǎn)化率和采食量，甚至能促進(jìn)雛雞腸道內(nèi)益生菌群的構(gòu)建，從而發(fā)揮促進(jìn)其生長(zhǎng)的作用[35-38]。

3.2 含硫氨基酸

通過(guò)對(duì)孵育第17.5 d的雞胚卵內(nèi)注射含硫氨基酸，可以提高GSH-Px基因的表達(dá)水平，提高機(jī)體抗氧化能力，改善脂質(zhì)分布和降低皮質(zhì)酮濃度，從而減輕雛雞熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激損傷[39]。

4 雞胚卵內(nèi)注射礦物質(zhì)

雞胚孵化早期，由于骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，雞胚對(duì)礦物質(zhì)的需求量高，但雞胚孵化早期的主要能量來(lái)源是卵黃，卵黃內(nèi)的微量元素通常不足以支持雞胚早期的骨骼生長(zhǎng)[40]。Oliveira等[41]研究發(fā)現(xiàn)，卵內(nèi)注射有機(jī)礦物質(zhì)有利于增加骨骼的重量。近5年卵內(nèi)注射的礦物質(zhì)主要是銅和鋅。

4.1 銅

銅（Cu）是涉及多種生理過(guò)程的關(guān)鍵微量礦物質(zhì)，在生產(chǎn)過(guò)程中大多數(shù)Cu會(huì)隨家禽糞便排出體外。Mroczek-Sosnowska等[42]發(fā)現(xiàn)，對(duì)1胚齡雞胚氣室注射銅可提高肉雞的銅利用率，卵內(nèi)注射銅可顯著提高肉雞體重，降低肉雞的料重比和死亡率。卵內(nèi)注射納米銅和硫酸銅可以減少雞腿中水分的含量，在不降低蛋白質(zhì)含量的情況下增加脂肪的含量，從而達(dá)到提高肉質(zhì)的目的，還可通過(guò)降低雛雞骨骼內(nèi)羥基賴氨酸的含量，從而增強(qiáng)雛雞抗骨折的能力[43]。采取卵內(nèi)注射銅元素可減少由飼料添加銅元素引起的環(huán)境污染。

4.2 鋅

鋅作為基本的微量元素之一，在肉雞生長(zhǎng)、免疫系統(tǒng)發(fā)育等方面具有重要作用。Jose等[44]嘗試通過(guò)卵內(nèi)注射不同種類(lèi)的鋅來(lái)達(dá)到提前補(bǔ)充鋅元素的目的，發(fā)現(xiàn)向卵內(nèi)注射0.50 mg、0.25 mg納米鋅或0.5 mg蛋氨酸鋅會(huì)導(dǎo)致雞胚死亡，但卵內(nèi)注射0.08 mg或0.04 mg的納米鋅可以使雞胚孵化率提高到80%。Sun等[45]發(fā)現(xiàn)，給由缺鋅的母雞產(chǎn)下的受精蛋卵內(nèi)注射鋅，可以提高雞胚的孵化率，提高破殼后雛雞的健康率，且有機(jī)鋅比無(wú)機(jī)鋅的效果更好。據(jù)報(bào)道，卵內(nèi)注射鋅可以促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫基因的表達(dá)[46]，其可能是提高破殼后雛雞健康率的原因之一。

4.3 硒

硒是一種必需的非金屬微量元素，可調(diào)節(jié)人類(lèi)和動(dòng)物免疫和抗氧化系統(tǒng)等生理功能。硒缺乏會(huì)提高機(jī)體對(duì)傳染病的易感性，并利于病原體定殖，增強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)。Lee等[47]發(fā)現(xiàn)，對(duì)第18胚齡的雞胚卵內(nèi)注射硒，可以顯著降低壞死性腸炎對(duì)肉雞體重的影響，減輕腸道損傷，并且有利于提高患?jí)乃佬阅c炎雛雞的免疫和抗氧化能力，對(duì)壞死性腸炎所致機(jī)體損傷起到保護(hù)作用。Mahmoud[48]發(fā)現(xiàn)，卵內(nèi)注射乳桿菌與納米硒可以提高雛雞血清過(guò)氧化氫酶（CAT）、GSH-Px和SOD的活性，有利于提高肉雞的免疫能力和抗氧化能力。卵內(nèi)注射卵磷脂硒可以通過(guò)調(diào)控肉雞促炎和抗氧化基因的表達(dá)及其下游通路來(lái)增強(qiáng)對(duì)雞壞死性腸炎的保護(hù)作用[49]。

5 雞胚卵內(nèi)注射益生菌

益生菌具有增強(qiáng)雛雞免疫力、提高生長(zhǎng)性能等功能，近幾年才被用于雞胚卵內(nèi)注射。在雛雞孵化前，蛋內(nèi)是無(wú)菌環(huán)境，雛雞出生后與外界環(huán)境接觸后，益生菌才定植和繁殖，建立腸道微生態(tài)環(huán)境。建立菌群生態(tài)平衡前，雛雞易感染致病菌。卵內(nèi)注射益生菌，可使雛雞在胚蛋時(shí)期實(shí)現(xiàn)益生菌群的初步構(gòu)建，進(jìn)而促進(jìn)雛雞生長(zhǎng)和提高機(jī)體免疫力[50]。

5.1 雙歧桿菌

雙歧桿菌因可以提高動(dòng)物飼料轉(zhuǎn)化率，提高機(jī)體非特異性免疫力，而被用于替代生長(zhǎng)促進(jìn)劑。研究發(fā)現(xiàn)，卵內(nèi)注射雙歧桿菌對(duì)胚胎的孵化率和污染率沒(méi)有影響，是卵內(nèi)注射益生菌候選菌[51]。El-Moneim等[52]將雙歧桿菌注射至孵育第17 d的雞胚卵黃內(nèi)，能夠增加雛雞血紅細(xì)胞含量，并顯著促進(jìn)了回腸的發(fā)育，提高雛雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，對(duì)孵化率影響較小。Abdel-Moneim等[53]發(fā)現(xiàn)，卵內(nèi)注射雙歧桿菌可以增加雛雞體內(nèi)甲狀腺激素的含量，提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率，并降低雛雞感染腸道致病菌的風(fēng)險(xiǎn)。

5.2 枯草芽孢桿菌

枯草芽孢桿菌是雞體內(nèi)重要的益生菌之一。研究發(fā)現(xiàn)，將枯草芽孢桿菌注射到羊水中有利于回腸MUC2基因表達(dá)，并且有益于腸道內(nèi)的細(xì)菌菌群的構(gòu)建，但對(duì)肉雞的生長(zhǎng)性能和免疫反應(yīng)沒(méi)有影響[54]。在最新的研究中，Oladokun等[55]發(fā)現(xiàn)，雖然卵內(nèi)注射枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能和腸道穩(wěn)態(tài)沒(méi)有影響，但是卵內(nèi)注射枯草芽孢桿菌可顯著提高肉雞空腸絨毛高度。

6 雞胚卵內(nèi)注射益生元

益生元一般指一些不被宿主消化吸收的有機(jī)物質(zhì)，其能夠選擇性地促進(jìn)體內(nèi)有益菌的代謝和增殖，從而改善宿主健康。常見(jiàn)的益生元主要有：果糖、半乳聚糖和膳食纖維，家禽行業(yè)常用的益生元一般是不易消化的寡糖，包括低聚果糖、菊粉、甘露寡糖、低聚木糖、低聚半乳糖和低聚異麥芽糖。益生元可以增強(qiáng)腸黏膜屏障功能[56]，選擇性地刺激腸道內(nèi)益生菌的數(shù)量等[57-58]，從而改善雞的生產(chǎn)性能。目前，常用的卵內(nèi)注射的益生元是低聚半乳糖和棉籽糖。

6.1 低聚半乳糖

低聚半乳糖具有維持腸黏膜屏障，降低炎癥反應(yīng)的功能。Slawinska等[59]研究發(fā)現(xiàn)，卵內(nèi)注射低聚半乳糖可以調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)促進(jìn)腸道健康，可減輕脾臟中熱誘導(dǎo)的免疫和應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，卵內(nèi)注射低聚半乳糖可有效提高肉雞對(duì)環(huán)境壓力的適應(yīng)能力。研究表明，卵內(nèi)注射低聚半乳糖可以提高盲腸和空腸中細(xì)胞因子IL-1β，IL-10和IL-12 p40的表達(dá)量，增加盲腸中宿主防御肽（AvBD1和CATHL2）的表達(dá)量，并且提高腸道內(nèi)游離脂肪酸受體的含量，減少十二指腸中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白量，提高十二指腸后腸道的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白量，調(diào)節(jié)肉雞的能量代謝，維持雞腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[60-61]。

6.2 棉籽糖

棉籽糖是由半乳糖，葡萄糖和果糖組成的三糖。棉籽糖存在于豆類(lèi)、卷心菜、抱子甘藍(lán)、西蘭花、蘆筍和所有的谷物中。棉籽糖可以被α-半乳糖苷酶（α-GAL）水解為D-半乳糖和蔗糖。Berrocoso等[62]發(fā)現(xiàn)，卵內(nèi)注射棉籽糖可以改善腸道黏膜形態(tài)，提高小腸免疫力。Stadnicka等[63]通過(guò)對(duì)孵育第12 d雞胚注射棉籽糖，研究發(fā)現(xiàn)卵內(nèi)注射棉籽糖可以提高腸道微絨毛表面積并減少梭狀芽孢桿菌和減少球菌數(shù)而更好地抵抗條件性致病菌。近5年，卵內(nèi)注射益生元的研究越來(lái)越多，卵內(nèi)注射益生元領(lǐng)域是重要的研究方向，該方向具有巨大潛力。

7 雞胚卵內(nèi)注射合生元

合生元主要是指益生元與益生菌復(fù)合物，這種復(fù)合產(chǎn)物通過(guò)選擇性地刺激有益菌的生長(zhǎng)和/或激活其代謝，改善膳食補(bǔ)充劑中微生物的存活和其在胃腸道中的定植[64]。雞胚卵內(nèi)注射不同組合的合生元可以促進(jìn)雞的生長(zhǎng)，提高雞肉品質(zhì)。Dankowiakowska等[65]發(fā)現(xiàn)，使用菊粉和乳酸桿菌混合的合生元進(jìn)行卵內(nèi)注射可以提高肉雞重量，并使得雞胸肌中糖酵解纖維的百分比顯著增加。Dunislawska等[66]發(fā)現(xiàn)，卵內(nèi)注射菊粉和乳酸桿菌可以提高能量代謝和免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)量。Maiorano等[67]發(fā)現(xiàn)，使用雙歧桿菌消化的牛奶乳糖中的非消化性反式低聚半乳糖Bi2tos進(jìn)行卵內(nèi)注射可以使得肉雞體重顯著增加，胸肌產(chǎn)量顯著增加。

8 結(jié)論

隨著我國(guó)飼料全面禁抗政策的執(zhí)行，通過(guò)雞胚注射疫苗提高雛雞免疫力、抗病力和生產(chǎn)性能具有良好的發(fā)展前景和市場(chǎng)需求。通過(guò)雞胚注射疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，減少流行性疾病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。