氧化應(yīng)激狀態(tài)下仔豬海馬差異表達(dá)miRNAs與轉(zhuǎn)錄組的關(guān)聯(lián)分析

張 晨，馮露秋，林海爛，黃子晴，王乃秀，甘 玲，2*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 402460)

在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，因營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境及管理不當(dāng)?shù)纫蛩匾鸬难趸瘧?yīng)激與仔豬疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]，極大地限制了畜牧業(yè)的發(fā)展。哺乳動(dòng)物腦組織海馬體是參與應(yīng)激調(diào)控的重要區(qū)域[3]，在應(yīng)激條件下，腦海馬的背、腹側(cè)區(qū)域展示了不同的基因表達(dá)譜和功能特征[4]，對(duì)生命過(guò)程的參與及對(duì)外界的刺激有不同的響應(yīng)和調(diào)節(jié)。如磷酸二酯酶11A4在嚙齒動(dòng)物腹側(cè)海馬中的表達(dá)量為背側(cè)的3～10倍[5]；空間學(xué)習(xí)障礙與海馬背側(cè)病變呈正相關(guān)，卻與腹側(cè)的病變無(wú)顯著相關(guān)性[6]。

miRNA是哺乳動(dòng)物腦組織中大量表達(dá)的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，主要通過(guò)和靶基因3′非翻譯區(qū) (3′UTR) 結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[7]，參與生長(zhǎng)、凋亡和應(yīng)激等生物學(xué)過(guò)程，是生物基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的重要組成成分[8]。迄今，已從各種生物中鑒定出數(shù)百種不同的miRNA，開(kāi)發(fā)了如Miranda、TargetScan等靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件，以搜索miRNA潛在的靶基因[9]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)與神經(jīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[10]。如miR-9通過(guò)下調(diào)軸突指導(dǎo)基因軸突導(dǎo)向因子(NTN1)和結(jié)直腸癌缺失基因(DCC)參與周?chē)窠?jīng)再生過(guò)程[11]；抑制miR-21可以調(diào)節(jié)Müller細(xì)胞膠質(zhì)增生促進(jìn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和功能的恢復(fù)[12]。然而，當(dāng)前在仔豬海馬背、腹側(cè)區(qū)域中參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的miRNA靶向調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，一定程度地阻礙了對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)性疾病病理機(jī)制的探索。因此，本研究基于前期投放到GEO中的氧化應(yīng)激仔豬海馬背、腹側(cè)miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集和海馬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，開(kāi)展miRNA-mRNA表達(dá)關(guān)聯(lián)分析，以解析氧化應(yīng)激狀態(tài)下，仔豬腦海馬中參與調(diào)控的靶標(biāo)分子及相關(guān)的信號(hào)通路，為仔豬氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)性疾病病理機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)材料的來(lái)源與說(shuō)明

本研究使用的數(shù)據(jù)材料來(lái)自團(tuán)隊(duì)前期自身投放于基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)中登錄號(hào)為GSE76007、GSE76941的數(shù)據(jù)集。采用的動(dòng)物為7日齡榮昌仔豬。其中，氧化應(yīng)激組仔豬(4頭)在出生后的第3和4天被肌內(nèi)注射右旋糖酐鐵，成功誘發(fā)了氧化應(yīng)激，而對(duì)照組仔豬(4頭)在相同時(shí)間同一部位被注射相同劑量的滅菌生理鹽水。麻醉7日齡仔豬，分別采集腦組織背、腹側(cè)海馬，于液氮中速凍后，保存于-80 ℃，用于文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序[13]。GSE76007為采用RNA-seq技術(shù)(Hiseq 2500)獲取的對(duì)照組和氧化應(yīng)激仔豬海馬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，含有11.5 Gb測(cè)序原始數(shù)據(jù)和經(jīng)加工處理過(guò)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平列表。GSE76941為通過(guò)RNA-seq技術(shù)(Hiseq 2500)獲取的對(duì)照組和氧化應(yīng)激組仔豬背、腹側(cè)海馬的miRNA表達(dá)譜，其中，有4個(gè)讀取長(zhǎng)度為50的對(duì)照組仔豬腦背側(cè)海馬miRNA、腹側(cè)海馬miRNA和氧化應(yīng)激組仔豬腦背側(cè)海馬miRNA、腹側(cè)海馬miRNA樣品的原始數(shù)據(jù)文件以及在所有樣品中表達(dá)保守的、已知的和新的miRNA 3個(gè)加工數(shù)據(jù)。團(tuán)隊(duì)前期還基于GSE76941數(shù)據(jù)集，采用Edger軟件包的qCML方法進(jìn)行精確檢驗(yàn)，篩選了DE miRNA。篩選的條件是miRNA的P值<0.05，并去除log2FC為NA的miRNA。并進(jìn)一步采用Miranda軟件預(yù)測(cè)DE miRNAs的靶基因序列，其中，腹側(cè)海馬DE miRNAs靶向了38 805條基因序列，背側(cè)海馬DE miRNAs靶向了64 276條基因序列[13]。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

1.2.1 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)和篩選 本研究基于GSE76941數(shù)據(jù)集，采用TargetScan軟件預(yù)測(cè)海馬背、腹側(cè)差異miRNA的靶基因。并基于GSE76007數(shù)據(jù)集，將DE mRNAs (P<0.05)與上述預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行重疊篩選，交集即為DE miRNAs潛在的靶基因。

1.2.2 DE miRNA與DE mRNA的作用關(guān)系分析 由于miRNA靶基因的表達(dá)模式通常與miRNA呈負(fù)相關(guān)，因此，為解析氧化應(yīng)激狀態(tài)下，仔豬背、腹側(cè)海馬DE miRNA參與調(diào)節(jié)的靶mRNA，本研究從“1.2.1”的結(jié)果中篩選出與miRNA表達(dá)趨勢(shì)相反的mRNAs，然后根據(jù)其作用關(guān)系構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape[14]軟件進(jìn)行可視化作圖。

1.2.3 DE miRNA靶向mRNA的GO分類(lèi)和KEGG信號(hào)途徑富集分析 GO是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類(lèi)系統(tǒng)，常用來(lái)描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。KEGG是信號(hào)通路的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異表達(dá)基因的KEGG富集分析可進(jìn)一步揭示參與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。因此，為了評(píng)估氧化應(yīng)激狀態(tài)下DE miRNA-mRNA靶基因?qū)Πl(fā)揮的生物學(xué)功能和參與的信號(hào)途徑，本研究采用pathview package,Category package,org.Ss.eg.db package,GO stats package,KEGG.db package,GO.db package,RSQLite package[15-16]軟件對(duì)篩選到受DE miRNAs負(fù)調(diào)控的DE mRNAs進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.2.4 DE miRNA靶向mRNA的功能邏輯推演 為深入挖掘仔豬腦海馬背、腹側(cè)區(qū)域參與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的miRNA潛在靶基因，本研究基于“1.2.2”和“1.2.3”的結(jié)果，將miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、GO和KEGG功能結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步功能邏輯推演。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)篩選

本研究采用的GSE76941數(shù)據(jù)集，共含有3 818個(gè)DE miRNAs。作者將預(yù)測(cè)的DE miRNAs靶基因與GSE76007數(shù)據(jù)集DE mRNA進(jìn)行重疊篩選，篩選結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 氧化應(yīng)激狀態(tài)下仔豬海馬各部位差異表達(dá)的miRNAs和mRNAs 數(shù)量Table 1 The number of miRNAs and mRNAs differentially expressed in various parts of the hippocampus of piglets under oxidative stress

2.2 miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

為了直觀地展示在氧化應(yīng)激狀態(tài)下大鼠腦海馬組織中miRNAs和mRNAs之間的互作關(guān)系，基于“2.1”重疊篩選的結(jié)果，作者構(gòu)建了miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖1～4)。其中，背側(cè)有110對(duì)上調(diào)DE miRNA-下調(diào)DE mRNA，129對(duì)上調(diào)DE miRNA-上調(diào)DE mRNA(包括15個(gè)新的miRNAs)；92對(duì)下調(diào)DE miRNA-下調(diào)DE mRNA，199對(duì)下調(diào)DE miRNA-上調(diào)DE mRNA(包括14個(gè)新的miRNAs)。腹側(cè)有93對(duì)上調(diào)DE miRNA-下調(diào)DE mRNA，146對(duì)上調(diào)DE miRNA-上調(diào)DE mRNA(包括12個(gè)新的miRNAs)；82對(duì)下調(diào)DE miRNA-下調(diào)DE mRNA，154對(duì)下調(diào)DE miRNA-上調(diào)DE mRNA(包括11個(gè)新的miRNAs)。由此可見(jiàn)，在負(fù)向調(diào)控的DE miRNA-DE mRNA靶基因?qū)χ校硞?cè)有309對(duì)，腹側(cè)有247對(duì)，其中，在已知的DE miRNAs靶標(biāo)對(duì)中，背側(cè)有2對(duì)上調(diào)DE miRNA-下調(diào)DE mRNA，65對(duì)下調(diào)DE miRNA-上調(diào)DE mRNA；腹側(cè)有3對(duì)上調(diào)DE miRNA-下調(diào)DE mRNA，38對(duì)下調(diào)DE miRNA-上調(diào)DE mRNA(圖1、2)。

2.2.1 氧化應(yīng)激狀態(tài)下仔豬腦海馬背側(cè)區(qū)域差異表達(dá)的miRNAs靶向mRNAs的關(guān)聯(lián)分析 根據(jù)miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，在海馬背側(cè)區(qū)域負(fù)向調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)互作圖中，僅有miR-452為背側(cè)上調(diào)的已知miRNAs(圖1A)；背側(cè)下調(diào)的miR-676-5p靶向上調(diào)了JAK2等基因。此外，背側(cè)下調(diào)的多個(gè)miRNAs共同靶向1個(gè)或多個(gè)基因，如下調(diào)的miR-205、miR-216同時(shí)靶向上調(diào)了DDX58等基因，下調(diào)的miR-490-5p和miR-7138-5p靶向上調(diào)了PPP3CA等基因。下調(diào)的miR-490-5p和miR-96-5p共同靶向上調(diào)了整合素亞基α3(ITGA3)，下調(diào)的miR-96-5p和miR-205共同靶向上調(diào)了金屬蛋白酶-1(MMP1)(圖1B)。

2.2.2 氧化應(yīng)激狀態(tài)下，仔豬腦海馬腹側(cè)區(qū)域差異表達(dá)的miRNAs靶向mRNAs的關(guān)聯(lián)分析 在海馬腹側(cè)區(qū)域負(fù)向調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)互作圖中，腹側(cè)上調(diào)的miR-133a-5p靶向下調(diào)了TFRC、SCUBE1與ATP9B基因(圖2A)，腹側(cè)下調(diào)的miR-429靶向上調(diào)了RELN、DDX58等基因；腹側(cè)下調(diào)的miR-183和背側(cè)下調(diào)的miR-216均靶向上調(diào)骨膜素(POSTN)。miR-183家族成員miR-183和miR-96-5p有兩個(gè)共同的調(diào)控基因MMP1和ITGA3(圖2B)。由此可見(jiàn)，仔豬海馬背、腹側(cè)miRNA在氧化應(yīng)激下對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)中具有協(xié)同性和發(fā)散性。

2.3 功能與途徑富集分析

分別對(duì)篩選到的海馬背腹側(cè)靶向DE mRNAs進(jìn)行的GO分類(lèi)和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)海馬背側(cè)靶向上調(diào)的DE mRNAs在300條GO terms中富集(P<0.05)，靶向下調(diào)的DE mRNAs在237條GO terms中富集(P<0.05)；海馬腹側(cè)靶向上調(diào)的DE mRNAs在359條GO terms 中富集(P<0.05)，靶向下調(diào)的DE mRNAs在214條GO terms中富集(P<0.05)(表2)。其中，主要功能及富集的信號(hào)通路如表2所示。

2.4 氧化應(yīng)激狀態(tài)下仔豬腦海馬背、腹側(cè)區(qū)域DE miRNAs靶向DE mRNAs的功能推演

GO分類(lèi)比較分析發(fā)現(xiàn)，在miRNA靶向上調(diào)的基因中，背、腹側(cè)有247條共同功能，主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞因子等刺激的反應(yīng)調(diào)控方面(如miR-183/POSTN、miR-216/POSTN)(圖3A)。POSTN在膠質(zhì)瘤侵襲和抗血管生成治療的抵抗中起著重要作用[17]，因此，miR-183/POSTN、miR-216/POSTN可能參與了仔豬海馬對(duì)應(yīng)激的抵抗。

背側(cè)上調(diào)的靶基因特定地參與了對(duì)機(jī)械、生物刺激的反應(yīng)和免疫過(guò)程等(如miR-676-5p/JAK2)(圖3A)。JAK2/STAT3通路廣泛參與細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)效應(yīng)；抑制JAK2/STAT3通路減少了白質(zhì)損傷導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)元的凋亡[18]，而激活JAK2能調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化[19]，因此，miR-676-5p/JAK2可能介導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞的存活及免疫調(diào)節(jié)作用。腹側(cè)上調(diào)的靶基因則特異地參與生物合成過(guò)程等(如miR-183/IRF1) (圖3A)。在急性應(yīng)激下，哺乳動(dòng)物海馬中miR-183的表達(dá)顯著升高[20]。而miR-183、miR-182和miR-96-5p作為同一家族成員均可靶向神經(jīng)肽基因，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元生理活性和氧化應(yīng)激等[19]。充分體現(xiàn)了基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的協(xié)同性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)海馬腹側(cè)下調(diào)miR-183的10個(gè)下游靶點(diǎn)(圖2B)。其中，IFR1可以調(diào)節(jié)多種免疫相關(guān)基因的表達(dá)[21]；MMP1是加重視神經(jīng)頭部損害的危險(xiǎn)因素[22]；ITGA3是突觸前膜上的黏附受體，調(diào)節(jié)突觸神經(jīng)肌肉接頭的完整性[23]。由此推測(cè)，表達(dá)下調(diào)的miRNA-183，可以促進(jìn)與神經(jīng)及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)基因的表達(dá)，從而抵抗氧化應(yīng)激帶來(lái)的神經(jīng)損傷。此外，腹側(cè)下調(diào)的miR-183、miR-96-5p和背側(cè)下調(diào)的miR-96-5p、miR-205的共同靶點(diǎn)均為MMP1，提示仔豬海馬背、腹側(cè)通過(guò)調(diào)節(jié)不同的miRNAs靶向相關(guān)基因共同參與對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)性疾病的調(diào)控。

A.氧化應(yīng)激狀態(tài)下，上調(diào)的miRNA負(fù)向調(diào)控的mRNA；B.氧化應(yīng)激狀態(tài)下，下調(diào)的miRNA負(fù)向調(diào)控的mRNAA.Upregulated miRNA negatively regulates mRNA under oxidative stress;B.Downregulated miRNA negatively regulates mRNA under oxidative stress圖1 仔豬背側(cè)海馬miRNA靶向mRNA的局部關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Local association network map of miRNA-targeted mRNA in dorsal hippocampus of piglets

miRNA靶向下調(diào)的基因中，主要具有對(duì)細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等方面的調(diào)控作用。其中，離子運(yùn)輸、穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等是背側(cè)下調(diào)靶基因的特有功能，而腹側(cè)下調(diào)的靶基因則特定地參與對(duì)細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過(guò)程的調(diào)控(如miR-133-5p/TFRC) (圖3B)。在敲除肝素誘導(dǎo)的神經(jīng)疾病模型中，TFRC表達(dá)增加[24]，而TFRC可以促進(jìn)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移[25]。因此，海馬腹側(cè)上調(diào)miR-133a-5p靶向下調(diào)TFRC可能通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移對(duì)神經(jīng)疾病進(jìn)行調(diào)控。

為深入挖掘仔豬海馬中參與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的主要靶基因，將表達(dá)最多的20條功能注釋中|log2FC|>1，P<0.05的DE mRNAs與miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)了背側(cè)3個(gè)差異表達(dá)的靶基因(表3)。其中，MX1是一種抗病毒基因，可以抵抗豬瘟病毒等[26]；PDK4的激活可以促進(jìn)小鼠肝的再生[27]；IFIT2可以抵抗小鼠肝炎病毒誘發(fā)的腦炎[28]。由此推測(cè)，miR-676-5p和miR-216很可能在氧化應(yīng)激狀態(tài)下通過(guò)降低自身的表達(dá)量，誘發(fā)對(duì)抗外界刺激作用的靶基因表達(dá)，直接或間接地發(fā)揮抗病毒、抗刺激作用，從而減輕機(jī)體細(xì)胞的損傷。但它們是否參與了對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡及免疫信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步研究。

表3 氧化應(yīng)激狀態(tài)下，仔豬腦海馬背側(cè)差異極顯著的DE mRNAsTable 3 Under oxidative stress,the DE mRNAs in the dorsal hippocampus of piglets are significantly different

A.氧化應(yīng)激狀態(tài)下，上調(diào)的miRNA負(fù)向調(diào)控的miRNA-mRNA；B.氧化應(yīng)激狀態(tài)下，下調(diào)的miRNA負(fù)向調(diào)控的miRNA-mRNAA.Upregulated miRNA negatively regulates miRNA-mRNA under oxidative stress;B.Downregulated miRNA negatively regulates miRNA-mRNA under oxidative stress圖2 仔豬腹側(cè)海馬miRNA靶向mRNA的局部關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Local association network map of miRNA-targeted mRNA in ventral hippocampus of piglets

綜上可見(jiàn)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，仔豬海馬背、腹側(cè)區(qū)域均發(fā)揮了調(diào)控細(xì)胞凋亡、穩(wěn)態(tài)平衡和對(duì)外界的應(yīng)激反應(yīng)等方面的功能，同時(shí)，也具有區(qū)域特異性反應(yīng)。背側(cè)腦海馬大量miRNAs表達(dá)下降，增加了抗應(yīng)激靶基因的表達(dá)，以達(dá)到抵抗外界刺激、提高生物活性、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的作用。而腹側(cè)腦海馬區(qū)下調(diào)的miRNAs大多增加了與神經(jīng)相關(guān)疾病基因的表達(dá)，暗示其對(duì)神經(jīng)性疾病的調(diào)節(jié)。

2.5 氧化應(yīng)激狀態(tài)下，海馬背、腹側(cè)區(qū)域DE miRNAs靶向DE mRNAs的通路推演

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-216、miR-205和miR-429靶向上調(diào)的DDX58富集于丙型肝炎感染信號(hào)通路和RIG-I樣受體信號(hào)通路；miR-7138-5p和miR-490-5p靶向上調(diào)的PPP3CA富集于鈣信號(hào)通路。有研究顯示，丙型肝炎病毒感染可引發(fā)中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)異常[29]；RIG-I樣受體信號(hào)通路的破壞，會(huì)抑制抗病毒反應(yīng)，誘發(fā)神經(jīng)癥狀，促進(jìn)豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟的感染[30-31]；激活的鈣信號(hào)通路可預(yù)防鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病[32]。這表明在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，miR-216、miR-205和miR-429均可能靶向上調(diào)DDX58，促進(jìn)RIG-I樣受體信號(hào)通路的激活；miR-7138-5p和miR-490-5p則可以上調(diào)PPP3CA，激活鈣信號(hào)通路，以此來(lái)消除由病毒等其他刺激引起的氧化應(yīng)激，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)海馬背、腹側(cè)少量上調(diào)的miRNA靶向下調(diào)的mRNA均主要富集在ECM受體相互作用、阿米巴病等通路中。ECM受體不僅影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，還有助于維持神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)，具有介導(dǎo)學(xué)習(xí)和記憶能力[33]；阿米巴病信號(hào)通路則直接與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)[34]。因此，ECM受體相互作用和阿米巴病信號(hào)通路很可能在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦神經(jīng)疾病中起重要作用。以上分析顯示，仔豬海馬背、腹側(cè)的miRNA-mRNA對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)共性調(diào)節(jié)功能的同時(shí)，也發(fā)揮了獨(dú)特的與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的調(diào)控作用。

A.氧化應(yīng)激狀態(tài)下背腹側(cè)差異表達(dá)的miRNAs靶向上調(diào)的mRNAs的GO注釋?zhuān)籅.氧化應(yīng)激狀態(tài)下背腹側(cè)差異表達(dá)的miRNAs靶向下調(diào)的mRNAs的GO注釋。A圖左圓為背側(cè)上調(diào)的mRNAs注釋條數(shù)、A圖右圓為腹側(cè)上調(diào)的mRNAs注釋條數(shù)，B圖左圓為背側(cè)下調(diào)的mRNAs注釋條數(shù)、B圖右圓為腹側(cè)下調(diào)的mRNAs注釋條數(shù)A.GO annotation of differentially expressed miRNA targeting up-regulated mRNA in the dorsal ventral side under oxidative stress;B.GO annotation of differentially expressed miRNA targeting down-regulated mRNA in the dorsal ventral side under oxidative stress;The left circle of Fig.A is the number of up-regulated mRNA annotation bars in the dorsal side;The right circle of Fig.A is the number of up-regulated mRNA annotation bars in the ventral side;The left circle of Fig.B is the number of down-regulated mRNA annotation bars in the dorsal side;The right circle of Fig.B is the number of down-regulated mRNA annotation bars圖3 仔豬腦海馬背、腹側(cè)差異表達(dá)mRNA的GO注釋比較分析Fig.3 Comparison of GO annotation of differentially expressed mRNA in dorsal and ventral hippocampus of piglets

3 討 論

機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡將導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激造成的機(jī)體損傷是動(dòng)物防御機(jī)能下降和疾病發(fā)生與發(fā)展的重要因素。miRNA是新興ROS化學(xué)分子介體[35]，具有高保守性，是生物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成成分。它們廣泛參與胚胎早期發(fā)育、細(xì)胞增殖分化等生理過(guò)程[36]。由此推測(cè)，miRNA 很可能通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因參與氧化應(yīng)激及抗氧化過(guò)程。

本研究通過(guò)系統(tǒng)開(kāi)展氧化應(yīng)激仔豬腦海馬背、腹側(cè)差異表達(dá)miRNA和mRNA的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)海馬背側(cè)7個(gè)已知miRNAs和54個(gè)基因之間存在66個(gè)互作(圖1)，腹側(cè)7個(gè)已知miRNAs和37個(gè)基因之間存在41個(gè)互作(圖2)。氧化應(yīng)激導(dǎo)致仔豬腦海馬背、腹側(cè)區(qū)域均有大量的miRNA下調(diào)，這與前人報(bào)道的在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，大鼠海馬中表達(dá)下調(diào)的miRNA多于表達(dá)增加的miRNA[20]相似。miRNA靶向的11個(gè)基因(POSTN、JAK2、TFRC、IFR1、MMP1、ITGA3、MX1、IFIT2、PDK4、DDX58和PPP3CA)均直接或間接地參與了氧化應(yīng)激或抗應(yīng)激損傷的相關(guān)路徑[35,37-38]。

結(jié)合GO分類(lèi)和KEGG分析進(jìn)行功能推演，本研究發(fā)現(xiàn)，7對(duì)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下差異表達(dá)的miRNA-mRNA(海馬背側(cè)的miR-676-5p/JAK2、miR-205/MMP1和海馬腹側(cè)的miR-133a-5p/TFRC、miR-183/MMP1、miR-183/ITGA3、miR-96-5p/ITGA3及miR-96-5p/MMP1)很可能是神經(jīng)性疾病調(diào)節(jié)的潛在靶點(diǎn)。此外，miR-452被發(fā)現(xiàn)在海馬背側(cè)區(qū)域上調(diào)，在腹側(cè)區(qū)域下調(diào)。下調(diào)的miR-452可以增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力[39]；而miR-452的過(guò)表達(dá)能作用不同的靶點(diǎn)抑制肺癌、胰腺癌[39-40]等癌細(xì)胞的遷移和侵襲，由此提示，海馬不同區(qū)域的相同miRNA可能采用不同的表達(dá)模式參與對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)。與此同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)海馬背側(cè)下調(diào)的miR-216與miR-205，miR-490-5p與miR-7138-5p，miR-490-5p與miR-96-5p，miR-96-5p與miR-205均有共同靶向上調(diào)的基因，這極大地豐富了氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)性疾病的調(diào)節(jié)信息。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)氧化應(yīng)激仔豬海馬背、腹側(cè)差異表達(dá)miRNA-mRNA的關(guān)聯(lián)分析，表明在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，海馬背、腹側(cè)能通過(guò)差異表達(dá)miRNAs以協(xié)同或發(fā)散的方式對(duì)mRNAs進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)，并體現(xiàn)了海馬背、腹側(cè)參與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的共性與特性。GO和KEGG的分析進(jìn)一步揭示miR-676-5p/JAK2、miR-205/MMP1、miR-133a-5p/TFRC、miR-183/MMP1、miR-183/ITGA3、miR-96-5p/ITGA3及miR-96-5p/MMP1可能是參與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的重要靶標(biāo)，從而為氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)性疾病臨床防控和治療提供了參考。