枯草芽胞桿菌DarA蛋白的鑒定及其原核表達

于秀菊，孫 錚，韓小濤，李鈺鈺，于 淼，董常生*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，太谷 030801；2.遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽 110005)

芽胞桿菌是一類常見的革蘭陽性細菌，是動植物微生態(tài)的優(yōu)勢菌之一，不僅種類繁多，而且來源廣泛，存在于土壤、海洋、植被、食物及動物腸道等多種樣品中[1-2]，其產(chǎn)生的芽胞可在高溫、高壓、強酸、強堿等多種極端環(huán)境中生存，具有較強的耐受能力[3-4]。芽胞桿菌代謝產(chǎn)生的細菌素分為修飾后細菌素(Ⅰ類)、無修飾細菌素(Ⅱ類)和具有磷酸酶活性的大分子蛋白(Ⅲ類)，而有些在遺傳、分子或氨基酸結(jié)構(gòu)等方面缺乏數(shù)據(jù)，無法按照分類法進行分類的抗菌蛋白，統(tǒng)稱為類細菌素[5]。芽胞桿菌產(chǎn)生的細菌素和類細菌素是繼乳酸菌細菌素之后的又一類重要的細菌素[6]，與乳酸菌產(chǎn)生的細菌素相比，芽胞桿菌細菌素抗菌譜更廣，包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、酵母和真菌，并且具有耐酸堿、耐高溫的特性。這些特性提示了芽胞桿菌產(chǎn)生的(類)細菌素具有廣泛的應(yīng)用前景[7-8]。

據(jù)研究報道，多種芽胞桿菌可以代謝產(chǎn)生細菌素或類細菌素，例如地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)、枯草芽胞桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)和凝結(jié)芽胞桿菌(B.coagulans)等[5]。近十年，從芽胞桿菌中分離出的細菌素或類細菌素有50余種，如Xin等[9]從分離自藏豬腸道的枯草芽胞桿菌TS的發(fā)酵產(chǎn)物中純化到細菌素TP，該細菌素為相對分子質(zhì)量約1.5 ku的肽，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性；Ayed等[10]從解淀粉芽胞桿菌An6發(fā)酵產(chǎn)物中分離到約11 ku的類細菌素，該類細菌素在pH 4.0～10.0條件下仍具有抑菌活性；Sharma等[11]對枯草芽胞桿菌GAS101所產(chǎn)細菌素的抑菌活性和作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)該細菌素對大腸桿菌和表皮葡萄球菌具有抑制作用，且具有耐高溫、耐酸堿的特點。但由于(類)細菌素是細菌產(chǎn)生的天然成分，與眾多物質(zhì)混合，成分不單一，存在分離純化難度大、產(chǎn)量低等問題。因此，通過基因工程技術(shù)進行體外表達是獲得足量(類)細菌素的有效途徑[12]。

羊駝原產(chǎn)于安第斯高原地區(qū)的惡劣環(huán)境下，具有抗寒、抗旱、抗病力強且可自然產(chǎn)生單域抗體等優(yōu)良特性，羊駝的這些特性與其體內(nèi)特定的微生物菌群有著密切的關(guān)系。本研究從羊駝糞便中分離到1株 產(chǎn)抑菌物質(zhì)的枯草芽胞桿菌菌株SXAU18，分離純化后預(yù)測其產(chǎn)生的抗菌蛋白的基因序列，通過原核表達獲得具有生物活性的DarA重組蛋白。本研究將為DarA的功能研究和作為抗菌蛋白的應(yīng)用奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

枯草芽胞桿菌SXAU18的分離：在山西農(nóng)業(yè)大學羊駝繁育基地，隨機采取10頭羊駝的糞便，參照相關(guān)研究報道的方法[9]，將羊駝糞便按照0.2 g·頭-1進行混合，加入PBS制成均勻的懸液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后進行梯度稀釋，涂布于LB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。通過菌落的形態(tài)、大小和顏色等菌落特征的觀察和革蘭染色后鏡檢，挑選可疑菌落。劃線純化4次后，牛津杯擴散法測定挑選菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性。挑選抑菌效果最好的菌株進行16S rDNA鑒定，結(jié)果表明，該菌為枯草芽胞桿菌，將其命名為枯草芽胞桿菌SXAU18。

指示菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)CMCC44102、沙門菌(SalmonellaparatyphiA)CMCC(B)50001、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC26003、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CMCC(B)26069、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)CMCC(B)28001，單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19111，保存于山西農(nóng)業(yè)大學羊駝生物工程實驗室。

1.2 枯草芽胞桿菌SXAU18的抑菌活性

將枯草芽胞桿菌SXAU18活化后，按照1∶100的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，10 000×g4 ℃離心20 min，收集上清液，用0.22 μm濾器過濾獲得無細胞的培養(yǎng)上清。參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書檢測無細胞培養(yǎng)上清液的總蛋白濃度。

參照文獻[13-14]采用牛津杯擴散法測定SXAU18培養(yǎng)上清的抑菌活性。步驟如下：①培養(yǎng)板中倒入大約10 mL的2%瓊脂培養(yǎng)基制成下層培養(yǎng)板；②在下層板上間隔合適距離放置牛津杯，15 mL 的0.75%軟的TSA培養(yǎng)基(胰蛋白胨15.0 g·L-1，大豆蛋白胨5.0 g·L-1，氯化鈉30.0 g·L-1，瓊脂7.5 g·L-1)或者15 mL的0.75%的BHI(腦心浸液)培養(yǎng)基，冷至55～60 ℃時，加入指示菌107CFU·mL-1，倒入下層培養(yǎng)基上，待上層凝固后，拔出牛津杯，形成上層板；③在孔中加入180 μL無細胞培養(yǎng)上清，并以LB培養(yǎng)基為陰性對照，氨芐青霉素為陽性對照，每個樣品3個重復(fù)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，用游標卡尺測量抑菌環(huán)直徑。

1.3 抑菌物質(zhì)的分離純化

硫酸銨沉淀：無細胞培養(yǎng)上清液1 L，用飽和度為50%的硫酸銨鹽析，在室溫下用磁力攪拌器攪拌6 h，10 000×g，4 ℃離心20 min，沉淀溶于1/40體積的PBS中。氯仿抽提：收集到的樣品與氯仿按照1∶1體積比例混合，震蕩15 min，4 500×g離心10 min，棄掉上層和下層相，收集中間相，真空濃縮儀(Eppendorf,Saxony,GER)干燥后用1/2體積PBS重懸干燥沉淀物。分子截留：收集到的樣品利用10 ku cut-off和3 ku cut-off超濾離心管(Millipore,Massachusetts,USA)3 000×g4 ℃離心，獲得10 ku以上、3～10 ku和3 ku以下三段蛋白液；SDS-PAGE分離：具有抑菌活性的蛋白液通過4%～20% SDS-PAGE(Sigma-Aldrich,TruPAGETMPrecast Gel System)電泳，一個泳道進行考馬斯亮藍染色，另一個泳道用0.1% Tween 80清洗，30 min·次-1，洗3次，之后MilliQ水清洗30 min 除去SDS，將清洗后的膠條放置到LB固體平板上，在上層傾倒含有100 μL (OD600 nm=0.6)指示菌的0.75%TSA軟固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，測定抑菌效果。以金黃色葡萄球菌為指示菌，在分離純化的每一步后均進行抑菌活性檢測。

1.4 質(zhì)譜及生物信息學分析

切下具有抑菌活性的SDS電泳條帶，送至華大基因，做質(zhì)譜分析。通過UltiMate3000 (Dionex)和Q Exactive (Thermo Fisher Scientific,Millipore,Massachusetts,USA) LC-MS/MS 質(zhì)譜儀系統(tǒng)進行蛋白序列分析。獲得序列運用Mascot軟件(Matrix Science)進行UniProt分析。通過NCBI和ExPASy-ProtParam tool對質(zhì)譜結(jié)果進行分析，預(yù)測其抑菌蛋白的氨基酸序列。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化合成預(yù)測抗菌蛋白的基因序列。

1.5 重組質(zhì)粒pCold-I-DarA的構(gòu)建

根據(jù)抗菌蛋白優(yōu)化后的基因序列，設(shè)計構(gòu)建表達載體的特異性引物，上游引物引入HamHⅠ酶切位點，下游引物引入SalⅠ酶切位點。引物序列，F(xiàn)：5′- TAACGGGATCCATTGTTGCCGTGGTTCA- GGA-3′，R：5′- TTGATGTCGACGAACTGATGGAATTCATCCA-3′。以優(yōu)化序列為模板，PCR擴增基因序列。PCR產(chǎn)物進行膠回收后，用HamHⅠ和SalⅠ進行雙酶切，與同樣經(jīng)過雙酶切的pCold-I表達質(zhì)粒進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，將轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，隨機挑取3個單克隆進行測序鑒定，將鑒定正確的陽性克隆接種于含有Amp的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜提取重組質(zhì)粒pCold-I-DarA。

1.6 DarA蛋白的原核表達

將重組質(zhì)粒pCold-I-DarA轉(zhuǎn)化至BL21細胞中，測序鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。取陽性轉(zhuǎn)化子的菌液按1∶100的體積比轉(zhuǎn)接于含Amp的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至OD≈0.6時，加入誘導(dǎo)劑，同時設(shè)定不加誘導(dǎo)劑的對照組，15 ℃ 150 r·min-1誘導(dǎo)12 h。離心收集菌體，用PBS重懸菌體，吹打均勻，超聲破碎，離心收集超聲后的上清和沉淀。進行SDS-PAGE檢測。

1.7 重組DarA蛋白的純化

將超聲上清液上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA -Sepharose Cl-6B親和層析柱，用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mmol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH8.0)洗脫雜蛋白，之后，用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mmol·L-1Tris-HCl，250 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH8.0)洗脫目的蛋白。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS進行透析過夜。純化樣品進行12% SDS-PAGE和Western blotting分析。

1.8 表達純化后DarA的活性鑒定

以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌作為指示菌，采用牛津杯擴散法對重組蛋白的活性進行鑒定。同時設(shè)定氨芐青霉素為陽性對照，PBS為陰性對照。分別在孔中加入180 μL的待測樣品，將抑菌平板放置到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約12 h，觀察并記錄抑菌效果。

2 結(jié) 果

2.1 SXAU18發(fā)酵上清的抑菌效果

分離自羊駝糞便中的枯草芽胞桿菌SXAU18，經(jīng)培養(yǎng)獲得該菌株的無細胞培養(yǎng)上清，BCA蛋白濃度測定其總蛋白的濃度為1.04 μg·μL-1，指示菌的抑菌作用見表1，結(jié)果顯示，該菌所產(chǎn)上清對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特菌具有顯著的抑菌活性(表1)。

表1 SXAU18所產(chǎn)類細菌素對指示菌的抑菌活性檢測Table 1 Effect of bacterocin-like substance produced by SXAU18 on indicators antimicrobial activity

2.2 抗菌蛋白的純化結(jié)果

對枯草芽胞桿菌SXAU18所產(chǎn)抑菌物質(zhì)進行分離純化。1 L無細胞發(fā)酵上清液通過飽和50%的硫酸銨鹽析得到25 mL粗提液，其抑菌活性見圖1A；粗提液通過氯仿抽提后進行分子截留和濃縮，獲得相對分子質(zhì)量3 ku以下、3～10 ku之間和10 ku 以上3個蛋白大小的蛋白濃縮液，抽提液和濃縮液的抑菌活性測定分別見圖1B和1D。圖1D顯示，抑菌蛋白相對分子質(zhì)量主要集中在10 ku以上。進而將相對分子質(zhì)量大于10 ku的蛋白液做SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在大約15 ku產(chǎn)生明顯的抑菌區(qū)域(圖1E)，純化結(jié)果顯示，該菌所產(chǎn)抗菌物質(zhì)是10～20 ku的蛋白質(zhì)。

2.3 抑菌蛋白的質(zhì)譜和生物信息學分析

質(zhì)譜分析結(jié)果顯示：枯草芽胞桿菌SXAU18所產(chǎn)活性物質(zhì)含有特定的氨基酸序列——GSSIFGLAPGK。UniProt、NCBI和ExPASy-ProtParam tool分析預(yù)測結(jié)果顯示：抑菌蛋白可能為環(huán)二腺嘌呤核苷酸受體A(c-di-AMP receptor A)，其是枯草芽胞桿菌中第二信使“(c-di-AMP)”的主要受體蛋白之一。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對抑菌蛋白的基因序列進行優(yōu)化，優(yōu)化后的序列為：ATTGTTGCCGTGGTTCAGGATCAGGATAGCAATCGC- CTGCTGAAAACCTTAACCGATCATAACTTC- CGCGTTACCAAACTGGCAACCACCGGCGGCT- TCCTGAAAAGTGGTAATACCACCTTCATGA- TTGGCGTGGAAGATATTCGCGTTAATAAAG- CACTGAGCCTGATTAAAGAAAATGGTCAGA- AACGTGATCAGATGATTGCCCCGGTTAGCC- CGATGGGTGGCAATGCAGATAGTTATGTT- CCGTATCCGGTGGAAGTGGAAGTTGGCGGT- GCAACCGTGTTCGTGCTGCCGGTGGATGAA- TTCCATCAGTTC。

2.4 DarA的原核表達和純化

SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，外源誘導(dǎo)表達的重組蛋白DarA是以可溶性上清蛋白和包涵體兩種形式存在，且主要以可溶性上清蛋白形式表達(圖2A)。重組蛋白DarA純化后的SDS-PAGA分析結(jié)果顯示，純化后的DarA蛋白為單一條帶(圖2B)。Western blot結(jié)果表明：重組表達的DarA蛋白能夠與鼠抗HIS單克隆抗體特異性結(jié)合，蛋白大小約為12 ku(圖2C)，與預(yù)計大小相符。

A.硫酸銨沉淀后的抑菌活性；B.氯仿抽提后的抑菌活性；C.PBS陰性對照；D.超濾后的各個組分的抑菌活性；E.10 ku以上蛋白液的SDS電泳和抑菌活性分析(a.SDS電泳；1.低相對分子質(zhì)量蛋白標準;2.樣品；b.膠條在10～25 ku大小對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌區(qū)域)A.Antibacterial activity of ammonium sulfate precipitation;B.Antibacterial activity of chloroform extraction;C.Negative control;D.Antibacterial activity of ultrafiltration collection;E.SDS-PAGE analysis of purified protein solution over 10 ku and detection of antibacterial activity on gel (a.SDS-PAGE;1.1.7-40 ku low-range protein ladder;2.Sample;b.Gel overlaid with S.aureus showing a clearing inhibitory zone indicating antibacterial activity associated with over 10-25 ku band)圖1 枯草芽胞桿菌SXAU18所產(chǎn)類細菌素在分離純化過程中的抑菌活性測定(以金黃色葡萄球菌為指示菌)Fig.1 Antibacterial activity assay of purification process of bacterocin-like substance produced by Bacillus subtilis SXAU18(S.aureus as indicator bacteria)

A.重組蛋白DarA原核表達SDS電泳圖(M.蛋白相對分子質(zhì)量標準;1.未誘導(dǎo)組;2.誘導(dǎo)組;3.誘導(dǎo)組超聲波破碎后上清;4.誘導(dǎo)組超聲波破碎后沉淀);B.重組蛋白DarA純化的SDS電泳圖(M.蛋白相對分子質(zhì)量標準;1.超聲波破碎后的樣品；2.流出；3.洗脫);C.純化后DarA的Western blot結(jié)果 (M.蛋白相對分子質(zhì)量標準;1.純化樣品)A.SDS-PAGE of DarA protein expression (M.Protein marker;1.Non-induced group;2.Induced group;3.Supernatant after induction of fragmentation;4.Precipitation after induction of fragmentation);B.SDS-PAGE analysis of DarA fusion protein purification (M.Protein marker;1.Samples after ultrasonic breaking;2.Flow-through;3.Elution);C.Western blot analysis of DarA fusion protein purification (M.Protein marker;1.Purified sample)圖2 DarA 重組蛋白表達和純化的SDS電泳和Western blot分析Fig.2 SDS-PAGE and Western blot analysis of DarA protein expression and purification

2.5 重組蛋白DarA的抑菌活性鑒定

抑菌鑒定結(jié)果顯示：重組蛋白DarA對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均產(chǎn)生明顯的抑菌環(huán)(圖3A、B)。同時，PBS陰性對照孔周圍的細菌生長未受到抑制(圖3C、D)。Amp陽性對照孔周圍的細菌生長受到了明顯的抑制(圖3E、F)，結(jié)果表明：由原核表達系統(tǒng)表達產(chǎn)生的DarA蛋白具有抑菌活性。

A.DarA對金黃色葡萄球菌的作用;B.DarA對單增李斯特菌的作用;C、D.PBS陰性對照組;E、F.氨芐青霉素陽性對照組A.Inhibitory activity against S.aureus of DarA;B.Inhibitory activity against L.monocytogenes of DarA;C,D.PBS negative control;E,F.Ampicillin positive control圖3 重組DarA蛋白的抑菌活性分析Fig.3 Antibacterial activity of recombinant protein DarA

3 討 論

拮抗菌是自然存在的抑制有害病原菌的菌群，具有對人畜安全，對環(huán)境無污染，不易使病原微生物產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，也是獲取抗菌物質(zhì)的重要生物資源[5]。枯草芽胞桿菌作為農(nóng)業(yè)部允許在飼料中添加的益生菌之一，具有耐高溫、耐酸堿、易培養(yǎng)、抗逆性好、加工損失少的特點[15]，屬于非腸道固有菌群，在自然界中分布廣泛。近年來，越來越多的芽胞桿菌菌株及其所產(chǎn)(類)細菌素被分離和應(yīng)用。例如，Xin等[9]從藏豬腸道中分離得到一株芽胞桿菌菌株TS，并分離到抗菌肽TP。Wu等[16]從淀粉芽胞桿菌菌株ZJHD3-06中分離出抑制李斯特菌生長的細菌素CAMT2。益生芽胞桿菌或所產(chǎn)益生素在雞、豬、羊體內(nèi)的試驗結(jié)果表明，其具有增強免疫、促進腸道發(fā)育和提高飼料轉(zhuǎn)化率等作用[17-19]。本研究從羊駝糞便中篩選到一株枯草芽胞桿菌SXAU18，該菌的發(fā)酵上清對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特菌的生長具有顯著的抑制作用。

為驗證DarA是否具有抗菌功能，需要獲得較純的DarA蛋白。根據(jù)枯草芽胞桿菌SXAU18發(fā)酵上清對革蘭陽性菌具有抑制生長的作用，對革蘭陰性菌基本沒有作用的特點，本研究選擇原核表達系統(tǒng)作為表達體系，同時，為提高重組蛋白的表達量和分泌表達蛋白比例[25-26]，按照大腸桿菌的密碼子偏好性對DarA的基因序列進行了優(yōu)化[27]，并以pCold-I作為表達質(zhì)粒，進行低溫誘導(dǎo)，從而降低包涵體的表達比例，最終獲得了良好的表達效果。

芽胞桿菌細菌素分類法將其細菌素分為3類：Ⅰ類細菌素，以羊毛硫菌素或環(huán)狀為特征；Ⅱ類細菌素，是一類小分子(0.77～10 ku)的線性肽；Ⅲ類細菌素，相對分子質(zhì)量大于30 ku蛋白。其他許多中等大小的抗菌多肽(10～30 ku)和其他由桿菌產(chǎn)生的大的抗菌蛋白，無法按照分類法進行分類，被稱為類細菌素[5]。本研究獲得的DarA重組蛋白相對分子質(zhì)量大小約為12 ku，加之Gundlach等[24]報道的DarA結(jié)構(gòu)特點，DarA應(yīng)屬于芽胞桿菌類細菌素的一種。

本研究所得結(jié)果為DarA的功能研究和作為抑菌蛋白的應(yīng)用奠定了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

從羊駝糞便中分離到枯草芽胞桿菌SXAU18，該菌株能夠發(fā)酵產(chǎn)生抑制金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特菌生長的類細菌素DarA，重組表達后的DarA具有抑菌活性。