抗非洲豬瘟病毒單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)及活性鑒定

王麗娟，石正旺，楊 波，麻 園，羅俊聰，萬(wàn) 穎，宋 銳，田 宏，鄭海學(xué)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 OIE/國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的豬的一種高度致死性出血性疾病，病程短，死亡率高。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須報(bào)告類疾病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[1]。20世紀(jì)中葉之前，該病一直局限于非洲，之后逐步向歐洲蔓延[2]。2007年，隨著Ⅱ型ASFV進(jìn)入高加索地區(qū)，疫情逐漸擴(kuò)散至俄羅斯及東歐地區(qū)[3-4]，2018年8月，在我國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市首次發(fā)現(xiàn)該病，在1年時(shí)間內(nèi)傳播至我國(guó)32個(gè)省份，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重創(chuàng)[5-7]。除我國(guó)外，蒙古、越南、柬埔寨、老撾、朝鮮、菲律賓等國(guó)家也陸續(xù)出現(xiàn)非洲豬瘟疫情[8]，該病毒幾乎造成了全球性蔓延。

ASFV是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒[9]，其傳染性和穩(wěn)定性強(qiáng)，可通過(guò)受感染的豬肉制品和一些污染品進(jìn)行傳播，具有顯著的接觸傳播特性[10-12]。目前國(guó)內(nèi)外無(wú)有效的商品化疫苗防控ASFV[13]，短期內(nèi)依靠早期診斷與區(qū)域化防控管理來(lái)進(jìn)行防治，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制了該病毒的基因缺失苗，但該疫苗目前只取得了實(shí)驗(yàn)室階段成果[14]，因此，建立該病的快速準(zhǔn)確診斷方法是控制該病的重要前提，而診斷方法的建立則與抗體的研發(fā)密不可分。

抗體是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的免疫分子，也是疫苗和診斷試劑中的核心成分。傳統(tǒng)的抗體多為單克隆抗體，產(chǎn)量高、特異性強(qiáng)，一度成為生物制劑中的重要組成部分[15]。ASFV具有龐大的基因組，約編碼150多個(gè)蛋白質(zhì)[16]，依據(jù)主要衣殼蛋白P72，又分為24種基因型[17-18]，傳統(tǒng)的單克隆抗體已不足以應(yīng)對(duì)此病毒，因此迫切需要一種安全有效的新型抗體。單鏈抗體(ScFv)是近些年生物領(lǐng)域里發(fā)展快速的一種新型抗體，只含有重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)，由一段Linker序列連接，因此比常規(guī)抗體分子量小很多，是一種具有巨大治療和診斷潛力的分子[19-20]。1996年，Mason等[21]首次報(bào)道了A12型口蹄疫病毒ScFv，自此，開(kāi)啟了ScFv的發(fā)展歷程，后續(xù)研制出了ScFv多聚體、雙特異性ScFv等多種形式抗體[22]。ScFv因其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)而具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值：較小的分子量使其具有很好的穿透性，易攜帶靶向藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而為腫瘤診斷與治療開(kāi)辟了新的途徑[23-24]；雙特異性ScFv是一類可以同時(shí)特異性結(jié)合兩種不同抗原的人工改造抗體，將其應(yīng)用到診斷技術(shù)上，可以拓展檢測(cè)寬度，提高檢測(cè)靈敏度；ScFv作為一種人工合成的基因工程抗體，一方面易于進(jìn)行分子的改造，可直接對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用[25-26]；另一方面可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中大量生產(chǎn)，極大地縮短抗體制備周期。ScFv最突出的特點(diǎn)是克服了傳統(tǒng)單克隆抗體鼠源性強(qiáng)的特點(diǎn)，消除了抗體應(yīng)用上的異源性反應(yīng)，擴(kuò)寬了抗體的應(yīng)用范圍。綜上所述，它獨(dú)特的生物學(xué)特性與廣泛的應(yīng)用前景，使其有望成為科研攻堅(jiān)上的新型利器。

本研究通過(guò)分離ASFV感染康復(fù)豬外周血淋巴細(xì)胞，擴(kuò)增豬源ScFv基因，制備了一種分子量小、靈敏度高的抗ASFV單鏈抗體，為ASFV診斷提供新型原材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 LTS1110豬外周血淋巴細(xì)胞分離液Kit購(gòu)自天津?yàn)笊镏破饭?；pMDTM20-T載體、E.coliJM109感受態(tài)、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、RNase-free Water、DL2000 DNA Marker、6×Loading Buffer均購(gòu)自寶生物公司；Unstained protein MW marker(26610)、Unstained protein MW marker(26616)、6×His Tag Monoclonal Antibody(HIS.H8),HRP、6x-His Tag Monoclonal Antibody (HIS.H8),Alexa Fluor 555均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；Goat Anti-Pig IgG H&L (HRP) (ab6915)購(gòu)自Abcam公司；BL21(DE3)感受態(tài)購(gòu)自北京全式金；Trizol、鎳柱親和層析樹(shù)脂、DNA片段回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為OMEGA產(chǎn)品；分子生物學(xué)試劑來(lái)自Sigma公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；ASFV感染康復(fù)豬、ASFV陰陽(yáng)性血清及ASFV CN/GS/2018分離株均由國(guó)家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室(蘭州)提供。

1.1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上收錄的豬IgG重鏈(AK405798)、輕鏈Kappa鏈(EU683881)、輕鏈Lamda鏈(AF345512)基因序列，參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增豬IgG可變區(qū)的引物。引物序列如表1所示，其中 VH-F1、VH-R1，VLκ-F1、VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13,VLλ-F1、VLλ-R1用于第1輪擴(kuò)增；VH-F1、VH-R2，VLκ-F2、VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13，VLλ-F2、VLλ-R1用于第2輪擴(kuò)增；VH-F1、VLλ-R1、VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13用于第3輪擴(kuò)增。引物由大連寶生物有限公司合成。

表1 重鏈及輕鏈目的片段擴(kuò)增引物Table 1 Primers set used for heavy and light chain variable genes amplification

1.2 模板的制備

1.2.1 豬外周血淋巴細(xì)胞提取 采集ASFV感染康復(fù)豬的外周血，用LTS1110豬外周血淋巴細(xì)胞試劑盒進(jìn)行豬外周血淋巴細(xì)胞的分離：①向外周血中加入等量全血稀釋液，混勻。②離心管中量取與稀釋后血液等量的分離液，將稀釋后血液緩慢加入，使其平鋪于分離液液面，1 800 r·min-1，水平離心30 min。③小心吸取第二層白色淋巴細(xì)胞，加入10 mL 清洗液，1 500 r·min-1水平離心10 min。④棄 上清，以5 mL清洗液重懸，1 500 r·min-1水平離心10 min。⑤棄上清，以1 mL RNA Later保存液重懸，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 淋巴細(xì)胞總RNA提取 采用Trizol試劑提取法提取淋巴細(xì)胞總RNA，經(jīng)Thermo公司的Thermo Nano Drop One檢測(cè)，所提取的總RNA濃度為356 ng·μL-1，OD260 nm/OD280 nm為1.87。

1.3 抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增

1.3.1VH基因及VH-Linker基因擴(kuò)增 以提取的淋巴細(xì)胞總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到全基因組cDNA。以cDNA為模板，VH-F1和VH-R1為引物，擴(kuò)增VH基因。反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、52 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s、30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化收集VH。

以VH基因?yàn)槟０?，VH-F1和VH-R2為引物，擴(kuò)增VH-Linker基因。反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、56 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s、35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化收集VH-Linker。

1.3.2VLλ基因及Linker-VLλ基因擴(kuò)增 以cDNA為模板，VLλ-F1和VLλ-R1為引物，擴(kuò)增VLλ基因。反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、53 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s、30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化收集VLλ。

以VLλ基因?yàn)槟０?，VLλ-F2和VLλ-R1為引物，擴(kuò)增Linker-VLλ基因。反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、68 ℃ 30 s、35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化收集Linker-VLλ。

1.3.3VLκ基因及Linker-VLκ基因擴(kuò)增 以cDNA為模板，VLκ-F1和VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13為引物，擴(kuò)增VLκ基因。反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，54 ℃ 5 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化收集VLκ。

以VLκ基因?yàn)槟０?，VLκ-F2和VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13為引物，擴(kuò)增Linker-VLκ基因。反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 30 s，30個(gè) 循環(huán)；72 ℃ 10 min；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化收集Linker-VLκ。

1.3.4 ScFv(VH-Linker-VL)基因擴(kuò)增 分別以VH-Linker和Linker-VLλ、VH-Linker和Linker-VLκ為模板，以VH-F1、VLλ-R1和VH-F1、VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13為引物，通過(guò)SOE-PCR技術(shù)擴(kuò)增拼接VH-VLκ和VH-VLλ。反應(yīng)程序如下，①無(wú)引物：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。②有引物：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 5 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化收集VH-VLκ和VH-VLλ。

1.4 T-A克隆鑒定及pET-30a-ScFv質(zhì)粒的構(gòu)建

將ScFv(VH-VL)基因連接至pMDTM20-T載體上，進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，挑選條帶大小合適的質(zhì)粒送測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，挑選正確的基因序列送武漢金開(kāi)瑞公司進(jìn)行pET-30a-ScFv質(zhì)粒的構(gòu)建。

1.5 ScFv抗體的表達(dá)與純化

將構(gòu)建成功的pET-30a-ScFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，每50 μL感受態(tài)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)化1 μL pET-30a-ScFv質(zhì)粒，將轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于LB-K+平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h直至單克隆出現(xiàn)，挑取單克隆菌落于LB-K+液體培養(yǎng)基中，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)抗體蛋白，對(duì)表達(dá)的抗體蛋白進(jìn)行收集、洗滌、純化，即得抗ASFV ScFv抗體。

1.6 VH-VLλ11抗體ELISA活性鑒定

1.6.1 VH-VLλ11包被檢測(cè)板鑒定ASFV 取純化的ScFv抗體VH-VLλ11(0.1 mg·mL-1)，按照1∶4 的比例包被檢測(cè)板，包被完成后，加入50 μL 滅活A(yù)SFV，37 ℃溫箱孵育30 min，250 μL PBST洗滌液洗滌4次，拍干，分別加入50 μL 1∶5稀釋的ASFV陽(yáng)性血清2孔、1∶5稀釋的健康豬血清2孔、血清稀釋液2孔，37 ℃溫箱孵育30 min，250 μL PBST洗滌液洗滌4次，拍干，加入50 μL 1∶15 000稀釋的 HRP標(biāo)記的豬二抗，37 ℃溫箱孵育30 min，250 μL PBST洗滌液洗滌4次，拍干，加入50 μL TMB底物溶液，37 ℃溫箱孵育15 min，加入50 μL終止液(H2SO4)，在分光光度儀上讀取反應(yīng)物的OD450 nm值。

1.6.2 ASFV抗原包被檢測(cè)板鑒定VH-VLλ11取P73兔抗1∶1 000包被檢測(cè)板，4 ℃包被12 h后棄掉，PBST洗滌4次，拍干，再加入1∶1稀釋的ASFV全病毒抗原，包被完成后，分別加入50 μL 1∶16 稀釋的VH- VLλ11抗體蛋白(0.4 mg·mL-1)、稀釋液各2孔，37 ℃溫箱孵育30 min，250 μL PBST洗滌液洗滌4次，拍干，加入50 μL 1∶5 000稀釋的兔抗豬HIS-HRP，37 ℃孵育30 min，250 μL PBST洗滌液洗滌4次，拍干，加入50 μL TMB底物溶液，37 ℃孵育15 min，加入50 μL終止液(H2SO4)，于酶標(biāo)儀上讀取OD450 nm值。

1.7 VH-VLλ11抗體間接免疫熒光試驗(yàn)

以ASFV接種豬PAMS細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，0.1% Triton-100室溫透膜15 min，PBS洗3次，再以5% Blocker BSA室溫封閉15 min后，加入VH-VLλ11抗體(1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，6×-His Tag Monoclonal Antibody (HIS.H8),Alexa Fluor 555(1∶60)室溫避光染色1 h，PBS洗3次，加入DAPI染核10 min，PBS洗3次，上鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 VH及VL基因的擴(kuò)增鑒定

將擴(kuò)增的VH及VL基因進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，由結(jié)果可知在300 bp左右出現(xiàn)了明顯的條帶，條帶大小與預(yù)期的目的條帶大小相一致，見(jiàn)圖1。

A.VH基因擴(kuò)增產(chǎn)物；B.VLκ基因擴(kuò)增產(chǎn)物；C.VLλ基因擴(kuò)增產(chǎn)物；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.VH；3.VLκ；4～5.VLλA.VH gene amplification product;B.VLκ gene amplification product;C.VLλ gene amplification product;M.DL2000 DNA marker,1-2.VH;3.VLκ;4-5.VLλ圖1 豬源抗體VH及VL基因擴(kuò)增Fig.1 Porcine antibody VH and VL gene amplification

2.2 VH-Linker及Linker-VL基因的擴(kuò)增鑒定

將擴(kuò)增的VH及VL基因進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果可見(jiàn)在320 bp左右出現(xiàn)了明顯的條帶，條帶大小與預(yù)期的目的條帶大小相一致，見(jiàn)圖2。

A.VH-Linker基因擴(kuò)增產(chǎn)物；B.VLκ-Linker基因擴(kuò)增產(chǎn)物；C.VLλ-Linker基因擴(kuò)增產(chǎn)物；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.VH-Linker；2～3.VLκ-Linker；4～5.VLλ-LinkerA.VH-Linker gene amplification product;B.VLκ-Linker gene amplification product;C.VLλ gene amplification product;M.DL2000 DNA marker,1.VH-Linker;2-3.VLκ-Linker;4-5.VLλ-Linker圖2 豬源抗體VH-Linker及VL-Linker基因擴(kuò)增Fig.2 Porcine antibody VH-Linker and VL-Linker gene amplification

2.3 ScFv(VH-Linker-VL)基因的擴(kuò)增鑒定

將SOE-PCR擴(kuò)增拼接得到的VH-Linker-VL基因進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果可見(jiàn)在約800 bp左右出現(xiàn)了明顯的條帶，條帶大小與預(yù)期的目的條帶大小相一致，見(jiàn)圖3。

A.VH-Linker-VLλ基因擴(kuò)增產(chǎn)物；B.VH-Linker-VLκ基因擴(kuò)增產(chǎn)物；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.VH-Linker-VLλ；2.VH-Linker-VLκA.VH-Linker-VLλ gene amplification product;B.VH-Linker-VLκ gene amplification product;M.DL2000 DNA marker;1.VH-Linker-VLλ;2.VH-Linker-VLκ圖3 豬源抗體ScFv(VH-Linker-VL)基因擴(kuò)增Fig.3 Porcine antibody ScFv(VH-Linker-VL) gene amplification

2.4 T-A克隆鑒定及pET-30a-ScFv質(zhì)粒構(gòu)建

將構(gòu)建的pMDTM20-T-ScFv(VH-Linker-VL)質(zhì)粒送楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，共挑選了17個(gè)單克隆，經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)其序列與NCBI網(wǎng)站上公布的豬IgG可變區(qū)序列的框架區(qū)基本一致、CDR區(qū)存在差異，符合豬IgG輕重鏈可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)。將以上基因序列進(jìn)行pET-30a-ScFv質(zhì)粒的構(gòu)建，VH-Linker-VL位于pET-30a的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)之間。

其中，VH-Linker-VLλ11測(cè)序結(jié)果如圖4所示。

圖4 pMDTM20-T-ScFv(VH-VLλ11)質(zhì)粒測(cè)序峰圖Fig.4 pMDTM20-T-ScFv (VH-VLλ11) plasmid sequencing peak map

2.5 ScFv抗體的制備

對(duì)構(gòu)建的pET-30a-ScFv質(zhì)粒進(jìn)行抗體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示：僅pET-30a-VH-VLλ11在37 ℃ 誘導(dǎo)后出現(xiàn)1條27 ku的特異蛋白條帶(包涵體)，大小與預(yù)期相符，并在誘導(dǎo)劑濃度為1/1 000，誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)，ScFv抗體表達(dá)量達(dá)高峰。將表達(dá)的VH-VLλ11抗體進(jìn)行鎳柱純化，結(jié)果如圖5所示。

M.未染色蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)(26610)；1、2.ScFv抗體(VH- VLλ11)M.Unstained protein MW marker (26610)；1,2.ScFv antibody(VH- VLλ11)圖5 pET-30a-ScFv(VH-VLλ11)抗體蛋白純化濃縮Fig.5 pET-30a-ScFv (VH-VLλ11) antibody protein purification concentration map

2.6 VH-VLλ11抗體ASFV反應(yīng)活性鑒定

2.6.1 VH-VLλ11包被檢測(cè)板鑒定ASFV 將表達(dá)純化的VH-VLλ11抗體蛋白包被檢測(cè)板鑒定其與ASFV的反應(yīng)活性，結(jié)果顯示VH-VLλ11抗體具有ASFV反應(yīng)活性，如圖6所示。

圖6 VH-VLλ11包被檢測(cè)板鑒定ASFVFig.6 Identification of ASFV coated with VH-VLλ11

2.6.2 ASFV抗原包被檢測(cè)板鑒定VH-VLλ11以P73兔抗捕獲ASFV抗原包被檢測(cè)板檢測(cè)純化的VH-VLλ11抗體蛋白，結(jié)果顯示，VH-VLλ11抗體蛋白與ASFV具有反應(yīng)性，如圖7所示。

圖7 ASFV包被檢測(cè)板鑒定VH-VLλ11Fig.7 Identification of VH-VLλ11 coated with ASFV

2.6.3 VH- VLλ11抗體間接免疫熒光鑒定 以6×-His Tag Monoclonal Antibody (HIS.H8),Alexa Fluor 555進(jìn)行VH-VLλ11抗體的熒光染色，結(jié)果顯示VH-VLλ11可與處于細(xì)胞質(zhì)中的ASFV發(fā)生反應(yīng)，如8所示。

3 討 論

目前，ASFV對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大威脅，中國(guó)作為養(yǎng)豬大國(guó)，豬肉更是老百姓的日常肉類主要來(lái)源。自2018年我國(guó)暴發(fā)非洲豬瘟疫情以來(lái)，豬肉價(jià)格大幅上漲，給百姓的日常生活帶來(lái)了極大的影響?？蒲袑W(xué)者夜以繼日，積極進(jìn)行ASFV疫苗的研發(fā)，但目前全球還未有商品化的ASFV疫苗，因此，ASF的快速診斷對(duì)防控該病至關(guān)重要?？贵w作為診斷方法中的核心成分，是決定診斷方法優(yōu)劣的重要因素，在本研究中，主要致力于制備一種分子量小、穿透力強(qiáng)、異源性低的ScFv。

本研究通過(guò)分離了ASFV感染康復(fù)豬的外周血淋巴細(xì)胞，從中提取RNA來(lái)作為擴(kuò)增模板，考慮到豬的抗體輕鏈類型有λ型和κ型兩種，作者在設(shè)計(jì)引物時(shí)分別設(shè)計(jì)了兩種輕鏈類型的引物，并通過(guò)在引物5′端添加Linker序列(一段由甘氨酸和絲氨酸組成的多肽鏈)，利用重疊PCR(SOE-PCR)擴(kuò)增得到VH-VLκ和VH-VLλ兩種基因。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，獲取的基因與NCBI網(wǎng)站上公布的豬IgG重鏈與輕鏈基因的相似性均達(dá)80%以上，后由公司代為構(gòu)建pET-30a-ScFv表達(dá)質(zhì)粒，最終通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)得到VH-VLλ11抗體蛋白。

將表達(dá)的蛋白純化后進(jìn)行ELISA檢測(cè)技術(shù)及IFA試驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)VH-VLλ11抗體蛋白具有ASFV反應(yīng)活性，但反應(yīng)活性較低，這與ScFv親和力低的特性相一致，其主要原因主要有兩點(diǎn)：一是由于ScFv與常規(guī)抗體相比，少了Fc結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的缺失雖然能夠降低抗體的異源反應(yīng)[27]，但也在一定程度上影響了抗體親和力，二是因?yàn)镾cFv的表達(dá)多選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其獨(dú)特的還原性環(huán)境，影響了抗體表達(dá)過(guò)程中二硫鍵的形成，導(dǎo)致所表達(dá)的抗體蛋白多以包涵體的形式存在[28]，從而掩蓋了抗體的部分抗原表位，降低了抗體親和力。當(dāng)然，ScFv親和力低的問(wèn)題可以通過(guò)優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)、增加伴侶蛋白等方式解決[29]。

本研究制備了一種與ASFV具有反應(yīng)性的ScFv，后續(xù)可以應(yīng)用ScFv作為捕獲抗體或者檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)ASFV的ELISA方法，或者包被滅活A(yù)SFV，應(yīng)用抗ASFV ScFv建立競(jìng)爭(zhēng)或者阻斷ELISA方法。此抗體的成功制備填補(bǔ)了目前市場(chǎng)上ASFV ScFv抗體的空白，克服了單克隆抗體制備周期長(zhǎng)、異源性強(qiáng)的問(wèn)題，為ASF的診斷提供了新的原材料。

圖8 VH-VLλ11的間接免疫熒光試驗(yàn)Fig.8 Indirect immunofluorescence experiment of VH-VLλ11

4 結(jié) 論

通過(guò)分離ASFV感染康復(fù)豬外周血淋巴細(xì)胞，提取淋巴細(xì)胞總RNA，應(yīng)用SOE-PCR技術(shù)成功獲得豬源ScFv基因，然后應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ScFv基因，經(jīng)過(guò)ELISA和IFA鑒定，成功獲得1株具有ASFV反應(yīng)活性的豬源ScFv(VH- VLλ11)，為ASF的診斷注入新力量。