牛胚胎性別鑒定熒光定量PCR方法的優(yōu)化與應(yīng)用

馮春濤，顧文源，王志仙，趙增元,7，朱宏波，倪俊卿，褚素喬，余文莉*，李樹靜*

(1.石家莊天泉良種奶牛有限公司，石家莊 050200；2.石家莊市畜牧技術(shù)推廣站，石家莊 050000；3.河北省動物疫病預(yù)防控制中心，石家莊 050035；4.河北省畜牧良種工作總站，石家莊 050020；5.河北省牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，石家莊 050200；6.河北省奶牛良種繁育工程技術(shù)研究中心，石家莊 050200；7.河北省第三批“巨人計(jì)劃”創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)，石家莊 050200)

在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，許多生產(chǎn)性狀受性別控制，后代性別預(yù)選為提高畜牧業(yè)系統(tǒng)的盈利能力和可持續(xù)性提供了機(jī)會[1]。奶牛作為重要的經(jīng)濟(jì)動物，只有母牛可以產(chǎn)奶，性別決定和性別控制對奶業(yè)生產(chǎn)具有重要意義[2]。在奶牛胚胎移植行業(yè)中，胚胎性別鑒定是一項(xiàng)強(qiáng)有力的工具，可以幫助奶牛養(yǎng)殖者更有效地管理其育種資源[3]。為了控制后代的性別，必須對植入前的胚胎進(jìn)行有效的性別鑒定[4]。早期胚胎性別鑒定方法主要有細(xì)胞學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等[5]。20世紀(jì)80年代中期，牛Y染色體特異性DNA探針的鑒定，以及隨后聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的發(fā)展，使得胚胎的性別鑒定理論成為現(xiàn)實(shí)[6]。近幾年的研究表明，牛的雄性和雌性胚胎不僅在染色體補(bǔ)體上有差異，而且在轉(zhuǎn)錄活性和表觀遺傳狀態(tài)上也有差異。胚胎轉(zhuǎn)錄中的兩性異形影響碳水化合物和氨基酸代謝，雌性胚胎顯示較慢的線粒體代謝[7]，這提供了一條通過無創(chuàng)代謝組學(xué)進(jìn)行胚胎性別標(biāo)記測定的新思路。Hamilton等[8]用RT-PCR或RT-qPCR法性別鑒定的8個Y染色體關(guān)聯(lián)基因中的3個基因(DDX3Y-1、USP9Y-1、ZRSR2Y-1)代表了基于RNA胚胎性別鑒定的良好候選基因，并且可以代替基于DNA的性別鑒定步驟。

1990年，Herr等[9]首次用PCR方法對牛胚胎進(jìn)行了性別鑒定，并且許多研究也證明了這項(xiàng)技術(shù)的潛力。Bredbacka等[10]報(bào)道,胚胎性別鑒定(從活檢到凝膠電泳結(jié)束)用6～7 h完成，而且有一些方法可以將性別鑒定所需的時間減少1～2 h。PCR方法因其靈敏高效、準(zhǔn)確率高、所用時間短的特點(diǎn)而優(yōu)于上述方法，被廣泛采用。但是PCR法存在容易被污染的危險，極易導(dǎo)致擴(kuò)增出異源片段。

本研究利用牛折疊蛋白基因存在X染色體上的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)1組引物及探針專用于鑒別牛的胚胎，然后再利用公牛的特異性基因SRY，選取其序列進(jìn)行引物及探針的特異性設(shè)計(jì)，將兩組探針組合構(gòu)建一個復(fù)合檢測體系，用于鑒定牛早期胚胎的性別，以有效地避免常規(guī)PCR所帶來的污染，提高檢出率及準(zhǔn)確率，使檢測過程更加簡便，結(jié)果更加靈敏、可靠。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

用于生產(chǎn)胚胎的供體牛為12～15月齡的育種值排名前5%的荷斯坦育成牛，受體牛為低產(chǎn)奶?；蛭麟s黃牛。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 胚胎 胚齡為7～7.5 d，發(fā)育階段為緊縮桑椹胚、早期囊胚、囊胚和擴(kuò)張囊胚，質(zhì)量為1、2級。

1.2.2 冷凍精液 世界排名前50名，與供體牛近交系數(shù)小于6.25%的荷斯坦種公牛凍精。

1.3 主要儀器

倒置顯微鏡(OLYMPUS)、胚胎分割儀(WETZLAR)、PCR儀、熒光定量PCR儀(7900HT)、熒光定量PCR儀(Q6)、電泳儀、UV顯像儀、POLAROID照相系統(tǒng)、胚胎冷凍儀(CL-5500,Australian)。

1.4 主要耗材與溶液

1.4.1 耗材 六孔平皿(PETS公司)、∮60 mm分割平皿(BECTON DICKINSON公司)、顯微分割刀(AB Technology,Inc,Pullman WA)、2 μL 取樣吸頭和200 μL通用吸頭(AB Technology,Inc,Pullman WA)、100 μL離心管、96孔板(Corning)。

1.4.2 溶液 PBS溶液(GIBOC)、胚胎保存液(HOLDING,ICP公司)、EG胚胎冷凍液(ICP公司)、YCD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒(美國AB公司)、雌性和雄性擴(kuò)增對照樣品(美國AB公司)、胚胎分割液(SPLITTING，自制)。分割液配方：CaCl2·2H2O 0.05 g·L-1，MgCl2·6H2O 0.04 g·L-1，KCl 0.2 g·L-1，KH2PO40.2 g·L-1，NaCl 8 g·L-1，Na2HPO41.15 g·L-1，EDTA.Na2·2H2O 0.001 5 g·L-1。

1.5 胚胎生產(chǎn)及胚胎取樣

1.5.1 胚胎生產(chǎn) 供體牛用CIDR-FSH-PG-GnRH 法超排，用常規(guī)非手術(shù)法采集胚胎。準(zhǔn)備進(jìn)行性別鑒定的胚胎在人工授精后第7天收集。根據(jù)IETS手冊，只采用從致密桑椹胚階段到擴(kuò)張囊胚階段的1級 胚胎或在某些情況下的2級胚胎，在取樣前透明帶完好無損[6]，將胚胎洗滌10次。操作室溫度保持20～25 ℃，冷凍前胚胎保存在HOLDING液中。

1.5.2 胚胎取樣 將胚胎分割儀與倒置顯微鏡固定在一起，將顯微分割刀固定在顯微操作儀的操作手上，在∮60 mm培養(yǎng)皿中做一個50 μL的分割液滴，每個胚胎在取樣前先在分割液中洗5遍，將洗好的胚胎放入其中。胚胎被放大100倍進(jìn)行分割取樣。在桑椹胚的邊緣或囊胚的滋養(yǎng)層切取細(xì)胞樣品。每個胚胎取樣后用移液槍吸取2 μL的回收液，從分割液滴中將樣品吸起，推入裝有8 μL超純水的100 μL EP離心管中。樣品取走后，用200 μL通用吸頭吸取50 μL HOLDING液，從分割液滴中將取樣后的胚胎吸起，放入六孔平皿對應(yīng)的HOLDING液滴中準(zhǔn)備移植或冷凍。

1.6 YCD-PCR法擴(kuò)增目的基因片段

1.6.1 擴(kuò)增體系及程序 YCD試劑盒含有PCR反應(yīng)所需的特異性引物、內(nèi)標(biāo)物、dNTP、Taq酶等。在每個加有樣品的離心管中依次加入8.5 μL YCD，然后將其擺放在PCR反應(yīng)槽中，變性溫度95 ℃，延伸溫度72 ℃，退火溫度64 ℃，經(jīng)過30個循環(huán)65 min進(jìn)行DNA擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，吸取5 μL溴酚藍(lán)對樣品染色并點(diǎn)樣，啟動電泳儀。樣品在130～140 V電壓的瓊脂糖凝膠板上運(yùn)行15～20 min。

1.6.2 電泳圖像判讀標(biāo)準(zhǔn) 如樣品出現(xiàn)3條電泳帶，即雌雄共有的常染色體基因片段、Y染色體上相應(yīng)片段和“引物帶”的胚胎即雄性胚胎，只出現(xiàn)共有基因片段和“引物帶”的胚胎即雌性胚胎。判定結(jié)果分為3類：1)鑒定結(jié)果明顯：將雌或雄結(jié)果明顯，無任何污染條帶，定為性別鑒定有效。2)鑒定結(jié)果差:帶較暗；帶與帶之間模糊，外源DNA污染；雌性被雄性污染。3)無反應(yīng)：只有引物帶或無帶。

1.7 熒光定量PCR方法擴(kuò)增目的基因片段

1.7.1 引物及探針合成序列 利用牛折疊蛋白基因存在X染色體上的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)1組引物NB2-F、NB2-R和探針NB2-P，然后再利用公牛的特異性基因SRY，選取其序列進(jìn)行引物及探針的特異性設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)引物BOV97M-F、BOV97M-R和探針BOV97M-P，將兩組探針組合構(gòu)建一個復(fù)合性別鑒定體系，見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of fluorescent quantitative PCR

1.7.2 熒光定量PCR方法不同的擴(kuò)增體系 單引物分別擴(kuò)增體系(熒光單擴(kuò))：將胚胎樣品DNA分成兩份，分別利用內(nèi)標(biāo)引物和雄性位點(diǎn)引物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)內(nèi)標(biāo)和性別位點(diǎn)各自擴(kuò)增結(jié)果合成胚胎性別判定結(jié)果；熒光雙引物混合擴(kuò)增體系(熒光雙擴(kuò))：將胚胎樣品DNA與內(nèi)標(biāo)引物和雄性位點(diǎn)引物混合液同時擴(kuò)增，根據(jù)內(nèi)標(biāo)和性別位點(diǎn)擴(kuò)增情況判定胚胎性別。

1.7.3 熒光定量PCR擴(kuò)增體系和程序 反應(yīng)體系:Probe FAST qPCR Kit Master Mix(2×) Universal 5 μL，引物探針混合液(1∶3)Primer and probe mixture 1.2 μL，DNA 6 μL，探針ROX校正染料* Probe ROX calibration dye 0.2 μL，超純水補(bǔ)至15 μL。反應(yīng)程序設(shè)定：95 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，共45個循環(huán)；72 ℃10 min延伸后結(jié)束。

1.7.4 數(shù)據(jù)分析和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)表2中的判讀標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增曲線和CT值及性別位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線和CT值判讀胚胎樣本的性別。雌或雄結(jié)果明確者為鑒定有效。

表2 熒光定量PCR結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standard for interpretation of fluorescence quantitative PCR results

1.8 胚胎冷凍及解凍

1.8.1 胚胎冷凍 取樣后胚胎在乙二醇(EG)冷凍液中平衡5 min并裝入0.25 mL細(xì)管后，放于冷凍儀上進(jìn)行常規(guī)冷凍。冷凍程序：-6 ℃平衡5 min，植冰平衡5 min，按0.5 ℃·min-1降溫至-35 ℃投入液氮。

1.8.2 胚胎解凍 將雌性胚胎從液氮中取出，直接放入32～35 ℃水浴中10 s，將細(xì)管外的水跡拭干，將胚胎直接推入HOLDING液中洗3～4次，采用四段式將胚胎吸入0.25 mL細(xì)管內(nèi)移植。

1.9 受體牛同期發(fā)情和移植

用CIDR-PG技術(shù)對受體牛進(jìn)行同期發(fā)情處理，選用發(fā)情后6.5～8.5 d、黃體合格的受體牛進(jìn)行移植。胚胎移植后60 d采用直腸檢查法對受體牛進(jìn)行妊娠檢查。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同方法的胚胎性別鑒定效果分析

本試驗(yàn)以進(jìn)口YCD試劑盒PCR鑒定方法為對照組，熒光定量PCR的單引物分別擴(kuò)增方法(熒光單擴(kuò)，single primer separate amplification，F(xiàn)SPSA)和雙引物混合擴(kuò)增方法(熒光雙擴(kuò)，double primer mixed amplification，F(xiàn)DPMA)分別為試驗(yàn)組，對各組間的性別鑒定效率(efficiency of sex identification)、無反應(yīng)率(non-reaction rate)、雌雄胚胎百分率(percent of female and male embryos)和比值(ratio of female and male embryos) 進(jìn)行比較。

如表3所示：1) 熒光單擴(kuò)組的雌性胚胎百分率極顯著高于其他兩組(P<0.01)，而PCR電泳組和熒光雙擴(kuò)組之間差異不顯著。2) 熒光單擴(kuò)組的雄性胚胎百分率極顯著低于熒光雙擴(kuò)組(P<0.01)，極顯著高于PCR電泳組(P<0.01)，而PCR電泳組和熒光雙擴(kuò)組之間差異不顯著。3) PCR電泳組、熒光單擴(kuò)組和熒光雙擴(kuò)組胚胎的雌雄比分別為1∶1.02、1.03∶1和1∶1.03。4) 熒光單擴(kuò)組的鑒定結(jié)果差胚胎的百分率極顯著低于其他兩組(P<0.01)，而熒光雙擴(kuò)組和PCR電泳組之間差異不顯著。5) 3組間的性別鑒定無反應(yīng)率差異極顯著，PCR電泳組最高，熒光單擴(kuò)組最低(P<0.01)。6) 3組間的性別鑒定效率差異極顯著，熒光單擴(kuò)組最高，PCR電泳組最低(P<0.01)。

表3 不同方法的胚胎性別鑒定效果差異性分析Table 3 Analysis on the difference of embryo sex identification results by different methods

2.2 不同鑒定方法對雌性胚胎準(zhǔn)確性的影響

本試驗(yàn)以進(jìn)口YCD試劑盒PCR鑒定方法為對照組，熒光單擴(kuò)和熒光雙擴(kuò)分別做試驗(yàn)組，對各組間的雌性胚胎母犢率(female calf rate of female embryos,FCRFE)進(jìn)行比較。

如表4所示，通過對3種方法產(chǎn)母犢準(zhǔn)確率的比較，熒光單擴(kuò)組的產(chǎn)母犢準(zhǔn)確率極顯著低于熒光雙擴(kuò)組和對照組(P<0.01)，熒光雙擴(kuò)組和對照組之間差異不顯著(P>0.05)。綜合表3、表4分析可知，熒光雙擴(kuò)方法是一種優(yōu)于PCR電泳和熒光單擴(kuò)的早期胚胎性別鑒定方法。

表4 不同方法之間雌性胚胎性別鑒定準(zhǔn)確性比較Table 4 Comparison of sex identification accuracy for female embryos among different methods

2.3 取樣細(xì)胞數(shù)量對熒光雙擴(kuò)方法性別鑒定效果的影響

為進(jìn)一步優(yōu)化熒光雙擴(kuò)鑒定方案，對不同胚胎取樣數(shù)量的性別鑒定效果進(jìn)行分析。如表5所示：1)SD組的雌性胚胎百分率顯著高于4～6組(P<0.05)，其他3組之間差異不顯著。2)SD組的雄性胚胎百分率極顯著低于4～6和7～10組(P<0.01)，與1～3細(xì)胞組差異不顯著；4～6組極顯著高于1～3組(P<0.01)，與7～10組之間差異不顯著。3)1～3組、4～6組、7～10組和SD組胚胎的雌雄比為1.03∶ 1、1∶1.08、1∶1.08和1.09∶1。4)1～3組和SD組的鑒定結(jié)果差率極顯著高于4～6組 和7～10組 (P<0.01)，而1～3組和SD組之間及4～6組和7～10組之間差異不顯著。5)SD組的性別鑒定無反應(yīng)率極顯著高于4～6組和7～10組(P<0.01)，與1～3組差異不顯著；1～3組顯著高于7～10組(P<0.05)，4～6組和7～10組之間差異不顯著。6)4～6組 和7～10組的性別鑒定效率極顯著高于1～3組和SD組(P<0.01)，而1～3組和SD組之間及4～6組 和7～10組之間差異不顯著。7)擴(kuò)增CT值為擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)，由試驗(yàn)結(jié)果可知，隨胚胎細(xì)胞取樣數(shù)增加CT值下降，組間差異極顯著(P<0.01)；SD組極顯著高于4～6組和7～10組(P<0.01)，而極顯著低于1～3組(P<0.01)。

表5 取樣細(xì)胞數(shù)量對熒光雙擴(kuò)方法性別鑒定效果的分析Table 5 Analysis of the effect of the number of cells sampled on the detection of fluorescence multiplex method

2.4 取樣細(xì)胞數(shù)量對胚胎移植妊娠率的影響

為分析取樣操作對胚胎移植妊娠率(pregnancy rate of embryo transfer,P/ET)的影響，對分割取樣前質(zhì)量為1級的胚胎進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如表6所示，隨取樣細(xì)胞數(shù)增加，妊娠率有下降趨勢，但統(tǒng)計(jì)無顯著差異(P>0.05)，綜合分析表5、表6可知，雖然取樣1～3個細(xì)胞也能獲知胚胎性別，但綜合考慮性別鑒定效率和移植妊娠率，最佳取樣細(xì)胞數(shù)量為4～6個。

表6 不同取樣細(xì)胞數(shù)量對胚胎移植妊娠率的影響Table 6 The influence of the number of sampled cells on the pregnant rate of embryo transfer

2.5 試驗(yàn)成本分析比較

為了更加精確地核算胚胎鑒定成本，如表7所示，以鑒定200枚胚胎為例，將PCR電泳法和熒光定量PCR法鑒定成本進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而分別算出單枚胚胎鑒定費(fèi)用，結(jié)果表明，熒光定量PCR法比PCR電泳法成本降低了46.76%。

表7 不同性別鑒定方法成本比較(以每批鑒定200枚計(jì)算)Table 7 Comparison of the cost using different sex identification methods (at 200 embryos per batch)

3 討 論

畜牧業(yè)的發(fā)展促進(jìn)了性別控制方法在實(shí)踐中的應(yīng)用，以提高經(jīng)濟(jì)效益，加快動物的育種進(jìn)程。性控技術(shù)結(jié)合超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)用于奶牛生產(chǎn)中具有重大的實(shí)踐意義[11]。性別控制可以通過精子分離或早期胚胎性別鑒別來實(shí)現(xiàn)[12]。目前，性別分離后的精液每支細(xì)管約有90%的X-精子[13]，集中用于牛的人工授精和體外受精(IVF)程序，當(dāng)用于FSH超排處理的供體母牛其體內(nèi)胚胎生產(chǎn)量低于常規(guī)精液[14]，用于牛胚胎體外生產(chǎn)其受精卵卵裂率、囊胚發(fā)育率以及移植妊娠率顯著低于常規(guī)精液，從而限制了該技術(shù)的進(jìn)一步推廣[15-16]。相反，用PCR法進(jìn)行胚胎性別鑒定能克服用性控精液生產(chǎn)體內(nèi)或體外胚胎的一些局限性，是一個可供選擇的方法[14]。

PCR方法之所以在牛胚胎性別鑒定中較常用是基于特別序列的擴(kuò)增，其操作簡便，用時較短，但PCR擴(kuò)增結(jié)果受很多因素的影響，需要較多的胚胎細(xì)胞才能得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，特別是在胚胎性別鑒定取樣細(xì)胞數(shù)較少的情況下，有時在紫外透射分析儀下根本看不到擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶[17]。污染也可能來自于由分解DNA的裂解細(xì)菌產(chǎn)生的核酸酶。但是，在適當(dāng)?shù)臈l件下操作樣品，并在每次分析之間仔細(xì)沖洗，可以很容易避免這種情況[7]。

1990 年，Sinclair等[18]發(fā)現(xiàn)，決定雄性的是Y染色體短臂上的一個微小片段，稱為Y染色體性別決定基因—SRY基因，是啟動睪丸形成的主基因，即SRY基因是哺乳動物性別決定的開關(guān)。如果沒有SRY基因的存在，性腺原基發(fā)育為卵巢；如果有SRY基因存在，性腺原基則發(fā)育為睪丸[19]。研究表明，SOX9基因在哺乳動物生殖活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，與性別分化、精子發(fā)生等生殖活動密切相關(guān)[20]。此外，DMRT1[21]、SOX9[22-23]、SF1[24]、WT1[25]、LIM1[26]、LHX9[27]、Gadd45G[28]和FOXL2[29]等基因?qū)游镄詣e的決定和性器官的分化起著重要作用。1995年，Daneau等[30]報(bào)道了牛SRY基因的序列，對牛的SRY基因序列進(jìn)行分析表明，牛SRY基因無內(nèi)含子，其間是一個可讀框(ORF)，由687個堿基組成，編碼229個氨基酸，啟動子序列含有特異的CAAT-box和TATA-box結(jié)構(gòu)。各種哺乳動物的Y染色體上均存在SRY基因，它們具有較高的同源性和高度的保守性[31]。因此，SRY基因可以作為性別鑒定的主要目標(biāo)基因[32]。

本研究以SRY基因作為性別鑒定目標(biāo)基因，以進(jìn)口YCD-PCR試劑盒的性別鑒定結(jié)果作為對照組，以熒光雙擴(kuò)和熒光單擴(kuò)作為試驗(yàn)組，通過對性別鑒定效率、無反應(yīng)率、雌雄胚胎比、雌性胚胎產(chǎn)犢準(zhǔn)確率等指標(biāo)的綜合比較，結(jié)果表明，熒光雙擴(kuò)組的雌性胚胎率、雄性胚胎率和雌性胚胎產(chǎn)母犢率均與對照組無顯著差異，無反應(yīng)率極顯著低于對照組，而性別鑒定效率極顯著高于對照組，其雌雄胚胎比也與對照組相似(1∶1.03和1∶1.02)，更接近常規(guī)凍精人工授精的母犢公犢比(1∶1.05)[33]。盡管熒光單擴(kuò)組的雌性胚胎百分率和性別鑒定效率極顯著高于其他兩組，雄性胚胎率、無反應(yīng)率極顯著低于其他兩組，但其雌雄胚胎比值與常規(guī)凍精人工授精有較大偏差(1.03∶1vs1∶1.05)[34]，產(chǎn)母犢準(zhǔn)確率極顯著低于熒光雙擴(kuò)組和對照組。以上分析表明，熒光雙擴(kuò)方法是一種更可行的牛胚胎性別鑒定技術(shù)。

PCR技術(shù)需要對植入前胚胎的卵裂球活檢以進(jìn)行性別鑒定[5]。從牛胚胎中取出一個或多個細(xì)胞是用DNA擴(kuò)增法進(jìn)行胚胎性別鑒定所必需的?；顧z會降低胚胎存活率和胚胎移植妊娠率[33]。但是也有文獻(xiàn)表明，只要不斷加強(qiáng)技術(shù)人員的操作水平，就不會對胚胎存活率造成明顯影響[35]。

盡管在20世紀(jì)80年代后期的第一次研究涉及8～10個細(xì)胞，現(xiàn)在大多數(shù)用于性別鑒定的樣本有4～5個 細(xì)胞，足以達(dá)到理想的靈敏度[6]。Park等[4]用8、4、2、1個卵裂球進(jìn)行連續(xù)多重PCR胚胎性別鑒定的效率分別為100.0%、96.3%、94.3%和92.1%。Tavares等[14]從1 847個胚胎的活檢中獲得了95.9%的平均胚胎有效性別確定率，與其他關(guān)于家畜胚胎性別鑒定的研究一致。本研究用7～10、4～6、1～3個卵裂球進(jìn)行熒光雙擴(kuò)PCR胚胎性別鑒定的鑒定效率分別達(dá)到96.93%、96.56%、93.78%，與以上研究一致。

PCR法對于應(yīng)用是有效的，即使活檢胚胎經(jīng)過冷凍保存，其妊娠率也與非活檢的胚胎相當(dāng)[14]。胚胎移植行業(yè)最常采用的方法是用乙二醇冷凍牛胚胎，解凍后直接移植[36]。Thibier和Nibart[6]在其移植的833例性別鑒定冷凍胚胎中，60～90 d孕檢的移植妊娠率為45.3%。Shea[3]報(bào)道，性別鑒定鮮胚的妊娠率(58%～71%)與常規(guī)鮮胚相當(dāng)，而冷凍/解凍后的性別鑒定胚胎妊娠率較低(37%～66%)，但足以商業(yè)化應(yīng)用。本研究對5 849枚取樣后胚胎進(jìn)行程序化冷凍，解凍后移植，60 d孕檢，取樣4～6細(xì)胞的胚胎移植妊娠率為49.68%，平均移植妊娠率為48.74%，達(dá)到商業(yè)化應(yīng)用水平。

一些研究所用的牛Y染色體特異性DNA探針鑒定成本為13美元[6]，Tavares等[14]在2015年用PCR和電泳方法平均成本接近每樣本2美元。本研究用進(jìn)口YCD-PCR試劑盒鑒定1枚胚胎成本約為14.64美元，而熒光雙擴(kuò)方法鑒定成本為7.79美元，鑒定成本降低了46.76%，更加有利于性別鑒定胚胎的推廣應(yīng)用。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種新型的牛早期胚胎性別鑒定方法，其熒光雙引物混合擴(kuò)增方法產(chǎn)母犢準(zhǔn)確率高，鑒定成本低，取樣4～6細(xì)胞的胚胎移植妊娠率最高，適于商業(yè)化應(yīng)用，是一種更可行的牛胚胎性別鑒定技術(shù)，更有利于產(chǎn)業(yè)化推廣和應(yīng)用。