CTSD對黔北麻羊卵泡顆粒細胞的調控機制及功能分析

周志楠，陳 祥*，張 艷，楊沛方，惠茂茂，唐 文，洪 磊

(1.貴州大學 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025)

繁殖性狀，特別是多羔性狀，是山羊重要的經(jīng)濟性狀。隨著人們生活水平的提高和對羊肉需求量的增加，提高地方山羊品種的繁殖力十分重要，但山羊的多羔遺傳效力低，每胎僅產(chǎn)1～2羔，在一定程度上限制了山羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，故研究與產(chǎn)羔數(shù)相關的主效基因可提高山羊繁殖力，對養(yǎng)羊業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。黔北麻羊是貴州省優(yōu)良地方品種之一，因其具有高產(chǎn)、早熟、耐粗飼等特點而被專家批準為貴州省新遺傳資源，是研究山羊繁殖性能的理想模型[1-2]。組織蛋白酶(cathepsin,CTS)家族已被證實廣泛存在于各類細胞或組織中并參與表達[3]，能夠催化蛋白質的水解并調節(jié)各種正常的生物學過程，例如細胞死亡、增殖、遷移、癌癥以及抗原抗體的加工等[4-5]。組織蛋白酶家族包含多種亞型，到目前為止，組織蛋白酶A至Z均有研究報道[6]。就組織蛋白酶的水解機制而言，組織蛋白酶主要包括半胱氨酸組織蛋白酶(組織蛋白酶B、C、S、Z等)、絲氨酸組織蛋白酶(組織蛋白酶A、G)和天冬氨酸組織蛋白酶(組織蛋白酶D、E)[7]。組織蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)是溶酶體的主要成分之一，在細胞內以兩條鏈形式存在，由二硫鍵連接的氨基末端輕鏈(14 ku)和羧基末端重鏈(34 ku) 組成[7]，主要參與蛋白質的水解，也與細胞凋亡的誘導與促進、癌癥的發(fā)展、周期有關[8]。大量研究表明，CTSD是一種普遍表達的天冬氨酸溶酶體蛋白酶，在大多數(shù)組織和細胞中發(fā)揮作用。不僅有利于肌肉的自溶，而且在調節(jié)小鼠情緒穩(wěn)定中起重要作用[9]，還是豬經(jīng)濟性狀的候選基因[10]。此外，CTSDmRNA已在子宮[11]、肝[12]、卵巢[13]和骨[14]等多個組織中建立表達圖譜。且CTSD的表達會受到卵巢中孕激素的調控，在卵母細胞發(fā)育期間表達量顯著升高，是卵母細胞發(fā)育過程中的關鍵酶之一；還有研究表明，CTSD的遺傳變異可能與卵巢的品質性狀有關[15]，在妊娠早期綿羊的卵巢中也能夠檢測到此基因的表達[11]。雖然CTSD已在豬[16]、牛[17]、綿羊[18]等多種動物中克隆及測序驗證，但其對山羊顆粒細胞的影響機理及產(chǎn)羔性狀的調控機制未見研究報道。

本研究通過構建pEGFP-N3-CTSD真核表達載體并導入黔北麻羊卵泡顆粒細胞以驗證其對顆粒細胞增殖、凋亡、周期及相關因子表達的影響機制，同時判斷顆粒細胞中上調CTSD對多胎性狀候選基因在轉錄與翻譯水平的表達變化，以期為進一步探明CTSD對山羊產(chǎn)羔性狀的調控機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黔北麻羊來自遵義市習水縣富興牧業(yè)有限公司，根據(jù)繁殖記錄，分別選取飼糧組成、免疫程序、飼養(yǎng)環(huán)境等外部因素均相同的5只36周齡的多胎(產(chǎn)羔數(shù)量為3只)黔北麻羊母羊進行放血屠宰，分兩批進行，屠宰時嚴格按照貴州地方標準《羊屠宰操作規(guī)程》(DB22/T 2740—2017)進行，將采集的卵巢組織分為兩個部分，用于組織總RNA提取的卵巢組織置于液氮(-196 ℃)中保存。其次，將用于卵泡顆粒細胞培養(yǎng)的卵巢組織置于預冷的含青鏈霉素的PBS磷酸鹽緩沖液(事前經(jīng)高溫高壓滅菌處理)中保存。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol?試劑、第一鏈cDNA合成試劑盒、熒光定量Mix、液氮、TAE緩沖液、異丙醇、無水乙醇、西班牙瓊脂糖、卡那霉素粉末、PBS緩沖液、LipofectamineTM3000 Reagent均購自艾瑞特生物(貴州)；膠回收試劑盒購自康為世紀生物科技(北京)；無內毒素質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)；限制性核酸內切酶EcoR I、Xho I與DNA Maker 2000、DNA Maker 5000均購自寶生物工程(大連)；DNA連接試劑盒、LB肉湯均購自生工生物工程(上海)；CCK-8細胞增殖試劑購自碧云天生物技術(上海)；兔抗CTSD多克隆抗體(bs-1615R)、兔抗BMPR-IB抗體(bs-6639R)、兔抗FSHR抗體(bs-0895R)、兔抗INHA抗體(bs-1032R)均購自Bioss(北京)；內參抗體β肌動蛋白(AF7018)購自Affinity(美國)；0.25%不含EDTA胰酶、DMEM/F-12、胎牛血清、青鏈霉素混合液均購自Gibco(美國)；細胞周期與細胞凋亡試劑盒購自凱基生物技術(江蘇)。pEGFP-N3載體由本實驗室保存。

瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、超微量分光光度計、PCR擴增儀(C1000 TouchTM)、流式細胞儀均購自Thermo Scientific(美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 目的基因、功能基因引物的設計與合成 以GenBank庫中發(fā)布的山羊CTSD基因mRNA序列(登錄號：XM_018043344.1)為參考；利用Primer 5軟件設計兩對引物，其中，熒光定量引物用于RT-qPCR 試驗，CDS區(qū)擴增引物用于載體的構建，在擴增引物的上、下游處分別添加Xho I與EcoR I酶切位點。同時，以山羊BMPR-IB(登錄號：XM_013964509.2)、FSHR(登錄號：NM_001285636.1)、INHA(登錄號：NM_001285606.1)為功能基因參照，以山羊Bcl-2(登錄號：XM_01 8039337.1)、Bax(登錄號：XM_013971446.2)、Caspase-3(登錄號：XM_018041755.1)為細胞凋亡相關基因參照，以CyclinA1(登錄號：XM_018056659.1)、CyclinD2(登錄號：XM_005680985.3)、CyclinE(登錄號：XM_018062248.1)為細胞周期相關因子參照。分別設計9對用于RT-qPCR試驗的引物，內參基因β-actin參照周志楠等[19]所用序列。引物詳細信息見表1。設計完畢后將引物送至生工生物工程(上海)技術服務股份有限公司合成。

表1 各引物詳細信息Table 1 Detailed information of each primer

1.3.2 組織總RNA的提取及cDNA的合成 使用液氮研磨結合TRIzol試劑提取黔北麻羊卵巢組織總RNA，提取完畢后，取1 μL RNA提取液置于超微量分光光度計中檢測其濃度及純度，根據(jù)濃度值、RNA圖譜及OD260 nm/OD280 nm比值判斷RNA的質量。同時，以cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將卵巢組織RNA逆轉錄合成cDNA第一鏈，體系為20 μL：RNA Template 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，DEPC-ddH2O 7 μL，2× Reaction mix 10 μL，StarScript II RT mix 1 μL。短暫混勻離心后，于PCR儀中42 ℃孵育50 min，85 ℃酶失活孵育5 min，合成的cDNA產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 pEGFP-N3-CTSD真核表達載體的構建 以合成的卵巢cDNA第一鏈為模板，PCR擴增CTSD基因的CDS區(qū)，擴增后，在紫外光的照射下將含有目的條帶的膠條切下，根據(jù)康為(北京)試劑有限公司試劑盒說明書進行回收。復蘇pEGFP-N3載體，用Xho I與EcoR I進行雙酶切(37 ℃水浴3 h) 使其暴露與擴增引物相同的粘性末端，并將產(chǎn)物與酶切后的pEGFP-N3載體進行連接(16 ℃金屬浴12 h)，隨后，將連接產(chǎn)物加入復蘇后的大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，并均勻涂布至含有卡那霉素抗性的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，用槍頭挑取平板中的白色斑點至裝有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，搖晃擴大培養(yǎng)16 h(37 ℃，200 r·min-1)。待菌液渾濁后，進行菌液PCR反應，篩選出陽性菌液進行測序驗證，將測序比對正確的陽性菌液擴大培養(yǎng)并進行無內毒素質粒的提取，隨后使用EcoR I與Xho I對質粒進行雙酶切檢測，判斷pEGFP-N3-CTSD真核表達載體是否構建成功。

1.3.4 黔北麻羊卵泡顆粒細胞的分離培養(yǎng) 黔北麻羊卵泡顆粒細胞的分離培養(yǎng)方法參考文獻[20]，即在超凈工作臺中，使用75%酒精、蒸餾水與PBS緩沖液對卵巢組織進行沖洗，10號針頭扎破卵巢表面的大卵泡，使卵泡液流入含有青鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，并用吸頭吸取DMEM/F-12培養(yǎng)基反復沖洗卵巢組織，使卵巢中的卵泡液盡可能被沖出以提高細胞數(shù)量，然后將含有卵泡液的DMEM/F-12移至10 mL滅菌離心管中，靜置10～20 min沉淀細胞，800 r·min-1離心10 min，棄除上層液體，再加入適量的DMEM/F-12培養(yǎng)基吹打混勻，制成懸液。隨后將其轉移至25 cm2透氣細胞培養(yǎng)瓶中，向瓶中加入由10%胎牛血清、2%青鏈霉素、88%DMEM/F-12組成的完全培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長后方可第一次換液，第一次換液后每隔48 h對細胞進行換液。

1.3.5 pEGFP-N3-CTSD真核表達質粒轉染細胞 待細胞培養(yǎng)瓶中細胞密度達到90%時，用胰酶消化細胞并鋪至6孔板內，按Lipofecta mineTM3000 Reagent試劑盒說明書分別將空載體pEGFP-N3、真核表達質粒pEGFP-N3-CTSD導入細胞，每孔設置3個重復。細胞轉染24 h后，在細胞倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白數(shù)量以初步判斷轉染效率。

1.3.6 細胞增殖檢測 細胞轉染24 h后，將6孔板取出，用PBS緩沖液清洗3次，每孔加入500 μL胰酶37 ℃消化3～5 min，待細胞消化80%～90%后加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻后鋪至96孔板，并設置不同細胞濃度梯度，以確定細胞生長曲線，每組設置5個重復，隨后將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至完全貼壁，每孔加入10 μL CCK-8試劑，再放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，以保證CCK-8試劑完全與細胞發(fā)生反應，反應結束后，在酶標儀中分別測定細胞在0、6、12、24、48、72 h的吸光值以判斷細胞增殖情況。

1.3.7 細胞周期檢測及數(shù)據(jù)分析 本研究采用流式細胞技術檢測pEGFP-N3-CTSD真核表達質粒對黔北麻羊卵泡顆粒細胞凋亡及周期的影響，細胞轉染48 h后，棄去各孔中的舊培養(yǎng)基，用預冷的PBS清洗3遍，用0.25%不含EDTA的胰酶消化細胞，待細胞從孔壁脫落時，加入完全培養(yǎng)基終止消化并將其收集至離心管中，4 ℃ 2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，再使用預冷的75%乙醇重懸細胞，4 ℃過夜固定，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，使用PBS緩沖液清洗細胞使其成為細胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，在避光條件下加入500 μL用PBS配置的PI染色液，4 ℃避光保存，1 h后通過流式細胞儀檢測細胞周期，檢測完畢后使用Excel軟件記錄細胞不同周期的數(shù)量，用T-TEST判斷顯著性,并使用Graphpad prism 6軟件進行繪圖。

1.3.8 細胞凋亡檢測及數(shù)據(jù)分析 與細胞周期檢測類似，在細胞轉染24 h時，通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞轉染效率并更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，使用凱基生物技術公司的Annexin V-EGFP/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測，用0.25%不含EDTA的胰酶消化細胞后，轉至離心管中800 r·min-1離心5 min，棄上清，用預冷的PBS緩沖液反復清洗管底細胞，800 r·min-1離心5 min，棄上清，先后加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞、5 μL Annexin V-EGFP 與5 μL Propidium Iodide，混勻后室溫避光反應30 min，反應結束后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。數(shù)據(jù)分析與細胞周期類似。

1.3.9 細胞水平實時熒光定量PCR檢測分析 分別將pEGFP-N3-CTSD真核表達質粒與pEGFP-N3空載體導入細胞24 h后，提取細胞中的總RNA并進行定量，隨后進行逆轉錄，方法見“1.3.2”，逆轉錄結束后，以cDNA第一鏈為模板結合相關引物進行實時熒光定量PCR反應，反應預混液體系為20 μL：上、下游引物(10 μmoL·L-1)各0.6 μL，cDNA 模板1 μL，2× RealStar Green Fast Mixture 10 μL，ddH2O補充至20 μL。檢測pEGFP-N3-CTSD真核表達質粒對目的基因CTSD，功能基因BMPR-IB、FSHR、INHA，細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3及細胞周期蛋白因子CyclinA1、CyclinD2、CyclinE在轉錄水平的表達變化，反應結束后，使用2-ΔΔCt對相關基因在細胞水平的實際表達量進行計算，用單因素方差分析及T-TEST計算差異是否達到顯著水平，分別以P<0.05、P<0.01作為差異顯著與極顯著的判斷標準。

1.3.10 細胞總蛋白的提取 細胞轉染48 h后，將6孔板取出，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后，每孔加入200 μL 細胞RIPA裂解液(含2 μL PMSF，以防止蛋白快速降解)，置于冰上裂解35 min，期間使用槍頭或細胞刮可能將貼壁細胞刮至裂解液中以提高蛋白濃度，裂解完畢后，收集裂解液于1.5 mL離心管中，13 000 r·min-1離心15 min，將上清液轉移至新的離心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.3.11 Western blot檢測及數(shù)據(jù)分析 根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明書對所提取的蛋白進行定量分析，定量后加入蛋白上樣緩沖液(蛋白∶蛋白上樣緩沖液=4∶1),置于水浴鍋中99 ℃煮沸10 min，每孔加入20 μg蛋白與5 μL蛋白彩虹Marker，并設置3個重 復，60 V電泳30 min、110 V電泳70 min，隨后進行轉PVDF膜(100 mA，2 h)、封閉(5%脫脂奶粉TBST溶液，37 ℃、2 h)，在將PVDF膜放入TBST稀釋的兔抗CTSD(1∶2 000)、兔抗β-actin(1∶3 000)、兔抗BMPR-IB(1∶2 000)、兔抗FSHR(1∶1 500)、兔抗INHA(1∶1 000)一抗溶液中4 ℃孵育16 h。第二天回收一抗，TBST洗膜3次，每次10 min。在將PVDF膜放入按1∶2 000稀釋比稀釋的HRP標記山羊抗兔的二抗溶液中，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL超敏化學發(fā)光液進行顯色，并將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中進行成像，使用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析，SPSS 19.0軟件對差異表達量進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 PCR擴增檢測相關引物特異性

以卵巢組織cDNA第一鏈為模板，RT-PCR擴增CTSD基因CDS區(qū)。以細胞cDNA第一鏈為模板，PCR擴增檢測功能基因、細胞凋亡因子與細胞周期蛋白因子的熒光定量引物特異性，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。由圖1可知，PCR擴增出的CTSD基因CDS區(qū)引物條帶較亮，片段大小一致，可進行膠回收試驗。功能基因、細胞凋亡因子與細胞周期蛋白因子引物大小與預測大小一致，條帶單一、明亮且無非特異性擴增，可用于RT-qPCR分析。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Agarose gel electrophoresis to detect PCR amplification products

2.2 pEGFP-N3-CTSD真核表達載體的鑒定

將從卡那霉素的LB平板中挑取的白斑進行菌液PCR反應，初步驗證并篩選真核表達載體是否構建成功，結果發(fā)現(xiàn)(圖2A)，PCR擴增出與CTSD基因CDS區(qū)大小一致的目的片段，初步篩選該菌液為陽性菌液，測序比對后發(fā)現(xiàn)，黔北麻羊CTSD基因CDS區(qū)片段與山羊CTSD基因CDS區(qū)片段完全吻合，序列比對正確率達100%(圖2B)，雙酶切結果表明，酶切產(chǎn)物具有上、下兩個條帶，其上條帶4 729 bp處代表pEGFP-N3空載體片段，而下條帶1 239 bp處則代表黔北麻羊CTSD基因CDS區(qū)片段，菌液PCR、測序結果及雙酶切驗證表明,pEGFP-N3-CTSD真核表達載體構建成功。

A.菌液PCR檢測結果；B.pEGFP-N3-CTSD真核表達載體部分測序結果，其中B1表示山羊CTSD基因CDS區(qū)原序列、B2表示擴增出的黔北麻羊CTSD基因的CDS區(qū)序列；C.pEGFP-N3-CTSD真核表達載體雙酶切結果A.The result of PCR detection of bacterial liquid;B.The partial sequencing result of pEGFP-N3-CTSD eukaryotic expression vector，B1 represents the original sequence of the CDS region of the CTSD gene of goat，B2 represents the sequence of the amplified CDS region of the CTSD gene of Qianbei Ma goat;C.The result of double enzyme digestion of pEGFP-N3-CTSD eukaryotic expression vector圖2 pEGFP-N3-CTSD真核表達載體的鑒定結果Fig.2 Identification results of eukaryotic expression vector of pEGFP-N3-CTSD

2.3 黔北麻羊原代卵泡顆粒細胞的培養(yǎng)

分別在黔北麻羊原代卵泡顆粒細胞培養(yǎng)的6、12、24、48 h進行拍照記錄其形態(tài)變化，由圖3A可知，在細胞培養(yǎng)6 h時，已基本貼壁，但大都成“點”狀，部分成“條”狀，細胞輪廓不明顯。細胞培養(yǎng)至12 h時，已基本定形，輪廓開始明顯。到24 h時，細胞開始變大、變圓，紡錘形已十分明顯，數(shù)量也成倍增加。48 h時，細胞數(shù)量已占滿細胞培養(yǎng)瓶的70%～80%，隔天便可進行消化鋪板或傳代試驗。

A.細胞分離培養(yǎng)6 h；B.細胞分離培養(yǎng)12 h；C.細胞分離培養(yǎng)24 h；D.細胞分離培養(yǎng)48 hA.Cell isolation and culture for 6 h；B.Cell isolation and culture for 12 h；C.Cell isolation and culture for 24 h；D.Cell isolation and culture for 48 h圖3 黔北麻羊卵泡顆粒細胞分離培養(yǎng)的形態(tài)變化(100×)Fig.3 Morphological changes of follicular granulosa cells from Qianbei Ma goat (100×)

2.4 重組質粒轉染效果檢測

細胞轉染24 h后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，未轉染質粒的空白組呈現(xiàn)一片漆黑(圖4A)，pEGFP-N3空載體轉染組、pEGFP-N3-CTSD重組質粒轉染組因含有綠色熒光蛋白GFP在藍色光源的激發(fā)下，細胞中發(fā)出大量的綠色熒光(圖4B和4C中高亮部分)，且細胞6孔板中無漂浮的死細胞，陽性細胞數(shù)量占比80%以上，初步證實pEGFP-N3空載體與pEGFP-N3-CTSD重組質粒已導入細胞，但還需要進一步從轉錄與翻譯水平上進行判斷。

A.空白組；B.pEGFP-N3組；C.pEGFP-N3-CTSD組A.Blank group;B.pEGFP-N3 group;C.pEGFP-N3-CTSD group圖4 重組質粒轉染顆粒細胞熒光圖(100×)Fig.4 Fluorescence of granulosa cells transfected with recombinant plasmid (100×)

2.5 重組質粒在顆粒細胞中的表達效率驗證

本研究使用RT-qPCR與Western blot技術分別在轉錄與翻譯水平上檢測重組質粒的真核表達效率。由圖5可知，相對于空載體pEGFP-N3，重組質粒pEGFP-N3-CTSD轉染后在轉錄與翻譯水平上均能夠極顯著上調CTSDmRNA與蛋白在顆粒細胞中的表達(P<0.01)，說明重組質粒的真核表達效率較高，可用于下一步分析與檢測。

圖5 重組質粒表達效率檢測Fig.5 Recombinant plasmid expression efficiency detection

2.6 重組質粒對顆粒細胞增殖的影響

CCK-8細胞增殖檢測結果顯示(圖6)，pEGFP-N3-CTSD轉染后在被檢測的6個時間段內顆粒細胞的增殖水平均低于pEGFP-N3空載體組，且除了0與6 h外，在其余4個時間段的增殖檢測結果發(fā)現(xiàn)，重組質粒pEGFP-N3-CTSD對顆粒細胞增殖的抑制作用均達到了極顯著水平(P<0.01)，說明CTSD的高表達可以抑制顆粒細胞的增殖。

圖6 pEGFP-N3-CTSD轉染后顆粒細胞的增殖情況Fig.6 Proliferation of granulosa cells after pEGFP-N3-CTSD transfection

2.7 重組質粒對顆粒細胞凋亡及細胞凋亡相關基因表達的影響

細胞凋亡檢測結果見圖7。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，相比于pEGFP-N3，pEGFP-N3-CTSD轉染后能夠極顯著促進顆粒細胞的凋亡(P<0.01)，說明CTSD的高表達會促進顆粒細胞的凋亡。同時，為進一步闡明其促凋亡機制，本試驗研究了細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，pEGFP-N3-CTSD在轉染后能極顯著上調促凋亡基因Bax與Caspase-3的表達(P<0.01)，對抗凋亡基因Bcl-2起到了顯著的下調作用(P<0.05)。

A1～A3.pEGFP-N3對顆粒細胞凋亡的檢測結果；B1～B3.pEGFP-N3-CTSD對顆粒細胞凋亡的檢測結果；C.pEGFP-N3-CTSD轉染后的細胞凋亡率；D.pEGFP-N3-CTSD對細胞凋亡相關因子表達的影響A1-A3.The detection results of pEGFP-N3 on granulosa cell apoptosis；B1-B3.The detection results of pEGFP-N3-CTSD on granulosa cell apoptosis；C.The apoptosis rate after pEGFP-N3-CTSD transfection；D.The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of apoptosis-related factors圖7 重組質粒pEGFP-N3-CTSD對顆粒細胞凋亡及相關基因表達的影響Fig.7 Effect of recombinant plasmid pEGFP-N3-CTSD on apoptosis of granulosa cells and related genes expression

2.8 重組質粒對顆粒細胞周期及相關基因表達的影響

利用流式細胞儀檢測重組質粒pEGFP-N3-CTSD對細胞周期的影響，結果見圖8，相比于pEGFP-N3空載體組，pEGFP-N3-CTSD轉染后能極顯著上調G0/G1期及G2/M期的細胞數(shù)量，同時極顯著下調S期的細胞數(shù)量(P<0.01)，為進一步了解重組質粒pEGFP-N3-CTSD對細胞周期的影響機制，本研究還發(fā)現(xiàn)，pEGFP-N3-CTSD轉染后能極顯著上調細胞周期相關因子CyclinA1基因的表達(P<0.01)，能極顯著下調CyclinD2基因的表達(P<0.01)，對CyclinE基因的表達也起到了下調作用，但并未達到顯著水平(P>0.05)。

A1～A3.pEGFP-N3對顆粒細胞周期的檢測結果；B1～B3.pEGFP-N3-CTSD對顆粒細胞周期的檢測結果；C.細胞在各個周期所占的比率；D.pEGFP-N3-CTSD對細胞周期蛋白因子表達的影響A1-A3.The detection results of pEGFP-N3 on the granulosa cell cycle；B1-B3.The detection results of pEGFP-N3-CTSD on the granulosa cell cycle；C.The percentage of cells in each cycle；D.The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of cyclin factors圖8 重組質粒pEGFP-N3-CTSD對顆粒細胞周期及相關基因表達的影響Fig.8 The effect of recombinant plasmid pEGFP-N3-CTSD on granulosa cell cycle and related genes expression

2.9 重組質粒對顆粒細胞功能相關基因與蛋白表達的影響

為了檢測CTSD對顆粒細胞中多胎性狀候選基因表達的影響，本研究使用RT-qPCR與Western blot技術檢測重組質粒pEGFP-N3-CTSD轉染后對BMPR-IB、FSHR與INHA 在轉錄與翻譯水平的表達變化，由圖9可知，相比于pEGFP-N3空載體組，pEGFP-N3-CTSD轉染后均能極顯著下調顆粒細胞中多胎性狀候選基因BMPR-IB、FSHR與INHAmRNA與蛋白的表達(P<0.01)，提示，顆粒細胞中CTSD的上調對多胎性狀候選基因的表達起到了抑制作用。

A.pEGFP-N3-CTSD轉染后對BMPR-IB、FSHR與INHA基因表達的影響；B、C.pEGFP-N3-CTSD轉染后對BMPR-IB、FSHR與INHA蛋白表達的影響A.The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of BMPR-IB，F(xiàn)SHR and INHA genes after transfection；B,C.The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of BMPR-IB，F(xiàn)SHR and INHA proteins after transfection圖9 重組質粒pEGFP-N3-CTSD轉染顆粒細胞后對功能基因與蛋白表達的影響Fig.9 Effects of recombinant plasmid pEGFP-N3-CTSD transfected granulosa cells on the expression of functional genes and proteins

3 討 論

產(chǎn)羔性狀是山羊重要的繁殖性狀與經(jīng)濟性狀之一，而排卵率是衡量山羊產(chǎn)羔數(shù)量高低的重要指標，有關綿羊的遺傳學研究表明，產(chǎn)羔數(shù)量與排卵率可以通過不同的基因進行調控[21]。此外，排卵率還受到哺乳動物卵巢卵泡的增殖分化、顆粒細胞的生長發(fā)育、多種激素以及生長因子相互調控的影響[22]。轉化生長因子β家族(TGFβ)的生長因子在卵泡發(fā)育過程中起著重要作用，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族的成員。它們在原型上參與骨骼的形成，但也顯示出它們是能夠調節(jié)細胞增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和凋亡的多功能細胞因子[23]。在動物體內BMPs主要通過其受體(BMPRs)來發(fā)揮作用。早期研究表明，BMPR-IB可以影響垂體和卵巢的生理活動，影響顆粒細胞的分化和排卵卵泡的成熟。同時，BMPR-IB編碼區(qū)的突變與Booroola綿羊的繁殖力完全相關(FecB突變)，F(xiàn)ecB突變對增加羊的排卵數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)具有促進作用[24]。攜帶FecB突變的母羊能獲得更加優(yōu)良的多胎性能，故BMPR-IB可促進山羊的產(chǎn)羔。抑制素(inhibin)也是TGF-β家族成員之一，INHA是抑制素家族中的亞型，由卵巢卵泡的顆粒細胞分泌，有研究發(fā)現(xiàn)，INHA的表達量隨著卵泡的發(fā)育而增加，在排卵前的卵泡顆粒細胞中也能夠檢測到INHA的存在，說明INHA是影響卵泡生長發(fā)育的重要因子[25]。目前大量研究均集中于INHA基因的遺傳變異，其編碼區(qū)堿基位點的突變均能夠促進不同物種的產(chǎn)羔(仔)數(shù)量[26-27]。卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，主要在哺乳動物卵巢中表達。最新的研究證實，F(xiàn)SHR還可以廣泛表達于顆粒細胞[28]和脂肪細胞[29]等各類細胞中，其表達量與哺乳動物各類卵泡的發(fā)育呈正相關，F(xiàn)SHR基因編碼區(qū)的突變也對不同羊種的產(chǎn)羔數(shù)具有正向意義，故研究學者多通過研究FSHR基因來探究卵泡的發(fā)育及排卵。目前，針對CTSD對山羊產(chǎn)羔性狀影響機制的研究較少。假設CTSD對山羊的產(chǎn)羔數(shù)有重要影響，故本研究構建重組質粒pEGFP-N3-CTSD導入細胞后驗證其對多胎性狀候選基因BMPR-IB、INHA與FSHR表達的影響，發(fā)現(xiàn)在顆粒細胞中上調CTSD后能夠極顯著降低山羊多胎性狀候選基因BMPR-IB、INHA與FSHR在轉錄與翻譯水平的表達(P<0.01)，即上調CTSD能夠下調BMPR-IB、INHA與FSHR的表達，提示CTSD可能通過影響顆粒細胞中多胎性狀候選基因的表達水平進而間接地調節(jié)卵泡發(fā)育，進而調控山羊的產(chǎn)羔性狀。

近年來，排卵被描述為一個復雜的生理過程，在哺乳動物卵泡發(fā)育的過程中，超過99%的卵泡會發(fā)生閉鎖而凋亡退化，只有極少數(shù)的卵泡能夠發(fā)育成熟、破裂進而排卵[30]，而排卵能上調細胞凋亡相關基因的表達[31]。本研究使用流式細胞技術發(fā)現(xiàn)，在顆粒細胞中上調CTSD后，能夠在被檢測的4個時間段(12、24、48、72 h)極顯著地抑制細胞的增殖，同時極顯著促進細胞凋亡(P<0.01)。早在1996年，Deiss等[32]首次在研究中提出，CTSD參與了細胞凋亡的調控，可以通過不同的機制發(fā)揮作用或誘導細胞凋亡?，F(xiàn)如今大量研究均已證實，CTSD能夠促進細胞的凋亡[33]，這與本研究中流式細胞儀所展現(xiàn)的結果相符。為了進一步研究其影響機制，本研究選取了Bcl-2(抗凋亡基因)、Bax、Caspase-3(促凋亡基因)，驗證顆粒細胞中上調CTSD后對凋亡相關基因表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)，CTSD的高表達能夠顯著降低Bcl-2基因的表達(P<0.05)，極顯著提高Bax、Caspase-3基因的表達(P<0.01)，這更加確定了流式細胞儀檢測顆粒細胞凋亡的結果。研究表明，CTSD可以通過兩種途徑誘導細胞凋亡，當溶酶體中CTSD釋放到細胞質后，引發(fā)線粒體功能障礙導致線粒體中胱天蛋白酶激活劑的釋放，進一步激活Caspase-3因子，導致細胞凋亡[34]，此機制與本研究結果一致。此外，Bcl-2家族(包括抗凋亡成員Bcl-2以及促凋亡成員Bax)是通過連接所產(chǎn)生的存活和細胞死亡信號來調控凋亡的主要調節(jié)劑，它們之間可以通過相互作用使線粒體膜通透性升高導致細胞凋亡[35]，故推測，CTSD主要通過線粒體途徑引發(fā)山羊顆粒細胞的凋亡。

細胞周期檢測結果發(fā)現(xiàn)，在顆粒細胞中上調CTSD后，能極顯著上調G0/G1期與G2/M期細胞比例(P<0.01)，極顯著下調S期比例(P<0.01)，這提示我們，CTSD的高表達能夠明顯地將顆粒細胞阻滯在了G0/G1期與G2/M期。一般認為，S期與G2/M期所占的比例之和能夠反映細胞的增殖能力，在本研究中，pEGFP-N3-CTSD轉染后顆粒細胞在S期下降的比例高于G2/M期升高的比例，故S期+G2/M期顆粒細胞的總數(shù)量降低，即CTSD的高表達對顆粒細胞的增殖起到了抑制作用，這與CCK-8試劑檢測結果一致。為了進一步探究CTSD高表達對細胞周期的影響，本研究選取了細胞周期相關因子CyclinA1、CyclinD2、CyclinE，并檢測它們在轉錄水平中的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)，pEGFP-N3-CTSD在轉染后能夠極顯著地提高推動細胞從S期向G2/M期轉換的周期因子CyclinA1[36]的表達。極顯著降低CyclinD2的表達，CyclinD2是細胞周期相關因子CyclinD家族中的一個亞型，主要在細胞的G0/G1期發(fā)揮作用，在G1期的早期合成，在G1期的晚期高表達[37]，并在G1期與G1/S交界處起重要的推進作用。故推測在本研究中CyclinD2表達量的降低可能是細胞被阻滯在G0/G1期的主要原因，但CTSD的高表達對調控細胞從G0/G1期向S期轉換的周期因子CyclinE[38]的表達變化卻不顯著，細胞周期相關因子的表達變化均在本研究的流式細胞結果中得到了體現(xiàn)，故推測，CTSD的高表達主要是通過調控細胞中CyclinA1、CyclinD2的表達影響顆粒細胞的增殖、分化與生理功能，進而影響卵泡的生長發(fā)育與排卵。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)，CTSD的高表達會抑制細胞增殖、促進凋亡并提高細胞凋亡相關因子Bax與Caspase-3的表達，降低細胞抗凋亡因子Bcl-2的表達。在顆粒細胞中上調CTSD后能通過提高細胞周期因子CyclinA1，降低CyclinD2的表達將顆粒細胞阻滯在G0/G1期與G2/M期，降低細胞在S期的數(shù)量，同時，顆粒細胞中上調CTSD后能極顯著下調多胎性狀候選基因BMPR-IB、FSHR、INHA在轉錄與翻譯水平的表達量。本研究提示，CTSD可能對山羊卵泡顆粒細胞的生物學行為及山羊的多胎性狀具有重要作用，為今后進一步探討CTSD的生物學功能及揭示CTSD在卵泡發(fā)育過程中的作用奠定基礎。