過表達(dá)NR4A1促進(jìn)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化

崔 勝，王 永，朱江江，熊 燕，林亞秋*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

羊肉的品質(zhì)特性研究日益受到重視，肉質(zhì)性狀包括pH、肉色、大理石紋、系水力、嫩度、多汁性和肌內(nèi)脂肪含量等，在影響肉質(zhì)的眾多因素中，肌內(nèi)脂肪含量是影響羊肉肉質(zhì)性狀的重要因素。肌內(nèi)脂肪含量受脂肪細(xì)胞的數(shù)量以及體積影響，在熱量攝入增加的情況下，白色脂肪組織會(huì)通過增加現(xiàn)有脂肪細(xì)胞的大小和通過前體脂肪細(xì)胞形成新的脂肪細(xì)胞而擴(kuò)大，從而導(dǎo)致脂肪細(xì)胞數(shù)量增加[1-3]。肌內(nèi)脂肪沉積受多種因素干擾，近年來，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脂肪沉積調(diào)控的研究越來越多。

核受體超家族是一大群調(diào)節(jié)機(jī)體生理穩(wěn)態(tài)與特定相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。雖然該組中的許多核受體已被充分表征，但是存在大量且不斷增加的具有未知功能或配體的受體，稱為孤兒核受體[4-6]。核受體家族成員NR4A1(nuclear receptor subfamily 4 group a member 1)，也被稱為Nur77、TR3和NGFI-B，分布在多種細(xì)胞內(nèi)，具有功能多樣性，對(duì)多種生理過程都發(fā)揮著重要作用[7]，包括細(xì)胞增殖和凋亡等生命活動(dòng)[8-12]。在細(xì)胞凋亡的研究中，Liu等[13]的研究結(jié)果表明，干擾素刺激基因12a(ISG12a)及其相互作用伴侶NR4A1均參與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡；Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Nur77通過與谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)啟動(dòng)子上的特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合來增強(qiáng)GPX1啟動(dòng)子的反式激活，從而上調(diào)GPX1的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)胰腺β細(xì)胞凋亡。同時(shí)，NR4A1也有抗細(xì)胞增殖的作用，有研究證明，NR4A1/3通過直接結(jié)合造血特異性C/EBPα增強(qiáng)劑并激活C/EBPα轉(zhuǎn)錄，部分地通過激活C/EBPα驅(qū)動(dòng)的抗增殖網(wǎng)絡(luò)來限制HSC增殖[15]；Hedrick等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在橫紋肌肉瘤(RMS)中過表達(dá)或者干擾Nur77或用Nur77拮抗劑(DIM-C-pPhOH)均對(duì)RMS細(xì)胞有抗增殖作用。NR4A1也具有調(diào)節(jié)線粒體的功能，Zhu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1/DNA-PKcs/p53途徑參與了乳酸加速血管鈣化的機(jī)制，部分原因是過度的Drp介導(dǎo)的線粒體裂變和線粒體促凋亡蛋白基因相關(guān)的線粒體缺乏；Sheng等[18]研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1干擾打斷了線粒體外膜受體相關(guān)的線粒體裂變，并取消了帕金森介導(dǎo)的線粒體吞噬，從而減少了高血糖介導(dǎo)的線粒體損傷，改善了腎功能。線粒體是有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，而上述研究表明，NR4A1可以調(diào)節(jié)線粒體的功能，表明NR4A1可能與能量穩(wěn)態(tài)有關(guān)。在脂肪方面的研究，秦丹丹[19]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NR4A1可抑制小鼠的脂肪細(xì)胞分化，同時(shí)有研究表明，干擾Nur77可下調(diào)HFD飼喂雌性小鼠白色脂肪組織的乙酰輔酶A羧化酶α(ACCα)和脂肪酸(FAS)，進(jìn)一步調(diào)控脂肪代謝[20]，Jung等[21]研究發(fā)現(xiàn)，用Nur77抑制劑抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的脂肪形成，伴隨著在脂肪形成早期發(fā)生的有絲分裂克隆擴(kuò)增(MCE)減少,以及MCE和細(xì)胞周期標(biāo)志物所需的基因表達(dá)降低；Yi等[22]研究得到，NR4A1的低表達(dá)可以降低2型糖尿病小鼠的體重、血脂和血糖，并且脂肪細(xì)胞的大小和脂滴的體積相應(yīng)減小。上述研究表明，過表達(dá)NR4A1可以抑制脂肪細(xì)胞分化，干擾其表達(dá)同樣會(huì)抑制脂肪細(xì)胞的分化，但其具體調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步探討。目前尚未見NR4A1對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞影響的研究報(bào)道。

基于上述的不同研究結(jié)果，本試驗(yàn)在克隆山羊NR4A1 cDNA序列的基礎(chǔ)上，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)NR4A1 基因在山羊不同組織和不同分化階段皮下脂肪細(xì)胞中的表達(dá)模式，并且探討過表達(dá)NR4A1對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步研究NR4A1基因在皮下脂肪細(xì)胞分化中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為最終闡明其調(diào)控山羊皮下脂肪沉積的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以1周歲健康的簡(jiǎn)州大耳羊(n=5)為試驗(yàn)動(dòng)物，早晨空腹24 h，屠宰后采集心、肝、脾、肺、腎、皮脂、腹脂、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭肌等組織。

1.2 試驗(yàn)試劑

Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司；KpnⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶購自Thermo公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit、Ⅰ型膠原酶購自Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山羊NR4A1克隆及生物信息學(xué)分析 根據(jù)GenBank中的山羊預(yù)測(cè)序列(XM_018047733.1)設(shè)計(jì)克隆引物(表1)。先用RT-PCR技術(shù)對(duì)NR4A1基因進(jìn)行克隆，PCR反應(yīng)體系：5倍稀釋的背最長(zhǎng)肌cDNA模板1 μL，12.5 μL的2×GC Rich-PCR，1 μL的正義鏈引物(10 μmol·μL-1)和1 μL的反義鏈引物(10 μmol·μL-1)，補(bǔ)充ddH2O至25 μL?？寺〕绦?98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，64 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用Gel Extraction Kit回收目的片段；構(gòu)建pClone007載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定并提取質(zhì)粒，然后測(cè)序。

表1 克隆引物Table 1 Primers for cloning

通過ProtParam在線分析編碼蛋白的理化性質(zhì)；通過NCBI網(wǎng)站的ORF Finder尋找開放閱讀框 (open reading frame,ORF)；采用STRING 預(yù)測(cè)NR4A1蛋白與其他蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)；使用Conserved Domains (CD)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.3.2 山羊NR4A1的組織表達(dá)分析 根據(jù)上述克隆得到的NR4A1 CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)qPCR引物，根據(jù)山羊不同內(nèi)參基因的篩選，選擇泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子(UXT)和肽酰脯氨基順反異構(gòu)酶(PPIB)為內(nèi)參基因[23]，qPCR的引物信息如表1所示。以上述采集的山羊組織樣進(jìn)行總RNA提取和cDNA的合成，以分析NR4A1基因在山羊不同組織的相對(duì)表達(dá)水平。通過qPCR技術(shù)檢測(cè)NR4A1基因在山羊不同組織的表達(dá)量，qPCR體系:SYBR?Premix Ex TaqTMII 10 μL，5倍稀釋的cDNA 1 μL，1 μL的正義鏈引物 (10 μmol·μL-1) 和1 μL的反義鏈引物(10 μmol·μL-1)，補(bǔ)充 ddH2O至20 μL。qPCR程序:95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共39個(gè)循環(huán)。

1.3.3 山羊NR4A1的細(xì)胞時(shí)序表達(dá)分析 在無菌條件下從7日齡的簡(jiǎn)州大耳羊中分離出山羊的皮下脂肪組織(n=1)。先將分離出的肌肉組織切碎，用PBS沖洗3次，然后加入2倍體積的Ⅱ型膠原酶，接下來通過補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)相同體積的DMEM / F12(Hyclone)終止消化，并分別通過400目篩。將懸浮液以2 000 r·min-1離心5 min，加入紅細(xì)胞(RBC)溶解液，然后以2 000 r·min-1離心5 min。皮下脂肪細(xì)胞的沉淀被DMEM/F12(Hyclone)和FBS重懸。將皮下前體脂肪細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，4 h后更換培養(yǎng)基，每2 d更換1次 培養(yǎng)基。當(dāng)傳至F3代的細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，添加油酸誘導(dǎo)液進(jìn)行分化，并分別收集第0、12、36、60和96 h的細(xì)胞。用qPCR方法分析NR4A1基因在山羊不同時(shí)間段皮下脂肪細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)體系同“1.3.2”。

1.3.4 過表達(dá)載體的構(gòu)建 利用上述克隆得到的NR4A1 CDS區(qū)設(shè)計(jì)亞克隆引物，NR4A1-S:CGGGGTACCATGCCCTGTATCCAAGCCC，NR4A1-A:ATAAGAATGCGGCCGCTCAGAAGGGCAG TGTGTCC。以上述提取的質(zhì)粒為模板，以上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將片段連接到19T載體后測(cè)序，質(zhì)粒提取純化后用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切，膠回收產(chǎn)物利用T4連接酶連接，之后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落并進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)鑒定正確的菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5NR4A1過表達(dá)效率以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢測(cè)(油紅O染色) 利用“1.3.3”的方法，細(xì)胞傳至F3代時(shí)，加入適量載體，空白試驗(yàn)組以空載體感染皮下前體脂肪細(xì)胞，試驗(yàn)組以pcDNA3.1-NR4A1感染皮下前體脂肪細(xì)胞，感染2 d后收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)染體系：100 μL opti，1.5 μL Lipofectamine 3000，500 ng pcDNA3.1-NR4A1。

通過形態(tài)學(xué)(油紅O染色)檢測(cè)轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體后山羊皮下脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)含量變化情況。將油紅O液加入蒸餾水配成油紅O染色液，皮下脂肪細(xì)胞用10%甲醛溶液固定30 min后移除甲醛溶液，并用200 μL油紅O染色液浸泡，染色后用PBS洗滌，于顯微鏡下觀察山羊皮下脂肪細(xì)胞的脂滴形態(tài)。最后用250 μL異丙醇提取細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)，并測(cè)量490 nm 處的吸光度。

1.3.6 過表達(dá)NR4A1對(duì)脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響 利用qPCR技術(shù)檢測(cè)過表達(dá)NR4A1對(duì)脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)量的影響。反應(yīng)體系參照“1.3.2”。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析 用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”的形式來表示數(shù)據(jù)，用2-ΔΔCt方法對(duì)qPCR定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[24]。通過 SPSS 15.0軟件進(jìn)行顯著性分析和多重比較，當(dāng)P<0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 山羊NR4A1基因的克隆

本試驗(yàn)成功克隆得到山羊NR4A1基因CDS區(qū)序列，長(zhǎng)度為1 797 bp(登錄號(hào)為MN19754 4)。經(jīng)過ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)，山羊NR4A1的ORF為1 797 bp，編碼598個(gè)氨基酸，不穩(wěn)定指數(shù)為60.06，親水性的平均值為-0.269，理論等電點(diǎn)是6.85，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)為58個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)為57個(gè)，通過CD在線軟件分析得到山羊NR4A1具有1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，1個(gè)DNA結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。山羊與綿羊的親緣關(guān)系最近，與原雞屬關(guān)系最遠(yuǎn)，基本符合生物進(jìn)化論(圖1A)；山羊的氨基酸序列與綿羊的氨基酸序列相似性最高，其次為人，相似性最低為原雞屬(圖1B)。

2.2 山羊NR4A1的組織表達(dá)模式

本試驗(yàn)檢測(cè)了NR4A1在山羊不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平。以UXT為內(nèi)參，心組織樣本為校準(zhǔn)樣本，得到NR4A1基因在組織中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)NR4A1在山羊肺組織中表達(dá)較高(P<0.01)，在山羊背最長(zhǎng)肌中表達(dá)最高(P<0.01)，在所有被檢測(cè)10種組織中均有表達(dá)(圖2)。

A.NR4A1的系統(tǒng)進(jìn)化樹；B．山羊NR4A1氨基酸序列與其他物種之間的相似性；C．山羊NR4A1相互作用蛋白的預(yù)測(cè)A.Phylogenetic tree of NR4A1;B.Similarity between goat NR4A1 amino acid sequence and other species;C.Prediction of goat NR4A1 interacting proteins圖1 山羊NR4A1基因的序列分析Fig.1 Sequence analysis of NR4A1 gene of goat

*.P<0.05，**.P<0.01，下同*.P<0.05,**.P<0.01,the same as below圖2 NR4A1基因在山羊組織中的相對(duì)表達(dá)Fig.2 Relative expression of NR4A1 gene in multiple tissues of goat

2.3 山羊NR4A1在皮下脂肪細(xì)胞中的時(shí)序表達(dá)

為了獲得NR4A1基因在山羊皮下脂肪細(xì)胞的表達(dá)模式，本試驗(yàn)還檢測(cè)了NR4A1在山羊不同時(shí)間段皮下脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量，NR4A1基因在皮下脂肪細(xì)胞分化0～60 h的表達(dá)量逐漸上升，在60 h達(dá)到最高(P<0.01)，60 h后開始下降(圖3)。

圖3 NR4A1在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression level of NR4A1 during goat subcutaneous adipocyte differentiation

2.4 過表達(dá)NR4A1對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞的影響

利用NR4A1過表達(dá)載體檢測(cè)其對(duì)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞的影響，qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NR4A1基因表達(dá)量上調(diào)了5 493倍(圖4A)。油紅O染色顯示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)NR4A1后明顯促進(jìn)山羊皮下脂肪細(xì)胞脂質(zhì)聚集(圖4C)，并且油紅O染色提取結(jié)果顯示，過表達(dá)后OD值極顯著升高(P<0.01，圖4B)。

2.5 過表達(dá)山羊NR4A1對(duì)脂肪細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步闡明山羊NR4A1對(duì)皮下脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，本研究檢測(cè)了過表達(dá)NR4A1對(duì)脂肪細(xì)胞相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)山羊NR4A1后C/EBPα、C/EBPβ、LPL、PPARγ、SREBP1、AP2在山羊皮下脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量顯著上升(P<0.05，圖5)。

A.皮下脂肪細(xì)胞分化48 h過表達(dá)NR4A1后，通過qPCR檢測(cè)NR4A1的相對(duì)表達(dá)水平；B．皮下脂肪細(xì)胞分化期間油紅O染色，在492 nm處檢測(cè)的OD值；C．皮下脂肪細(xì)胞分化期間對(duì)照組(上)和試驗(yàn)組(下)細(xì)胞的油紅O染色圖片(200×)A.Relative mRNA expression of NR4A1 was detected by qPCR after overexpressing NR4A1 for 48 h of subcutaneous adipocyte differentiation;B.The OD value was detected at 492 nm after Oil red O staining during subcutaneous adipocyte differentiation;C.Representative photographs of Oil red O staining of the cells in NC (up) and test groups (down) during subcutaneous adipocyte differentiation (200×)圖4 NR4A1過表達(dá)對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞的影響Fig.4 Effects of NR4A1 overexpression on subcutaneous adipocytes of goat

圖5 過表達(dá)NR4A1對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of overexpressing NR4A1 on the expression of related genes in goat subcutaneous adipocytes

3 討 論

3.1 山羊NR4A1的克隆及組織表達(dá)

本研究成功克隆了山羊NR4A1基因CDS區(qū)序列，通過STRING軟件分析發(fā)現(xiàn),FOS、AKT2蛋白與NR4A1互作，Kokoroishi等[25]研究報(bào)道，F(xiàn)OS可以促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)脂肪分化；Pang等[26]研究表明，AKT2可以抑制脂肪的生成，由此推測(cè)，NR4A1基因可能與脂肪和脂肪酸代謝調(diào)控密切相關(guān)。為了得到NR4A1在山羊的組織特異性，因此本試驗(yàn)研究了NR4A1在山羊的組織表達(dá)模式，結(jié)果得到，NR4A1在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)水平最高，在肺組織中表達(dá)次之，在所有被檢測(cè)的山羊10種組織中均有表達(dá)。結(jié)果與其他學(xué)者在其他物種中的報(bào)道存在相似或不同之處，Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1在豬的肝、胃和肌肉等組織中的相對(duì)表達(dá)水平很低；Nakai等[28]研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1在人類胎兒肌肉和成人肝、大腦和甲狀腺中廣泛表達(dá)?；谏鲜鰣?bào)道結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室結(jié)果推測(cè)，NR4A1基因組織表達(dá)具有物種和組織特異性。

3.2 NR4A1基因?qū)ι窖蚱は轮炯?xì)胞分化的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1在山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化中呈先上升后下降的趨勢(shì)，且過表達(dá)NR4A1促進(jìn)山羊皮下脂肪細(xì)胞的分化，推測(cè)NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪細(xì)胞分化的正調(diào)控因子。與本試驗(yàn)結(jié)果一致的是，F(xiàn)umoto等[29]發(fā)現(xiàn)，NR4A1在 3T3-L1細(xì)胞中瞬時(shí)過表達(dá)會(huì)促進(jìn)脂質(zhì)的積累。但是，Veum 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1在人原代前體脂肪細(xì)胞分化期間下調(diào)，而本研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1在山羊脂肪細(xì)胞前期分化上調(diào)，而在60 h后才出現(xiàn)下調(diào)的現(xiàn)象；并且，Qin等[31]研究表明，過表達(dá)NR4A1通過增強(qiáng)GATA結(jié)合蛋白2(GATA2)和p53的表達(dá)抑制小鼠脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)積累；Chao等[32]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NR4A1可以抑制3T3-F442A前體脂肪細(xì)胞的分化。上述這些報(bào)道與本研究的結(jié)果存在不同之處，由此推測(cè)，NR4A1基因在不同物種的脂肪細(xì)胞調(diào)控過程中可能存在物種特異性。

3.3 NR4A1調(diào)控山羊皮下脂肪細(xì)胞分化的可能作用機(jī)制

本研究進(jìn)一步檢測(cè)了過表達(dá)NR4A1對(duì)山羊脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，過表達(dá)NR4A1后脂肪分化標(biāo)志基因的相對(duì)表達(dá)量上升。能量代謝的主要步驟是富含三酰基甘油的脂蛋白(TRL)水解，釋放可使用或存儲(chǔ)的脂肪酸，這是通過在血管內(nèi)皮的“結(jié)合脂解部位” LPL實(shí)現(xiàn)的[33]；PPARγ是脂肪形成的主要誘導(dǎo)劑，C/EBPβ是誘導(dǎo)脂肪生成的早期轉(zhuǎn)錄因子，它通過調(diào)節(jié)其鄰近啟動(dòng)子元件的轉(zhuǎn)錄來激活PPARγ，而PPARγ是脂肪細(xì)胞分化的正調(diào)節(jié)劑[34]，在之前的一些報(bào)道中，C/EBPα均以被證明為脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因，此外，它還可以調(diào)節(jié)AP2的表達(dá)，并且可以促進(jìn)脂滴的聚集；同時(shí)，C/EBPα可以和C/EBPβ、PPARγ相結(jié)合，調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶(FAS)的表達(dá)[35-37]。推測(cè),過表達(dá)NR4A1可能主要通過上調(diào)C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和AP2的表達(dá)水平來促進(jìn)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化，并且,趙莉鴿[38]的研究表明，NR4A1的過表達(dá)可減少神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白代謝的產(chǎn)物含量，提高β分泌酶的含量，導(dǎo)致APP水解釋放能量，進(jìn)一步調(diào)控生物進(jìn)程，同時(shí)也有研究表明，NR4A1可以調(diào)節(jié)線粒體功能[39-41]，而線粒體又是產(chǎn)生能量和ATP合成的主要場(chǎng)所，因此推測(cè)，NR4A1的過表達(dá)也有可能通過調(diào)節(jié)ATP生化反應(yīng)來進(jìn)一步調(diào)節(jié)脂肪和脂肪酸的代謝，還需要通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)進(jìn)一步揭示NR4A1在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化中的深層機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到包含ORF的山羊NR4A1基因cDNA序列，在山羊各個(gè)組織廣泛表達(dá)，其中在背最長(zhǎng)肌中相對(duì)表達(dá)量最高；NR4A1在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化60 h的表達(dá)量最高；過表達(dá)NR4A1后可能通過上調(diào)C/EBPα、C/EBPβ、LPL、PPARγ、SREBP1和AP2的表達(dá)來促進(jìn)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化，研究結(jié)果可為進(jìn)一步闡明NR4A1基因調(diào)控山羊不同部位脂肪沉積的分子機(jī)理提供重要的理論依據(jù)。