非洲豬瘟血清學診斷靶點的研究進展

楊文兵，鄒亞文，蔣一凡，余婉婷，楊 毅，鄔 靜*，王乃東*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128；2.獸用蛋白質(zhì)工程疫苗湖南省重點實驗室，長沙 410128；3.獸用疫苗逆向創(chuàng)制湖南省工程研究中心，長沙 410128)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒，該病毒外殼呈二十面體對稱(260～300 nm)，有囊膜，且擁有較大的基因組(170～194 kb)[1-2]。ASFV具有復雜的逃逸宿主免疫機制[3]，可引起急性、熱性、出血性和高致死性的傳染病，即非洲豬瘟(ASF)[4]。1921年，首次報道了肯尼亞ASF疫情[5]，此后該疫病蔓延，相繼在葡萄牙、意大利、法國和俄羅斯等地出現(xiàn)[6-8]。2018年8月，中國沈陽確診首例ASF，對該地ASFV進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，該病毒株屬于p72基因Ⅱ型和CD2v血清群8，被命名為ASFV SY18株(亦稱China 2018/1)[9-10]，隨后ASF在我國內(nèi)陸所有省份出現(xiàn)，至今已給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[11-12]。

消除ASF疫情需要長期戰(zhàn)略。目前尚無商品化疫苗[13-14]，所以積極、長期監(jiān)測豬群中ASFV感染的相關(guān)情況，能為發(fā)現(xiàn)病例并采取及時的應對措施提供有效依據(jù)[15-16]。目前檢測豬體內(nèi)ASFV病原基因或其抗原(體)是判斷豬群是否感染的重要手段，而血清學檢測可用于豬群ASF監(jiān)測篩查和輔助診斷[11]。豬感染 ASFV后，特別是亞急性感染，存活個體作為病毒攜帶者，可在感染后保持可檢測的抗體水平，此時基于抗原檢測抗體是了解發(fā)病特定區(qū)域內(nèi)的豬群ASF發(fā)病情況所不可或缺的，因此監(jiān)控ASFV特異性抗體在確定感染狀態(tài)方面很重要[16]。而如果ASFV弱毒疫苗或不同組分亞單位疫苗在臨床上實現(xiàn)應用，ASFV抗體檢測方法作用亦尤為重要，比如野毒感染和疫苗免疫的鑒別診斷、疫苗效果評估等。

ASFV重要蛋白的保守性及其抗原性具有實驗室診斷學意義。ASF血清學檢測研究已經(jīng)采用了p30、p54和p72等多個保守蛋白，其中p30蛋白含量豐富，為早期病毒蛋白(CP204L基因編碼)[17]，可在感染細胞后2～4 h內(nèi)觀察到，并在整個感染周期中持續(xù)表達，當檢測到細胞表達p30蛋白時，表明病毒已經(jīng)進入細胞和脫殼，并且早期病毒基因表達已經(jīng)開始[18-19]；p30蛋白是ASFV感染過程中引起體液免疫應答重要的抗原蛋白，針對p30的抗體可阻止病毒內(nèi)吞，能夠在病毒與細胞吸附之前或之后中和病毒，是重要的病毒早期診斷靶點[20-21]。p54也為早期病毒蛋白(E183L基因編碼)，蛋白分子中含有一段跨膜區(qū)域，對病毒蛋白經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成病毒包膜前體起重要作用[22]，而p54在Vero細胞的瞬時表達，可導致效應因子caspase-3的激活和細胞凋亡[18,23]；用重組 p54 蛋白免疫豬可誘導產(chǎn)生中和抗體，針對p54的抗體可在病毒與細胞吸附之前中和病毒，p54蛋白抗原性良好，其抗體可在豬感染ASFV 8 d 后出現(xiàn)，并可持續(xù)數(shù)周，是高敏感性和特異性ELISA 等抗體檢測方法的重要候選蛋白[20,24]。p72是在病毒感染后期表達的主要結(jié)構(gòu)蛋白(B646L基因編碼)，是ASFV二十面體衣殼的主要成分，p72分子可形成穩(wěn)定的三聚體，呈典型雙“果凍卷”結(jié)構(gòu)[25]。p72是ASFV高免疫原性蛋白之一，亦是ELISA等血清學診斷的重要靶點，p72抗體也可阻止ASFV吸附到巨噬細胞，但不能在抗體介導的免疫保護中起決定性作用[18,26]；CD2v在病毒感染后期表達(EP402R基因編碼)，是CD2的同系物，可引起病毒毒力增強、紅細胞吸附現(xiàn)象[27]。CD2v和C型凝集素蛋白介導ASFV的血凝抑制(hemagglutination inhibition，HAI)血清學特異性，CD2v和C型凝集素特征序列為ASFV血清型分組提供了一種簡單方法[18,28]。先前研究認為CD2v免疫原性較弱[29-30]，但近期研究發(fā)現(xiàn)CD2v蛋白或其多克隆抗體均表現(xiàn)出良好的免疫反應性[30-32]，這提示CD2v蛋白可能是潛在的血清學診斷靶點。而ASFV CD2v(EP402R)基因的缺失苗對親本(BA71)與異源毒株(Ⅰ、Ⅱ型毒株)均具有一定的保護作用[33-34]。

1 ASF血清學診斷靶點的應用

1.1 抗體檢測方法

自ASFV發(fā)現(xiàn)以來，陸續(xù)有利用p72、p54和p30等候選蛋白研發(fā)不同形式的ASFV抗體血清學檢測方法。目前已經(jīng)有世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)介紹的INgezim PPA COMPAC ELISA[35]、俄羅斯商用試劑盒“VNIIVViM ASF-ELISA Ab/Ag”[36]、法國ID-VET間接ELISA試劑盒、瑞典SVANOVIR抗體ELISA試劑盒、西班牙INGENASA抗體ELISA試劑盒[37-38](表1)。而利用ASFV蛋白建立準確、靈敏和方便的ELISA應用于抗體檢測仍是研究熱點之一，其中p72或p30為包被抗原檢測ASFV IgG抗體的ELISA可應用于血清或糞便抗體篩查，兩種ELISA最早可在感染ASFV減毒株(Ken05)第9天 的糞便樣本中檢測到抗體，糞便抗體檢測結(jié)果可比血清樣本推遲達2.67 d[39]；基于重組蛋白p30 的ASFV IgG抗體ELISA可用于血清或唾液樣本中抗體檢測，而且該p30間接ELISA可以在低毒力ASFV分離株(NHV/P68)感染的第8天時檢出唾液中的ASFV抗體，計算26 dpi(day post inoculation)內(nèi)的S/P值，將血清與口腔液結(jié)果進行比較，除12和18 dpi外，其余各天反應均無顯著差異(P≤0.01)[40]。張蕾等[41]根據(jù)ASFV的p30、p54和p72蛋白設計3條合成肽，并建立了抗體ELISA檢測方法，與西班牙INGENASA抗體ELISA試劑盒結(jié)果符合率達92.9%。

除了間接ELISA檢測方法外，側(cè)向流免疫色譜分析、量子點檢測試紙條、免疫印跡和免疫磁珠法等也被陸續(xù)研發(fā)，并應用于ASFV抗體檢測(表1)。其中，INgezimPPA CROM lateral flow device (INGENASA)以p72蛋白為捕獲抗原，可檢測血拭子樣本中ASFV抗體[42]；將量子點與免疫層析技術(shù)結(jié)合起來的ASFV抗體量子點檢測試紙條使檢測方法簡便、穩(wěn)定和靈敏，利用該試紙條可對320倍稀釋的ASFV陽性血清進行檢測[43]；而以重組p30蛋白為捕獲抗原建立的免疫印跡方法，可對ASFV強毒株(Stavropol 01/08、К-49)、弱毒株(КК-262/C)等不同毒力、不同血清型感染6～8 d后的血清和免疫系統(tǒng)器官樣本進行有效的抗體檢測[44]。以ASFV p72和p30等為捕獲抗原的免疫磁珠法，在Benin病毒株感染豬8～15 d后采集的血清中，檢測的ASFV抗體陽性率(68%)高于INgezim 11.PPA.K3 ELISA方法(58%)[45]。

表1 ASFV血清學抗體檢測技術(shù)Table 1 Serological antibody detection technology for ASFV

對接種ASFV/NH/P68病毒株后的豬血清進行熒光微球免疫試驗(fluorescent microsphere immunoassay，F(xiàn)MIA)，發(fā)現(xiàn)ASFV重組蛋白p30與免疫血清中l(wèi)gG的反應性明顯高于p72與p54[40]；而Murgia等[46]構(gòu)建了表達ASFV p30、p54和p72蛋白的α病毒復制子顆粒(replicon particles，RPs)，并接種Vero細胞和試驗豬，發(fā)現(xiàn)p30在Vero細胞中表達量最高，免疫原性最強，這些工作提示p30是建立間接ELISA的最佳候選蛋白之一。

目前，國內(nèi)外獲批商品化試劑盒未將CD2v蛋白作為診斷靶標。但鐘秋萍等[31]利用ASFV SY18病毒株CD2v 胞外區(qū)(24～206 aa)與鐵蛋白融合，大腸桿菌BL21表達系統(tǒng)表達并免疫 BALB/c 小鼠制備了多克隆抗體，經(jīng)間接免疫熒光試驗(indiect immunofluorescence assay，IFA)驗證該抗體具有特異性。于浩洋等[32]利用真核表達系統(tǒng)表達了CD2v胞外區(qū)(1～206 aa)的蛋白，在間接ELISA的初步試驗中發(fā)現(xiàn)，該蛋白片段對豬陽性血清具有良好的免疫反應性(98.9%特異性、100%敏感性)。周曉慧等[30]利用ASFV SY18病毒株CD2v胞內(nèi)區(qū)(231—333 aa)進行表達研究，使用重組CD2v抗原進行ELISA試驗，檢測已知的30份豬ASFV陽性和陰性血清，結(jié)果均符合。這些結(jié)果表明，CD2v蛋白中存在抗原表位，其重組抗原有應用于抗體檢測方法的潛力。

pp62蛋白雖作為法國ID-VET商業(yè)化試劑盒選用的診斷靶點，但將其應用于血清學診斷方法的研究報道不多。Gallardo等[47]在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達了p30、p54和pp62蛋白，并初步應用于ELISA血清學診斷方法，結(jié)果表明，pp62的抗體檢測特異性(99%)高于p30與p54(97%)，而且pp62蛋白可對保存質(zhì)量不佳(如熱處理后)的豬血清進行ASFV抗體檢測，提示pp62可能與ASFV抗體結(jié)合更加穩(wěn)定，或與ASFV抗體親和力高于其他蛋白[47]。

1.2 抗原檢測方法

近期基于p72抗體的ASFV抗原檢測方法陸續(xù)被研發(fā)、報道，包括夾心ELISA、側(cè)向流免疫色譜分析(lateral flow assay，LFA)和膠體金免疫層析法等(表2)。其中，使用抗ASFV Uganda分離株p72的IgG抗體建立了夾心ELISA方法，但應用中發(fā)現(xiàn)抗原濃度較低的樣品(慢性ASFV感染)可能會出現(xiàn)假陰性，其結(jié)果敏感度較低[48]；以抗p72蛋白的單克隆抗體(18BG3)為捕獲抗體建立了一種用于抗原檢測的側(cè)向流動分析法，其敏感性為RT-PCR的67.86%，超過50%的LFA檢測為陰性的血清樣本在RT-PCR結(jié)果中為陽性(CT值30)，而這些血清樣本來自感染ASFV 2周后的豬，說明該LFA檢測方法敏感性較低[49]；膠體金免疫層析法將膠體金與免疫層析技術(shù)結(jié)合，以p72蛋白制備的單抗為捕獲抗體，可識別15 ng的抗原量(原核表達載體pET-30A表達的ASFV p72蛋白)[50]。Szeredi等[51]使用商品化小鼠單克隆抗體(1BC11)，建立了免疫細胞化學(immunocytochemical，IC)和免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)方法，并用于檢測ASFV p72蛋白，雖然不適用于大規(guī)模檢測，但可作為急性ASF的實驗室輔助診斷。

表2 ASFV血清學抗原檢測技術(shù)Table 2 Serological antigen detection techniques for ASFV

2 ASF血清學診斷靶點的抗原表位

最近，陸續(xù)報道了利用單抗對ASF血清學診斷靶點p30、p54和p72的表位進行鑒定，獲得了豐富的表位信息，對ASFV血清學診斷靶點的抗原表位進行解析，將為ASF血清學診斷和疫苗的研究提供新的靶點。

2.1 p30蛋白

用大腸桿菌表達系統(tǒng)(pHUE載體)表達了ASFV BA71V病毒株p30全長蛋白(204 aa)，利用該蛋白制備、篩選獲得3株陽性單克隆抗體(47-3、62-35和142-4)，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)(pHUE載體)以及哺乳動物細胞(pEGFP-C3載體)表達p30多肽，并對單抗識別p30蛋白區(qū)域進行鑒定，發(fā)現(xiàn)單抗識別p30片段的表位序列(mAb47-3識別61—93 aa；mAb62-35 和mAb142-4識別120—204 aa)，其中mAb47-3單抗識別的表位在至少10種ASFV基因型中保守，提示該單抗至少可以檢測10種基因型毒株[52]。

Wu等[53]使用Sf9昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)(pFastBac載體)表達了ASFV Georgia 2007/1病毒株p30基因片段(70—564 nt)，利用該片段制備篩選獲得14株陽性單克隆抗體。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)(pHUE載體)表達ASFV BA71V病毒株p30多肽和購置的ASFV Georgia 2007/1病毒株的p30寡肽(GenScript公司)，對單抗識別p30蛋白的區(qū)域進行鑒定，發(fā)現(xiàn)5個p30的單抗識別的表位序列(mAb8H2-6識別61—84 aa；mAb3E10-9識別84—90 aa；mAb63、mAb181和mAb192識別96—105 aa；mAb2B9-1、mAb4B6-1、mAb214、mAb330、mAb355和mAb428識別116—125 aa；mAb8G12-1、mAb81和mAb362識別146—160 aa)，其中p30蛋白的116—125 aa與146—160 aa區(qū)域和抗體反應的陽性信號明顯高于其他區(qū)域，且更具有免疫優(yōu)勢。通過對NCBI基因庫中86個p30蛋白序列進行比較，發(fā)現(xiàn)116—125 aa與146—160 aa區(qū)域高度保守。Murgia等[46]也同樣發(fā)現(xiàn)了p30的C-末端(111—130 aa)為免疫優(yōu)勢區(qū)域，Vlad等[54]使用GeneSilico MetaDisorder server預測BA71V病毒株p30蛋白，發(fā)現(xiàn)固有無序(intrinsically disordered proteins，IDP)的區(qū)域(91—143 aa)，表明它可能是不穩(wěn)定的，但IDP在ASFV p30蛋白功能中的意義仍需要進一步揭示[52-54]。

2.2 p54蛋白

使用Sf9和Hi-Five昆蟲細胞桿狀病毒系統(tǒng)(pFastBac載體)表達ASFV Georgia 2007/1病毒株p54蛋白片段(60—178 aa)，利用該片段制備和篩選出5株單克隆抗體(154-1、143-1、7、117和101)，之后用單克隆抗體對大腸桿菌表達系統(tǒng)(pHUE載體)表達ASFV BA71V病毒株p54多肽和購置的ASFV Georgia 2007/1病毒株p54寡肽(21stCentury Biochemicals公司)對單抗的識別表位區(qū)域進行鑒定，發(fā)現(xiàn)4個p54的單抗識別的表位序列(mAb154-1識別65—75 aa；mAb143-1識別93—107 aa；mAb7識別97—113 aa；mAb117和mAb101識別118—127 aa)[46-47]。用BA71V病毒株p54多肽和寡肽分別與一批感染ASFV OURT 88/3弱毒株第17 天的豬血清進行抗體結(jié)合鑒定，發(fā)現(xiàn)113—127 aa區(qū)域可與62.5%的ASFV感染豬血清抗體反應，且明顯高于其他表位區(qū)域，但遺憾的是，通過對26株不同ASFV病毒株的p54蛋白序列對比發(fā)現(xiàn)p54(117—126 aa)區(qū)域具有高度的差異性[55]。

2.3 p72蛋白

Heimerman等[56]使用Sf9和Hi-Five昆蟲細胞桿狀病毒系統(tǒng)(pFastBac載體)表達了ASFV Georgia 2007/1病毒株p72蛋白片段(20—303 aa)，利用該片段制備并篩選獲得6株陽性單抗(23、4A4、85、65-3、6H9-1和8F7-3)。隨后利用大腸桿菌表達系統(tǒng)(pHUE載體)表達ASFV BA71V病毒株p72重疊多肽與寡肽對上述單抗識別區(qū)域進行鑒定，發(fā)現(xiàn)4個單抗分別結(jié)合p72的不同抗原表位(mAb 85識別156—165 aa；mAbs 65-3 和 6H9-識別265—280 aa；mAbs 8F7-3 和 23識別 280—294 aa；mAb 4A4識別290—303 aa)。其中，mAb85、mAb8F7-3和mAb23識別的p72基因中的表位在10種基因型的ASFV毒株中相對保守，這些抗體有助于開發(fā)抗原捕獲或阻斷ELISA。但部分ASFV毒株的p72基因不保守，特別是在C末端，所以選擇p72抗原區(qū)域或表位研發(fā)血清學診斷方法時需謹慎考慮C末端的使用[53,57]。

3 展 望

ASFV含有151～167個開放閱讀框，可編碼160多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[55,58-60]，ASFV編碼蛋白具有復雜性，為ASF感染血清學診斷的新方法研制帶來了挑戰(zhàn)，也帶來了機會?；谀壳暗腁SFV抗體檢測方法進展發(fā)現(xiàn)，近年來用于ASFV抗體檢測的ELISA大多以p30與p72蛋白為基礎。p30與p72 聯(lián)合應用于免疫磁珠法可提高檢測技術(shù)敏感性[45]，使用p30、pp62和p72為包被抗原的法國ID-VET試劑盒也已商品化[37，61]，提示多種蛋白的聯(lián)合應用可提高檢測方法性能，這為開發(fā)檢測ASFV抗體和抗原的新方法提供了機會。

病毒蛋白表位及其特性鑒定不僅有助于更好地了解病毒的病理學和宿主免疫反應，而且基于保守表位的血清學檢測方法有望提供更廣泛的診斷范圍。近年來，基于多抗原表位的血清學診斷方法已應用于檢測登革熱病毒、丙型肝炎病毒和甲型肝炎病毒等的抗體，并且方法具有高敏感性和特異性[62-64]。如甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)感染可刺激機體產(chǎn)生針對病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。然而，接種滅活或減毒的HAV疫苗只產(chǎn)生針對結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，而不會產(chǎn)生或產(chǎn)生非常少的針對非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。Su等[64]構(gòu)建了以HAV非結(jié)構(gòu)蛋白多表位診斷抗原為基礎的雙抗原夾心ELISA(double-antigen sandwich ELISA)來區(qū)分這種情況，診斷準確性和實用性均較好(靈敏度93.75%，特異性93.75%)。重組蛋白或表位多肽在血清學診斷方面可能比天然抗原更具有優(yōu)勢[65-66]。多表位重組蛋白由免疫優(yōu)勢表位區(qū)域組成，沒有非特異性部分，這可能提高檢測方法的質(zhì)量[66-68]。而基于近期陸續(xù)獲得的ASFV候選蛋白的單抗和已定義的p30和p54等保守抗原表位或區(qū)域，借助生物信息學分析技術(shù)，篩選設計表位或多表位組合，有望為改進ASFV檢測、監(jiān)測和疾病控制提供有價值的新靶點或新組合，并推動ASF血清學診斷的潛在應用。而深入了解ASFV保護性抗原、相關(guān)表位及其在自然界中的多樣性，也將有助于ASFV亞單位疫苗的設計和開發(fā)。