環(huán)狀RNA circTMBIM 1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)和功能研究①

陸瀅雪 羅新華 程明亮 彭 虹 （貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，貴陽(yáng)550004）

近年來(lái)，環(huán)狀RNA（circRNA）的功能備受關(guān)注，如調(diào)節(jié)親本基因表達(dá)、發(fā)揮miRNA海綿體等作用［1-3］。研究表明，circRNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［4-5］。原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的常見(jiàn)原因，預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高，其發(fā)病機(jī)制受到高度關(guān)注［6-7］。最新研究表明，大量circRNA在HCC組織和正常肝組織中存在差異表達(dá)，與HCC發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制尚未明確［8-10］。本文就circRNA在HCC中的異常表達(dá)進(jìn)行分析，探討其在HCC中的作用和潛在機(jī)制。高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，circTMBIM1在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，因此，課題組對(duì)Hsa-circTMBIM1在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR定量分析，并設(shè)計(jì)合成靶向Hsa-circTMBIM1的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞，研究Hsa-circTMBIM1與Huh7細(xì)胞增殖和遷移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人HCC細(xì)胞株HepG2、Hep3B、Huh7、Sk-hep-1、HCCLM3、SMMC-7721購(gòu)自上海生命科學(xué)院所；慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株由南京科佰生物科技有限公司提供；引物由北京擎科生物有限公司合成；靶向circTMBIM1的siRNA序列委托廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)合成；

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；青-鏈霉素（武漢苑陵生物科技有限公司）；miR-24-3p模擬物（上海吉瑪生物有限公司）；miR-24-3p抑制劑和陰性對(duì)照（上海生工生物公司）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）；結(jié)晶紫染色液（碧云天公司）；碘化丙啶、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（美國(guó)Sigma公司）；Transwell小室（美國(guó)Coster公司）；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；Muse智能觸控細(xì)胞分析儀（美國(guó)默克密理博公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)（Promega，Madison，WI，USA）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HCC細(xì)胞系HepG2、Hep3B、Huh7、Sk-hep-1、HCCLM3和SMMC-7721均采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10%胎牛血清（FBS）+100 U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素，37℃、5%CO2、95%相對(duì)濕度下培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染circTMBIM1-siRNA，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR 采用Trizol試劑從新鮮冷凍組織和培養(yǎng)細(xì)胞中分離總RNA，反應(yīng)體系10μl，反應(yīng)條件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min，12℃ 循環(huán)，合成cDNA。擴(kuò)增體系20μl，反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃5 s，60℃60 s，共40個(gè)循環(huán)。circTMBM1引物序列為：F：5′-GGCTATGATGGGGAGGAGAGAGC-3′，R：5′-GGCGCTGGGGTTGGACATGG-3′；miR-24-3p引物序列為：5′-TGCGGTGGCTCAGTTCAGCAG‐GAAC-3′；GAPDH引物序列為：F：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，R：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。比較circTMBIM1在HCC細(xì)胞中的表達(dá)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 細(xì)胞增殖及活性檢測(cè) 100μ/l孔向96孔反應(yīng)板中注入細(xì)胞懸浮液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10μ/l孔添加CCK-8溶液進(jìn)行孵育，酶標(biāo)儀測(cè)定樣品450 nm處吸光度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，4×103～1×105個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)階段，采用細(xì)胞培養(yǎng)基按1 000：1比例稀釋EdU溶液（試劑A），制備50μmo/lL EdU培養(yǎng)基，固定細(xì)胞后用Apollo試劑染色，拍照并分析圖像。向6孔板中注入100個(gè)細(xì)胞，接種于培養(yǎng)液中并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，固定細(xì)胞，加入適量結(jié)晶紫染色，流動(dòng)水沖洗，空氣干燥后拍照。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3.2 細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn) 將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)24 h至70%～80%融合度，200μl移液槍垂直劃痕，沖洗脫落細(xì)胞，添加新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，PBS清洗2次，固定細(xì)胞并測(cè)距。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/ml，吸取100μl無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基加入Transwell上室，37℃培養(yǎng)48 h，按照操作規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，顯微鏡明亮視野下觀察陽(yáng)性細(xì)胞，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3.4 流式細(xì)胞周期檢測(cè) 轉(zhuǎn)染24 h后棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，加入1 ml不含EDTA的胰酶，待細(xì)胞成片脫落后，加入2 ml培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管，1 000/rmin離心5 min，棄上清，PBS洗滌并離心3次，預(yù)冷70%乙醇固定，4℃孵育過(guò)夜，PBS離心洗滌細(xì)胞3次，去固定液，加入緩沖液，加入0.5μg/ml PI染色液染色30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，F(xiàn)lowJo7.6軟件分析各期細(xì)胞含量。

1.2.4 慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將過(guò)表達(dá)circTMBIM1的細(xì)胞（circTMBIM1 OE）、circTM‐BIM1-敲除細(xì)胞（sh-circTMBIM1）和陰性對(duì)照細(xì)胞（NC）進(jìn)行慢病毒包裝，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。Huh7細(xì)胞接種于6孔板，第2天采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) TargetScan和miRanda預(yù)測(cè)circRNA-miRNA的相互作用，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)circTMBIM1與底物miR-24-3p相結(jié)合，構(gòu)建psiCHECK-circTMBIM1-WT/-Mut質(zhì)粒，采用Li‐pofectamine 3000將psiCHECK-circTMBIM1-WT或psiCHECK-circTMBIM1-Mut和miR-519a-5p模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定轉(zhuǎn)染48 h后的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism7軟件繪圖，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circTMBIM1在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)及敲減效率 circTMBIM1在Huh7細(xì)胞系中表達(dá)最高，其次分別為HepG2，Hep3B，Sk-hep-1，HCCLM3，SMMC-7721（圖1A），選用Huh7細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。qRTPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，siRNA干擾后，circTMBIM1表達(dá)顯著降低（P＜0.001，圖1B）。

2.2 下調(diào)circTMBIM1對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，下調(diào)circTMBIM1表達(dá)明顯降低Huh7細(xì)胞增殖活力（P＜0.01，圖2A）。集落形成實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，將circTMBIM1 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞2周后，與對(duì)照組相比，Huh7細(xì)胞集落數(shù)明顯減少（圖2B）。進(jìn)一步采用EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默circTMBIM1后Huh7增殖活力的變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，沉默circTM‐BIM1可降低Huh7細(xì)胞增殖活力（圖2C）。

圖1 circTMBIM 1在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)及敲減效率Fig.1 Expression and knock down efficiency of circTM?BIM 1 in HCC cell lines

圖2 下調(diào)circTMBIM 1對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of down-regulation of circTMBIM 1 on pro?liferation of Huh7 cell

2.3 下調(diào)circTMBIM1表達(dá)對(duì)Huh7細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕48 h后，與對(duì)照組相比，下調(diào)circTMBIM1表達(dá)顯著抑制細(xì)胞創(chuàng)傷愈合（圖3A）。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，下調(diào)circTMBIM1表達(dá)后Huh7細(xì)胞遷移能力減弱（圖3B）。

2.4 下調(diào)circTMBIM1表達(dá)對(duì)Huh7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下調(diào)circTMBIM1表達(dá)對(duì)Huh7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低circTMBIM1表達(dá)，Huh7細(xì)胞S期占比顯著降低（P＜0.05，圖4）。

2.5 雙熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TMBIM1與miR-24-3p結(jié)合 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢分析，預(yù)測(cè)TMBIM1與miR-24-3p存在結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。共轉(zhuǎn)染circTM‐BIM1-WT和miR-24-3p模擬物后熒光素酶相對(duì)活性降低，miR-24-3p表達(dá)顯著降低。轉(zhuǎn)染circTMBIM1 OE后，miR-24-3p表達(dá)下降，轉(zhuǎn)染sh-circTMBIM1后miRNA表達(dá)升高（P＜0.01，P＜0.001，圖5B）。提示circTMBIM1可能直接與miR-24-3p結(jié)合而抑制miR-24-3P活性。

圖3 下調(diào)circTMBIM 1表達(dá)對(duì)Huh7細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Effect of down-regulation of circTMBIM 1 on mi?gration of Huh7 cell

圖4 下調(diào)circTMBIM 1表達(dá)對(duì)Huh7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of down-regulation of circTMBIM 1 on cell cycle of Huh7 cell

圖5 雙熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TMBIM 1與miR-24-3p結(jié)合Fig.5 Double luciferase activity test confirmed combina?tion of TMBIM 1 and miR-24-3p

圖6 過(guò)表達(dá)circTMBIM 1可逆轉(zhuǎn)miR-24-3p mimics對(duì)Huh7細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期的影響Fig.6 Overexpression of circTMBIM 1 can reverse effects of miR-24-3p mimics on proliferation，migration and cell cycle of Huh7 cells

2.6 過(guò)表達(dá)circ TMBIM1可逆轉(zhuǎn)miR-24-3p mimics對(duì)Huh7細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期的影響 采用CCK-8法測(cè)定共轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimics和circTM‐BIM1 OE后Huh7細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，miR-24-3p mimics可抑制Huh7細(xì)胞增殖，而過(guò)表達(dá)circTM‐BIM1可逆轉(zhuǎn)miR-24-3p mimics對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的抑制作用（圖6A），集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同（圖6B）。細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)共轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimics和circTMBIM1 OE后Huh7細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，miR-24-3p mimics可抑制Huh7細(xì)胞遷移，而過(guò)表達(dá)circTMBIM1可逆轉(zhuǎn)miR-24-3p mimics對(duì)Huh7細(xì)胞遷移的抑制作用（圖6C、D）。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，下調(diào)circTMBIM1表達(dá)細(xì)胞S期占比降低，共轉(zhuǎn)染circTMBIM1 OE結(jié)論相反（圖6E）。

3 討論

HCC是一種死亡率較高的惡性腫瘤，預(yù)后差、惡性程度高、復(fù)發(fā)率高，對(duì)多種化療藥物耐藥，若發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移控制較難［11-12］。進(jìn)一步篩選潛在診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，深入研究可能的分子機(jī)制對(duì)HCC治療至關(guān)重要。近年非編碼RNA（ncRNA）已成為HCC研究重點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明，腫瘤特異性ncRNA可用于生存預(yù)測(cè)和治療干預(yù)［13-15］。HCC相關(guān)ncRNA中，circRNA在HCC發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［16］。circRNA/miRNA軸在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)［17］。研究表明，circRNA可與多種miRNA結(jié)合起miRNA“海綿體”作用，影響其他基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)控腫瘤惡性進(jìn)展，如circ‐MTO1和cSMARCA5已被認(rèn)為是致癌miRNA海綿，在HCC進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能成為HCC治療的潛在靶點(diǎn)［18-20］。

本研究發(fā)現(xiàn)circTMBIM1在HCC細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，敲低circTMBIM1可使HCC細(xì)胞增殖及遷移能力減弱。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示circTM‐BIM1與miR-24-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力。circTMBIM1/miR-24-3p信號(hào)軸的潛在下游基因主要參與細(xì)胞代謝過(guò)程，與HCC細(xì)胞代謝失調(diào)相關(guān)。circTMBIM1可能通過(guò)影響Huh7細(xì)胞代謝調(diào)控miR-24-3p的下游基因，從而促進(jìn)Huh7細(xì)胞增殖、遷移。因此circTM‐BIM1可能是HCC的潛在治療靶點(diǎn)。本研究仍存在一定局限性，樣本量較小，需要招募更多患者進(jìn)一步闡明circTMBIM1的臨床意義，且未涉及miR-24-3p的下游基因。circTMBIM1在體內(nèi)的致癌作用及合成和降解機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次探討了circTMBIM1在人HCC細(xì)胞中的生物學(xué)功能，證明circTMBIM1在HCC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。此外，circTMBIM1的致癌作用可能與miR-24-3p的抑制有關(guān)，circTMBIM1可能成為HCC治療的有效靶點(diǎn)。