靶向線粒體治療脊髓損傷的療效：基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)

王麗群，龐日朝，劉建成，張安仁

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院，四川成都市 610075；2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，四川成都市 610083；3.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，上海市200434

線粒體是一種雙膜細(xì)胞器，通過氧化磷酸化產(chǎn)生細(xì)胞的大部分三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)。線粒體的結(jié)構(gòu)包括線粒體外膜、線粒體膜間隙、線粒體內(nèi)膜和線粒體基質(zhì)。線粒體外膜是一個(gè)磷脂雙層，包含電壓依賴性陰離子通道，該通道在打開時(shí)允許小分子通過，包括離子、二磷酸腺苷和ATP[1]。線粒體內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，包含多個(gè)膜內(nèi)通道，這些通道的開放受到嚴(yán)格控制，其調(diào)節(jié)電子傳輸鏈(elec?tron transport chain,ETC)以保持ATP 合成所必需的電化學(xué)梯度[2]。ETC 由四個(gè)膜結(jié)合的復(fù)合體和兩個(gè)載體分子(輔酶Q 和細(xì)胞色素C)組成。復(fù)合體包括：復(fù)合體I、復(fù)合體Ⅱ、復(fù)合體Ⅲ和復(fù)合體Ⅳ。線粒體可以充當(dāng)能量儲(chǔ)存器，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平，并在依賴于線粒體的鈣緩沖和ATP 產(chǎn)生的神經(jīng)元中起著重要的作用[3]。

脊髓損傷是脊柱損傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥，往往導(dǎo)致毀滅性和持續(xù)性的功能喪失。脊髓損傷具有復(fù)雜的病理過程，一般分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段。繼發(fā)性損傷由原發(fā)性損傷逐漸發(fā)展而來，對(duì)脊柱組織產(chǎn)生進(jìn)一步的化學(xué)和機(jī)械損傷。脊髓損傷早期繼發(fā)性反應(yīng)是去極化和電壓依賴性離子通道的打開，導(dǎo)致谷氨酸受體的激活，大大增加谷氨酸的濃度，并產(chǎn)生持續(xù)的興奮性毒性和細(xì)胞死亡，壞死細(xì)胞中高水平的谷氨酸鹽通過增加細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+的濃度并降低細(xì)胞內(nèi)K+的濃度來改變離子通量[4]。Ca2+積累過多，將觸發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permea?bility transition pore,mPTP)，mPTP 的開放會(huì)干擾質(zhì)子梯度，使ATP 失活，增加水和其他分子進(jìn)入線粒體基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹并最終死亡[5]。正常情況下，電子從ETC 泄露并與線粒體基質(zhì)的氧氣結(jié)合形成活性氧，內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)可防止活性氧，引起毒性。然而，脊髓損傷可導(dǎo)致ETC受損和能量不足，形成過多活性氧，超過抗氧化系統(tǒng)的可控范圍，最終導(dǎo)致氧化損傷和病理水平。活性氧促使強(qiáng)氧化劑過氧亞硝酸鹽生成增加，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)一氧化氮合酶的活化，同時(shí)還可以觸發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)羰基化和酪氨酸硝化，進(jìn)而損傷線粒體并造成線粒體功能障礙[6]。另外，線粒體功能障礙還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素C 釋放到細(xì)胞質(zhì)中并造成細(xì)胞凋亡[7]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)所需的大部分能量由線粒體提供，而神經(jīng)元的生存則需要足夠的能量。因此，脊髓損傷后的線粒體功能障礙可能導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，加劇損傷[8]。

脊髓損傷具有復(fù)雜的病理生理過程，目前有眾多改善脊髓損傷的治療方法，包括手術(shù)治療、藥物治療、細(xì)胞移植和納米技術(shù)等[9?12]。然而，目前臨床上仍未找到確切、有效的方法[13]，無論是傳統(tǒng)的手術(shù)干預(yù)和藥物治療，還是新型的細(xì)胞移植和納米技術(shù)，均存在其不可避免的缺陷。在神經(jīng)元中，線粒體在鈣穩(wěn)態(tài)、控制膜興奮性以及神經(jīng)傳遞和可塑性中起著重要作用。由于神經(jīng)元特別依賴于線粒體的鈣緩沖和ATP產(chǎn)生，因此對(duì)線粒體缺陷高度敏感。越來越多的證據(jù)表明，線粒體功能障礙參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制，尤其是晚發(fā)性神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓氏病等[14]。脊髓損傷后線粒體維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的能力降低，導(dǎo)致ATP 依賴性細(xì)胞功能喪失、鈣超載、興奮性中毒和氧化應(yīng)激的喪失，進(jìn)而加劇損傷[15]。以上研究表明，線粒體功能障礙與脊髓損傷導(dǎo)致的有害繼發(fā)性病理生理密切相關(guān)。因此，損傷后線粒體功能的恢復(fù)可能是治療脊髓損傷的潛在有效方法?？梢酝ㄟ^不同方法直接靶向脊髓損傷后線粒體功能障礙，包括通過使用替代性能源、抗氧化、抗凋亡、抑制mPTP 和增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生等多種機(jī)制靶向線粒體藥理學(xué)方法(表1)。靶向線粒體治療脊髓損傷可能改善的功能和相關(guān)評(píng)定方法或指標(biāo)見表2。本研究收集國內(nèi)外已發(fā)表的靶向線粒體治療脊髓損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)靶向線粒體治療脊髓損傷的作用進(jìn)行系統(tǒng)綜述，為今后臨床治療脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。

表1 靶向線粒體治療脊髓損傷的作用機(jī)制及其相關(guān)藥物

表2 靶向線粒體治療脊髓損傷涉及的功能結(jié)局和相關(guān)評(píng)定方法或指標(biāo)

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

檢索PubMed、Web of Science、中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)，檢索年限自建庫至2021 年2 月。中文檢索詞：脊髓損傷、線粒體、功能障礙、治療等；英文檢索詞：spinal cord injury、mitochondria、dysfunction、treatment等。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

疾病及動(dòng)物種屬：脊髓損傷動(dòng)物模型，不限制動(dòng)物種屬和造模方法。

干預(yù)措施和對(duì)照措施：靶向線粒體治療的藥物干預(yù)和安慰劑或其他對(duì)照。

主要結(jié)局指標(biāo)：脊髓損傷動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能(BBB評(píng)分)、脊髓組織病理學(xué)(受損組織和殘余組織面積)、抗氧化功能、抗凋亡功能、線粒體生物發(fā)生。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①非干預(yù)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；②非對(duì)照研究；③數(shù)據(jù)不完整；④非中、英文；⑤重復(fù)發(fā)表。

1.4 文獻(xiàn)篩選與資料提取

由2 名研究者獨(dú)立篩選文獻(xiàn)、提取資料并交叉核對(duì)。如有分歧，則通過討論或與第三方協(xié)商解決。文獻(xiàn)篩選時(shí)首先閱讀文題和摘要，在排除明顯不相關(guān)的文獻(xiàn)后，進(jìn)一步閱讀全文，確定最終納入的研究。文獻(xiàn)篩選流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

閱讀全文后由兩名研究者獨(dú)立提取相關(guān)數(shù)據(jù)并交叉核對(duì)。提取以下內(nèi)容。①納入研究的基本信息：第一作者、發(fā)表年份、樣本量、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬及模型種類、干預(yù)方式等。②結(jié)局指標(biāo)：脊髓損傷動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能(BBB評(píng)分)、脊髓組織病理學(xué)(受損組織和殘余組織面積)、抗氧化能力、抗凋亡能力、線粒體的生物發(fā)生等。

1.5 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：采用基于Cochrane偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具制定的SYRCLE 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具(SYRCLE's risk of bias tool for animal studies)[26]，包括6種偏倚類型(選擇偏倚、實(shí)施偏倚、測量偏倚、失訪偏倚、報(bào)告偏倚和其他偏倚)和10 個(gè)條目，評(píng)估結(jié)果最終以“是”、“否”和“不確定”表示，其中“是”代表低風(fēng)險(xiǎn)偏倚，“否”代表高風(fēng)險(xiǎn)偏倚，“不確定”代表不確定風(fēng)險(xiǎn)偏倚。

證據(jù)質(zhì)量評(píng)估：采用CERQual (Confidence in the Evidence from Reviews of Qualitative research)[27]進(jìn)行評(píng)估。CERQual 工具從4 個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估：①方法學(xué)局限性；②相關(guān)性；③一致性；④數(shù)據(jù)充分性。綜合以上4 部分的評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)系統(tǒng)評(píng)價(jià)單個(gè)結(jié)果進(jìn)行信度分級(jí)(高、中、低、極低）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

由于納入的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究存在臨床異質(zhì)性和方法學(xué)異質(zhì)性，難以進(jìn)行定量分析，故僅進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果

初步檢索得到相關(guān)文獻(xiàn)757 篇，其中英文653 篇，中文104 篇。經(jīng)逐層篩選，最終納入11 篇?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)，其中中文3篇，英文8篇。文獻(xiàn)篩選結(jié)果見圖1。

2.1 納入文獻(xiàn)的基本特征

納入的11篇文獻(xiàn)[28?38]的基本特征見表3。

表3 納入研究的基本特征

2.2 質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

根據(jù)SYRCLE 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具對(duì)納入研究進(jìn)行評(píng)價(jià)。11項(xiàng)研究都對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基線情況進(jìn)行報(bào)道，平行可比。文獻(xiàn)均提及“隨機(jī)”或“隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)”，但其具體的隨機(jī)化方法和是否采取適當(dāng)?shù)姆椒▉韺?shí)現(xiàn)隨機(jī)序列的不可預(yù)測性尚不清楚。7 項(xiàng)研究交代對(duì)飼養(yǎng)者和研究者實(shí)施盲法；7 項(xiàng)研究報(bào)告對(duì)結(jié)果評(píng)價(jià)者實(shí)施盲法；所有研究均對(duì)動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)化安置；7項(xiàng)研究對(duì)結(jié)局指標(biāo)進(jìn)行隨機(jī)評(píng)估；9項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)報(bào)告完整。見表4。

表4 納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

2.2.2 CERQual證據(jù)質(zhì)量評(píng)估結(jié)果

CERQual 證據(jù)質(zhì)量評(píng)估結(jié)果5 個(gè)結(jié)局指標(biāo)中，證據(jù)質(zhì)量為高、中和低。證據(jù)質(zhì)量降級(jí)的原因包括原始研究的方法學(xué)限制、概括性較差和較多數(shù)據(jù)無法進(jìn)行合并和轉(zhuǎn)化等。見表5。

2.3 系統(tǒng)評(píng)價(jià)結(jié)果

11 項(xiàng)研究中，6 項(xiàng)研究選用雄性或雌性Sprague?Dawley 大 鼠[28?31,34?35]，其 余5 項(xiàng)研究 選擇其 他種屬鼠[32?33,36?38]，8 項(xiàng)研究大鼠體質(zhì)量150～275 g[28?29,31?36]，所有研究的脊髓損傷動(dòng)物模型集中于T9～T11挫傷性脊髓損傷，但使用的脊髓打擊器和打擊力度存在差異。研究的干預(yù)措施存在較大異質(zhì)性，干預(yù)藥物的種類、使用時(shí)間、頻率、濃度和劑量等均不相同。在對(duì)照組中，5 項(xiàng)研究使用生理鹽水[28?29,32,34,36]，2 項(xiàng)研究使用空白對(duì)照和相互對(duì)照[33,35]。由于納入研究在動(dòng)物種屬、動(dòng)物模型和結(jié)局指標(biāo)測量等方面存在較大的異質(zhì)性，因此無法對(duì)不同研究數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta 分析，只進(jìn)行定性描述。

2.3.1 運(yùn)動(dòng)功能

9 項(xiàng)研究報(bào)告運(yùn)動(dòng)功能，其中7 項(xiàng)研究采用BBB評(píng)分評(píng)估運(yùn)動(dòng)功能，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組動(dòng)物相比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的BBB 評(píng)分更 高[28?30?31?36,38]。Springer 等[31]在BBB評(píng)分基礎(chǔ)上，還利用DigiGait 圖像分析系統(tǒng)，顯示與假手術(shù)動(dòng)物相比，安慰劑對(duì)照組在站立階段花費(fèi)的步幅持續(xù)時(shí)間百分比顯著增加，但在Neu2000 治療后顯著減少(與安慰劑對(duì)照組相比)。另外，分別有一項(xiàng)研究采用BSM 評(píng)分[21]和Rivlin 斜板實(shí)驗(yàn)[20]，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能改善。

2.3.2 組織病理學(xué)

8 項(xiàng)研究報(bào)告脊髓組織病理學(xué)，其中3 項(xiàng)研究采用HE 染色[29,34?35]，5 項(xiàng)研究采用鉻花青染色[28,32,36?38]，5項(xiàng)研究進(jìn)行定量分析脊髓受損組織和殘余組織體積[28,32,36?38]，與對(duì)照組相比，在整個(gè)脊髓橫斷面上治療組受損組織體積較小，殘存體積有所增加。但Spring?er 等[31]報(bào)告，與對(duì)照組相比，NIM811 的20 mg/kg 和40 mg/kg 劑量均顯著降低病變的平均體積，10 mg/kg的實(shí)驗(yàn)組卻沒有。

表5 納入研究的CERQual證據(jù)質(zhì)量評(píng)估結(jié)果

2.3.3 抗氧化功能

6 項(xiàng)研究報(bào)告抗氧化功能，其中4 項(xiàng)報(bào)告MDA 和SOD[29,31,33,35]，分別有2 項(xiàng)報(bào)告GSH?Px[33,35]和CAT[31,35]，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)后血清MDA 水平降低，SOD、GSH?Px和CAT水平增加。

2.3.4 抗凋亡功能

2項(xiàng)研究報(bào)告抗氧化功能，均采用TUNEL染色進(jìn)行檢測。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)后細(xì)胞凋亡指數(shù)降低[29]，逆轉(zhuǎn)凋亡相關(guān)蛋白(Smac/Diablo、細(xì)胞色素C、FAS 配體、腫瘤壞死因子?α、缺氧誘導(dǎo)因子?1α、P53、Bax和Bcl?2等)的表達(dá)[34]。

2.3.5 線粒體生物發(fā)生

3 項(xiàng)研究報(bào)告線粒體的生物發(fā)生，其中1 項(xiàng)報(bào)告線粒體呼吸速率和關(guān)鍵線粒體酶復(fù)合物的活性，結(jié)果顯示與對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)組干預(yù)顯著保持了線粒體的呼吸和酶活性，即維持線粒體的生物能[28]。1 項(xiàng)報(bào)告損傷部位的線粒體DNA 和蛋白質(zhì)含量，結(jié)果顯示與假對(duì)照組相比，脊髓損傷后3 d，損傷和周圍損傷部位的線粒體DNA 含量降低約45%；LY344864 減輕了損傷部位DNA的減少，并且增加線粒體DNA含量(相較于對(duì)照組)[37]。1項(xiàng)報(bào)告線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白PGC?1α，脊髓損傷后骨骼肌中PGC?1α 降低，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)組干預(yù)后可增加[38]。

3 討論

本研究納入11項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，靶向線粒體治療脊髓損傷可以促進(jìn)損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，減少脊髓受損組織和增加殘存組織體積而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可能是通過替代性能源、抗氧化、抗凋亡、抑制mPTP 和增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生等多種作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)。

本研究納入文獻(xiàn)的動(dòng)物基線和造模方法差異較大。動(dòng)物的種類、品系、性別、年齡和體質(zhì)量等基線情況對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較大，納入研究的動(dòng)物主要為Sprague?Dawley 大鼠，脊髓損傷動(dòng)物模型主要為T9～T11挫傷模型，但造模設(shè)備和造模參數(shù)存在很大差異。這是由于脊髓挫傷模型是建立最早的脊髓定量損傷模型，是模擬臨床急性脊髓損傷的理想模型[39?40]。該主要用于模擬臨床上因暴力撞擊而導(dǎo)致的脊髓損傷，其損傷后會(huì)造成炎癥、缺血和脊髓空洞形成等，是實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷的標(biāo)準(zhǔn)造模技術(shù)[41]。但是由于動(dòng)物模型需要考慮眾多臨床需要，脊髓挫傷模型的造模設(shè)備和造模參數(shù)存在很大差異。脊髓損傷的不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谘芯坎∽儼l(fā)展、恢復(fù)機(jī)制和潛在治療干預(yù)措施的不同方面時(shí)各有利弊，但靈長類脊髓損傷動(dòng)物模型可以幫助開發(fā)與人類更相關(guān)的有效方法[42]。未來應(yīng)當(dāng)針對(duì)不同動(dòng)物種屬和損傷模型，進(jìn)一步深入研究以促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化。

納入的文獻(xiàn)干預(yù)措施差異較大。干預(yù)藥物的種類、使用時(shí)間、頻率、濃度和劑量等均不相同。納入研究的干預(yù)藥物包括ALC、α?生育酚、米諾環(huán)素、痿證中藥方、NIM811、LY344864 和福莫特羅等[28?38]。各種藥物的藥理作用、干預(yù)藥物濃度(2 mg/kg、25 mg/kg、90 mg/kg 和300 mg/kg)[28,31?33,37]、開始使用時(shí)間(術(shù)后即刻、15 min、30 min、1 h 或8 h)[28,32,34,37]、使用頻 率(1 次/d、1 次/周 和2 次/周)[29,31]、持續(xù)時(shí) 間(6 d、30 d、5 周和6 周)[29,31?32,35]等均不相同。未來應(yīng)該針對(duì)同種脊髓損傷模型和干預(yù)藥物，對(duì)藥物濃度、劑量、使用時(shí)間和頻率進(jìn)行深入藥代動(dòng)力學(xué)分析，盡早進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化。

本研究納入文獻(xiàn)CERQual證據(jù)質(zhì)量等級(jí)不高，結(jié)局指標(biāo)抗凋亡功能和增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生評(píng)估為“低”等級(jí)，存在選擇、實(shí)施、測量和失訪偏倚。未來應(yīng)納入規(guī)范設(shè)計(jì)和實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

本研究局限性：①只納入公開發(fā)表的中、英文文獻(xiàn)，存在一定語言偏倚；②對(duì)灰色文獻(xiàn)的檢索不夠全面，可能存在漏檢和產(chǎn)生偏倚；③納入研究沒有進(jìn)行功效分析以確定樣本量大小，基線資料的比較不夠詳細(xì)；④某些研究未交代清楚隱蔽分組和對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)者及結(jié)果評(píng)價(jià)者施盲，可能產(chǎn)生盲法偏倚；⑤由于納入研究在實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)、干預(yù)措施和結(jié)局指標(biāo)等多方面的異質(zhì)性，本研究無法對(duì)納入研究數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析；⑥某些研究質(zhì)量較低，可能存在發(fā)表偏倚。

綜上所述，靶向線粒體治療脊髓損傷可以改善損傷后的運(yùn)動(dòng)功能，減少脊髓受損組織和增加殘存組織體積而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其可能是通過替代性能源、抗氧化、抗凋亡、抑制mPTP 和增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生等多種作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)。受納入研究數(shù)量和質(zhì)量的限制，上述結(jié)論尚待更多高質(zhì)量研究予以驗(yàn)證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。