濃縮血小板的制備和保存過程中血小板表面組織因子的表達(dá)

何博 譚愛玲 胡文娟 陳小光 黃小敏 陳漢妹 黃小琴

1廣州血液中心（廣州510095）；2廣州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（血液安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）（廣州510095）

血小板數(shù)量減少或者功能異?；颊咝枰斪⒋罅垦“逡灶A(yù)防或阻止出血［1］。這些以高濃縮血小板懸浮液的形式提供的血小板即血小板濃縮物（platelet concentrate，PC）［2］。PC輸注成功的關(guān)鍵是血小板具有良好的止血潛力。而血小板減少癥病患需要輸注大量血小板以預(yù)防或阻止出血［3］。特別是輸注PC治療病患時(shí)，必須高效、及時(shí)的止血［4］。

由于多種原因，評(píng)估PC療效并不容易。輸注適應(yīng)癥存在異質(zhì)性，病患從意外創(chuàng)傷到大手術(shù)再到血液腫瘤和遺傳性或獲得性血小板疾病等包括多種類型。對(duì)于每種適應(yīng)癥，均難以實(shí)現(xiàn)患者群體一致性，并且所有患者并非都出現(xiàn)（嚴(yán)重）出血。此外，缺乏標(biāo)化的指標(biāo)客觀測量血小板在輸血功效中的作用。既往PC活力等檢測只反映濃縮方法的效率而并非血小板質(zhì)量。組織因子（tissue factor，TF）是凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)子，與血Ⅶ/Ⅶa結(jié)合形成復(fù)合物后，啟動(dòng)外源性凝血途徑，并與血小板互作，形成纖維蛋白［5］。二者共同參與止凝血反應(yīng)過程，并扮演重要角色。前期研究表明血小板表面存在TF［5］。此外，在實(shí)驗(yàn)條件控制良好的情況下，血小板顆粒和小管系統(tǒng)中含有活化的TF。然而，這種TF是血小板來源的，還是通過微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移機(jī)制從白細(xì)胞中獲得的，仍存在爭議。并且目前未見評(píng)估獻(xiàn)血員全血和輸血用PC表面TF表達(dá)的研究［6］。流式細(xì)胞術(shù)是研究血小板表面組織因子表達(dá)模式的有力工具，能夠反映血小板活化引起的變化。因此，本研究旨在探討PC的制備和保存過程中血小板表面TF的表達(dá)變化以及變化程度，并預(yù)測該蛋白是否可以作為血小板止血潛力的指標(biāo)。為了校準(zhǔn)分析，使用多個(gè)血小板激活標(biāo)記物，如P?選擇素（CD62P）［7］、纖維蛋白原［8］和GPIIb（CD41）［9］。本研究還在病患基線資料基礎(chǔ)上分析了獻(xiàn)血員ABO血型對(duì)TF和其他止血標(biāo)志物表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 血液采集和樣品制備收集自我中心的189名獻(xiàn)血員，男156例，女24例，包括O組（O型血）68例，A組（A型血）64例，B組（B型血）48例，AB組（AB型血）9例，全血共（452±53）mL置于CPD采血五聯(lián)袋。獻(xiàn)血員平均年齡（42.8±22.1）歲，血小板計(jì)數(shù)為（229.7±45.5）×109/L。在獻(xiàn)血日（第0天），從每個(gè)血袋中取500 μL用于流式細(xì)胞術(shù)分析血小板表面抗原表達(dá)。

1.2 PC制備從采血（第1天）起24 h內(nèi)，在我中心制備PC。采集后6 h內(nèi)分別對(duì)以上三組五聯(lián)袋采集的全血第一次離心（2 100 g×12 min）；溫度（22±2）℃，分出白膜層血小板，靜置30 min后，再次離心（400 g×8 min），將血小板轉(zhuǎn)移至血小板袋內(nèi)，即為濃縮血小板［10］。在（22±2）℃環(huán)境下靜置1～2 h，待其自然解聚后，輕輕搖動(dòng)血袋，使其成均勻混懸液。全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。在同一天（第1天）和存儲(chǔ)3 d（第4天）或4天（第5天）后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。

1.3 流式細(xì)胞儀分析BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。通過常規(guī)方法，單抗免疫熒光標(biāo)記測定平均熒光強(qiáng)度或特異性熒光抗體結(jié)合陽性血小板的百分率來檢測血小板的活化情況。將5 μL獻(xiàn)血員全血或PC樣品添加到100 μL PBS中，分別加入飽和濃度的TF?FITC，CD62P?FITC，纖維蛋白原?FITC，CD41?FITC（均采購自Invitrogen流式細(xì)胞儀抗體，美國）。使用同型對(duì)照IgG?FITC抗體作為陰性對(duì)照。所有標(biāo)記均在流式細(xì)胞儀試管中進(jìn)行（Attune NxT，Invitrogen）。在室溫20 min后，將樣品稀釋于600 μL PBS中，并立即通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。對(duì)于每個(gè)標(biāo)記，記錄陽性血小板占血小板總數(shù)的百分比；數(shù)據(jù)同時(shí)分析為以任意單位表示的平均熒光強(qiáng)度（aver?age fluorescence intensity，MFI），熒光信號(hào)強(qiáng)度與抗原密度直接相關(guān)。并計(jì)算第4天或第5天與第1天的值之間的陽性血小板或MFI的百分比差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)檢測變量的分布，采用t檢驗(yàn)比較計(jì)量資料兩組之間的差異。在P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC制備對(duì)血小板TF的影響見圖1，與獻(xiàn)血員全血（非黑色柱）相比，PC（黑色柱）中的TF和其他標(biāo)志物的表達(dá)明顯高于全血（P<0.05）。其中TF增加48%［血小板陽性率（14.8±5.4）%］，纖維蛋白原增加38.2%［血小板陽性率（23.9±10.2）%］，CD62P增加150%［血小板陽性率（26.5±13）%］和CD41增加10.3%［MFI（9 920±2 761）單位］，說明PC制備可促進(jìn)TF活化。

圖1 PC（黑色柱）制備對(duì)血小板表面上的TF、纖維蛋白原、CD62P和CD41的表達(dá)影響Fig.1 Expression of TF，fibrinogen，CD62P，and CD41 on platelet surface in freshly prepared PC（black bars）

2.2 PC儲(chǔ)存對(duì)血小板TF的影響在PC儲(chǔ)存期間，從第1天到第5天，TF以及其他血小板標(biāo)記物的水平持續(xù)增加（圖2）。特別是在第5天，TF的陽性血小板百分比（平均升高）增加了32%（相對(duì)于第1天，P<0.05），纖連蛋白原的上升了31%（P<0.05），CD62P水平上升了148%，CD41隨時(shí)間MFI逐漸上升，說明PC儲(chǔ)存可促進(jìn)TF活化。

2.3 各組獻(xiàn)血員全血血小板中TF分析見圖3。流式細(xì)胞儀分析的全部獻(xiàn)血員及其ABO血型的全血血小板中TF的表達(dá)。TF陽性血小板的平均百分?jǐn)?shù)為（10±6.7）%。與A組（9±5.2）%，B組（8.4±5.3）%和AB組（7.9±4.9）%獻(xiàn)血員相比，O組的血液樣本顯示TF陽性的血小板百分比（11.7±4.8）%高于前兩組（均P<0.05）。說明TF存在于各組獻(xiàn)血員血小板表面，且O型血TF表達(dá)顯著高于非O型血。

2.4 ABO血型組濃縮后與各指標(biāo)關(guān)系根據(jù)ABO血型分析顯示（表1），除TF抗原密度在A組血小板中最低，與其他血型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）外，其他評(píng)估指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明除TF外，ABO血型對(duì)活化各指標(biāo)無影響。

圖2 PC儲(chǔ)存對(duì)血小板止血指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of PC storage on platelet hemostatic markers

圖3 健康獻(xiàn)血員全血中血小板表面的TF表達(dá)Fig.3 TF expression on platelet surface in donor whole blood

3 討論

血小板以高濃縮血小板懸浮液的形式提供，即所謂的PC，通過單采血液從單個(gè)獻(xiàn)血員或合并多個(gè)隨機(jī)獻(xiàn)血員富含血小板的血漿中獲得［11］。由于存在細(xì)菌污染風(fēng)險(xiǎn)和所謂的“血小板儲(chǔ)存損傷”現(xiàn)象［12］，一般建議盡快使用PC；在我國，通常是在準(zhǔn)備PC后的5 d內(nèi)使用［13］。關(guān)于凝血受體，一些研究表明血小板表面存在TF［14-15］。TF是一種膜糖蛋白，是血漿凝血因子Ⅶ的高親和力受體。TF/FVIIa復(fù)合物觸發(fā)外在途徑，最終導(dǎo)致凝血酶生成和纖維蛋白形成［16］。此外，在良好控制的實(shí)驗(yàn)條件下，血小板在α顆粒和小管系統(tǒng)中含有功能性活性TF［17-19］。按以上結(jié)果表明，獻(xiàn)血員全血血小板存在TF，在PC制備和保存過程中其表達(dá)得以保留。

表1 ABO血型各指標(biāo)關(guān)系Tab.1 Relationship among indexes of ABO blood group system±s

表1 ABO血型各指標(biāo)關(guān)系Tab.1 Relationship among indexes of ABO blood group system±s

所有組O組A組B組AB組4.7±5.514.1±6.614.5±3.816.5±7.615.7±6.1 655±223755±269562±116651±166647±187 TF平均百分?jǐn)?shù)（%）MFI纖維蛋白原平均百分?jǐn)?shù)（%）MFI CD62P平均百分?jǐn)?shù)（%）MFI CD41平均百分?jǐn)?shù)（%）MFI 1 23.7±10.4 815±415 26.6±12.8 1 038±425 100 9 923±2758 24.8±11.1 768±308 25.3±11.3 1 025±465 100 9 375±3 275 23.3±8.1 792±471 26.6±15.2 985±355 100 9 668±2 210 22.5±12.5 952±332 26.6±19.3 1 126±355 100 10 875±1 750 23.5±11.3 738±365 25.3±15.6 1 026±386 100 9 785±2 021

PC輸血成功的關(guān)鍵是血小板具有良好的止血潛力［20］。特別當(dāng)給予PC來停止正在進(jìn)行的出血事件時(shí)，血小板止血作用必須是有效且快速的?，F(xiàn)在有大量研究支持以下證據(jù)［21-23］：血小板不僅通過形成血小板栓塞參與原發(fā)止血過程，而且還可以通過提供特定的高親和力受體，蛋白酶，酶原和輔因子來積極促進(jìn)凝血級(jí)聯(lián)的傳播，從而有助于將凝血酶的產(chǎn)生定位在血管損傷的部位［24］。不管血小板TF的來源如何，它的存在顯著促進(jìn)凝血作用。以上均強(qiáng)調(diào)PC保持TF表達(dá)的重要性，并本研究表明，PC制備和儲(chǔ)存后，血小板表面的TF沒有被去除，TF增加分別為48%、32%。在PC存儲(chǔ)期間TF陽性血小板的百分比增多。P?選擇素是測量血小板活化的經(jīng)典標(biāo)志物。本研究數(shù)據(jù)顯示，在PC制備和儲(chǔ)存過程中，標(biāo)志物的表達(dá)均顯著增加，這與以前的報(bào)道是一致的。P?選擇素這被認(rèn)為是最敏感的血小板活化標(biāo)記，無論是從全血處理到PC和存儲(chǔ)期間均呈現(xiàn)顯著增加。在PC儲(chǔ)存結(jié)束時(shí)，與全血相比，P?選擇素陽性血小板的百分比增加了約150%。表明TF可能是另外一個(gè)有潛在標(biāo)志物，并且，TF對(duì)于血小板活化的臨床療效，可能更具有直接意義。目前的工作還評(píng)估了ABO血型對(duì)血小板止血參數(shù)的影響，這一領(lǐng)域還在初步探索階段。早期已證明ABO血型對(duì)血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）和凝血因子VIII有顯著影響［25］，這兩種標(biāo)記物的循環(huán)水平O組受試者比非O組受試者更低。筆者觀察到，來自O(shè)組的血小板對(duì)TF的陽性率最高。但在PC制備后，在ABO血型之間的血小板止血標(biāo)志物的差異消失了。結(jié)果顯示血型并不會(huì)影響PC制備后止血標(biāo)記物的表達(dá)。

本研究的局限性歸納為以下幾點(diǎn)：首先，本研究僅納入180名獻(xiàn)血員。其次，僅利用流式細(xì)胞儀評(píng)估制備及儲(chǔ)存對(duì)于血小板的影響。最后，依然是單中心研究。因此，進(jìn)一步研究需要經(jīng)多種類型的血液自動(dòng)分析儀進(jìn)行大規(guī)模的多中心分析，以驗(yàn)證本研究結(jié)果的可靠性。

總之，以上結(jié)果均表明，在PC制備過程中直至儲(chǔ)藏期結(jié)束，血小板表面均有TF表達(dá)。當(dāng)然，凝血分子機(jī)制極為復(fù)雜，研究僅局限在TF表達(dá)方面，并且臨床醫(yī)生及研究小組的科學(xué)能力會(huì)影響結(jié)果評(píng)估。血小板與TF表達(dá)之間有密切關(guān)系，血小板在止血、凝血及血栓性疾病發(fā)病方面起著其他重要的作用，因此在輸血實(shí)踐中，將進(jìn)一步研究對(duì)接受受試者的止血平衡產(chǎn)生臨床相關(guān)影響。