CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞穿孔素異常表達(dá)對手足口病免疫狀態(tài)評估及預(yù)后的指導(dǎo)價(jià)值

黃崇剛 陳靜琳 喇海芹

青海省婦女兒童醫(yī)院呼吸科（西寧810007）

手足口?。℉FMD）是一種由腸道病毒感染引發(fā)的兒童傳染病，病原體主要為腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A16型（CA16）病毒［1］。HFMD大多預(yù)后良好，但部分病情較重者可在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)急性肺水腫、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥甚至死亡。多項(xiàng)研究表明，免疫功能紊亂在HFMD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，尋找到一種評估HFMD患兒免疫狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)，對指導(dǎo)臨床治療和改善預(yù)后具有重要意義［2］。有研究認(rèn)為，EV71病毒蛋白表型A3可能是誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化的主要決定簇，在病毒后期蛋白加工過程A3重新修飾可能會(huì)影響CD4+T細(xì)胞的增殖狀態(tài)，因此CD4+T細(xì)胞表達(dá)或許能反映HFMD的病情發(fā)展［3］。NK細(xì)胞穿孔素（PRF）能協(xié)助顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞清除病原體，有學(xué)者認(rèn)為其表達(dá)能在一定程度上反映病毒感染程度和預(yù)測預(yù)后［4］，但具體情況有待進(jìn)一步研究。本研究通過分析143例EV71型HFMD患兒 體內(nèi)CD4+T細(xì) 胞、NK細(xì)胞PRF表 達(dá)水平與免疫狀態(tài)和預(yù)后關(guān)系，為探索HFMD發(fā)病機(jī)制及改善患兒預(yù)后提供一定參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年1月至2020年6月我院收治的143例EV71型HFMD患兒，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患兒確診為HFMD，參考《手足口病診療指南（2018年版）》［5］；（2）病程≤3 d；（3）臨床資料完善；（4）患兒家長知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并慢肺阻、先天性心臟病、營養(yǎng)不良等基礎(chǔ)疾?。唬?）合并嚴(yán)重腎臟相關(guān)疾??；（3）外院轉(zhuǎn)入或用藥史不詳患兒；（4）近期有使用過免疫抑制劑或注射免疫球蛋白者。入選患兒按照病情嚴(yán)重程度［6］分為普通型組（n=67）、重型組（n=45）和危重型組（n=31），同時(shí)按照性別、年齡匹配原則另選體檢正常兒童35例作為對照組，且腸道病毒抗體陰性，無嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、代謝異常等。普通型組，男37例，女30例，年齡（1.82±0.92）歲，病程（1.63±0.25）d，其中27例EV71感染，22例CA16感染，18例通用病毒感染；重型組，男24例，女21例，年齡（1.77±0.86）歲，病程（1.72±0.33）d，其中25例EV71感染，13例CA16感染，7例通用病毒感染；危重型組，男17例，女14例，年齡（1.73±0.91）歲，病程（1.86±0.36）d，其中22例EV71感染，7例CA16感染，2例通用病毒感染；對照組，男20例，女15例，年齡（1.72±0.83）歲。各組患兒性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 方法收集患兒一般臨床資料，如性別、年齡、病程、感染病原體（經(jīng)肛門拭子和咽拭子RT?PCR檢測確定病毒類型）及各項(xiàng)生理指標(biāo)參數(shù)。于入組第1天采集患兒空腹靜脈血4 mL并置于加入EDTA的抗凝管中，采用全血法配置分析液，F(xiàn)ACS Multi SET程序獲得T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+T、CD4+T、CD8+T）、CD14+單核細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、NK細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)。將全血采用免疫比濁法檢測血清中疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）及補(bǔ)體（C3、C4）水平。在分離出的單個(gè)核細(xì)胞中加入表面抗體anti?CD56?APC（CD3+CD8+CTL細(xì)胞和CD3?CD56+NK細(xì)胞）進(jìn)行染色，固定、破膜。洗滌后加入PE標(biāo)記的PRF或顆粒酶B（GrzB）抗體，避光孵育1 h，洗滌，上流式細(xì)胞儀（美國BD公司Facs CantoⅡ型）檢測，以PRF或GrzB陽性細(xì)胞比率作為PRF或GrzB表達(dá)水平。采用小兒危重病例評分（PCIS）、小兒死亡危險(xiǎn)評分（PRISMⅢ）評價(jià)患兒病情嚴(yán)重程度，PCIS評分包括患兒心率、血壓、血?dú)庵?、pH、血鈉、血 鉀、有 無 應(yīng)激 性 潰瘍 等 內(nèi)容，總分100分［7］；PRISMⅢ評分包括體溫、心率、瞳孔反射、血壓、血?dú)庵怠⒀?、血?xì)胞計(jì)數(shù)等26個(gè)生理參數(shù)［8］，兩者均為分?jǐn)?shù)越高病情越嚴(yán)重，死亡風(fēng)險(xiǎn)越高。將入院28 d內(nèi)死亡作為預(yù)后不良，分析不同預(yù)后患兒CD4+T、NK細(xì)胞PRF表達(dá)差異。所有患兒均由我院2名副主任及以上級別醫(yī)師進(jìn)行疾病診斷和病情評估。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件包分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用snk?q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組T細(xì)胞、單核細(xì)胞水平比較重癥組、危重型組、普通型組患兒CD3+T、CD4+T、CD14+細(xì)胞數(shù)低于對照組，其中重癥組、危重型組低于普通型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），重癥組、危重型組、普通型組患兒CD8+T細(xì)胞數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 各組免疫細(xì)胞水平比較Tab.1 Comparison of immune cell levels in each group ±s，cells/μL

表1 各組免疫細(xì)胞水平比較Tab.1 Comparison of immune cell levels in each group ±s，cells/μL

注：與對照組比較，*P<0.05；與普通型比較，#P<0.05

組別危重型組重型組普通型組對照組例數(shù)31 45 67 35 CD4+T 630.2±126.7*#1 026.7±163.8*#1 137.5±149.5*1 682.2±123.4 CD3+T 1 776.2±384.2*#2 169.4±391.5*#2 483.2±368.7*3 794.2±494.3 CD8+T 764.2±170.8*796.3±124.2*834.2±253.6*1 174.2±493.5 CD14+340.5±74.7*#426.2±68.2*#473.6±56.9*759.2±38.4

2.2 各組B細(xì)胞、IgA、IgG、IgM及補(bǔ)體水平比較各組體液免疫指標(biāo)IgA、IgG、IgM及補(bǔ)體C3、C4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），重癥組、危重型組、普通型組患兒CD19+B細(xì)胞數(shù)低于對照組，其中重癥組、危重型組低于普通型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 各組B細(xì)胞、IgA、IgG、IgM及補(bǔ)體水平比較Tab.2 Comparison of B cell，IgA，IgG，IgM and complement levels in each group ±s

表2 各組B細(xì)胞、IgA、IgG、IgM及補(bǔ)體水平比較Tab.2 Comparison of B cell，IgA，IgG，IgM and complement levels in each group ±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與普通型比較，#P<0.05

組別危重型組重型組普通型組對照組例數(shù)31 45 67 35 CD19+（個(gè)/mL）604.5±135.7*#755.4±132.4*#820.7±276.8*1 101.4±362.5 IgA（g/L）0.98±0.24 1.01±0.25 1.12±0.26 1.04±0.17 IgM（g/L）1.20±0.24 1.13±0.18 1.24±0.21 1.12±0.30 IgG（g/L）9.84±35.4 10.20±1.89 9.29±1.15 9.16±1.29 C3（g/L）0.97±0.11 0.94±0.15 1.02±0.16 0.99±0.12 C4（g/L）0.19±0.07 0.16±0.06 0.21±0.08 0.18±0.05

2.3 各組NK細(xì)胞及PRF、GrzB水平比較重癥組、危重型組、普通型組患兒NK細(xì)胞數(shù)低于對照組，其中重癥組、危重型組低于普通型組，PRF、GrzB反之，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 各組NK細(xì)胞及PRF、GrzB水平比較Tab.3 Comparison of NK cells，PRF and GrzB levels in each group ±s

表3 各組NK細(xì)胞及PRF、GrzB水平比較Tab.3 Comparison of NK cells，PRF and GrzB levels in each group ±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與普通型比較，#P<0.05

組別危重型組重型組普通型組對照組例數(shù)31 45 67 35 NK細(xì)胞（個(gè)/μL）376.4±71.5*#390.4±43.2*#422.8±86.9*609.3±105.4 PRF（%）87.2±7.64*#75.6±10.1*#70.5±13.4*55.3±12.7 GrzB（%）92.4±6.5*#83.9±7.0*#79.2±8.2*57.2±13.4

2.4 CD4+T細(xì)胞、PRF與PCIS評分、PRISMⅢ評分相關(guān)性分別評價(jià)重癥和危重癥患兒病情嚴(yán)重程度，其PCIS評分分別為（78.35±6.84）、（70.84±6.34）分，PRISMⅢ評分分別為（7.29±2.71）、（12.84±3.56）分。Pearson相關(guān)性分析顯示，CD4+T細(xì)胞與PCIS評分呈正相關(guān)（r=0.665，P<0.05），與PRISMⅢ評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.757，P<0.05），PRF與PCIS評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.615，P<0.05），與PRISMⅢ評分呈正相關(guān)（r=0.596，P<0.05），見表4。

2.5 CD4+T細(xì)胞、PRF表達(dá)與臨床預(yù)后預(yù)后良好患兒CD4+T細(xì)胞高于預(yù)后不良患兒，NK細(xì)胞PRF低于預(yù)后不良患兒，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表5。

表4 CD4+T細(xì)胞、PRF與PCIS評分、PRISMⅢ評分相關(guān)性Tab.4 The correlation between CD4+T cells，PRF and PCIS score，PRISMⅢscore

表5 不同預(yù)后患兒CD4+T細(xì)胞、PRF表達(dá)Tab.5 CD4+T cell and PRF expression in children with different prognosis ±s

表5 不同預(yù)后患兒CD4+T細(xì)胞、PRF表達(dá)Tab.5 CD4+T cell and PRF expression in children with different prognosis ±s

組別預(yù)后良好預(yù)后不良t值P值例數(shù)112 31 CD4+T（個(gè)/mL）1 126.7±163.8 652.3±142.7 14.6516<0.001 PRF（%）65.6±12.1 42.8±9.5 9.689<0.001

3 討論

HFMD是常見的兒童腸道病毒感染疾病，部分患兒病情發(fā)展嚴(yán)重可并發(fā)心肺衰竭、神經(jīng)源性肺水腫等，引發(fā)患兒病死［9-10］。目前HFMD發(fā)病機(jī)制尚未明確，但已有多項(xiàng)研究證實(shí)細(xì)胞免疫在其中發(fā)揮作用。腸道病毒感染機(jī)體內(nèi)，體內(nèi)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞可迅速分化，從而釋放大量炎性因子或炎性介質(zhì)，而過度活化的免疫應(yīng)答損傷患兒肺部、大腦、神經(jīng)等組織或臟器，對患兒預(yù)后產(chǎn)生不利影響［11］。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在腸道病毒感染早期機(jī)體內(nèi)可出現(xiàn)細(xì)胞免疫紊亂、分泌細(xì)胞因子大量增加、代償性抗炎反應(yīng)強(qiáng)度增加，隨著病情持續(xù)發(fā)展，免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)逐漸消耗，患兒機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量開始減少，出現(xiàn)免疫抑制或免疫麻痹［12-13］。本次研究發(fā)現(xiàn)，HFMD患兒CD3+T、CD4+T、CD14+、CD19+B、NK細(xì)胞數(shù)及NK細(xì)胞PRF、GrzB均低于正常兒童，其中重癥、危重型患兒以上指標(biāo)均低于普通型患兒，提示HFMD患兒體內(nèi)存在明顯單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少，且重型和危重型患兒減少更為明顯。而不同病情嚴(yán)重程度患兒IgA、IgG、IgM及補(bǔ)體C3、C4水平無顯著差異，提示隨病情進(jìn)展，患兒體內(nèi)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞免疫功能抑制，因而可以說明細(xì)胞免疫異常也參與了HFMD的病情進(jìn)展。CD4+T是機(jī)內(nèi)常見免疫細(xì)胞，其絕對值與患兒年齡有關(guān)［14］，本次選擇各組患兒年齡無顯著差異，發(fā)現(xiàn)不同病情患兒體內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)具有顯著差異，且重癥、危重癥患兒CD4+T細(xì)胞數(shù)目低于普通型患兒。一般來說，機(jī)體免疫細(xì)胞在病毒感染刺激下可迅速被激活，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子來清除病毒［15］，而本次結(jié)果提示病情越重，CD4+T細(xì)胞表達(dá)抑制越嚴(yán)重。推測原因可能是在腸道病毒復(fù)制的過程中，能被CD4+T細(xì)胞識別的表型被重新修飾而引發(fā)CD4+T細(xì)胞受刺激和表達(dá)減少［16］。有學(xué)者認(rèn)為，CD4+T細(xì)胞對主要腸道感染病毒EV71和CA16感染并不敏感，因而CD4+T細(xì)胞并未隨病情進(jìn)展持續(xù)增加［17］。還有學(xué)者認(rèn)為，病毒感染刺激后機(jī)體免疫系統(tǒng)可能出現(xiàn)偏倚，即CD4+T細(xì)胞作用降低的同時(shí)，機(jī)體其他免疫細(xì)胞（如NK細(xì)胞）對該病毒更為敏感，殺傷作用增強(qiáng)［18］，但本次研究中其他淋巴細(xì)胞也減少，故此結(jié)論有待進(jìn)一步研究和論證。NK細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的第一道防線，也在腸道病毒感染過程中發(fā)揮重要作用［19］。NK細(xì)胞對病毒殺傷機(jī)制主要有兩點(diǎn)，一是調(diào)節(jié)T細(xì)胞表面抗原配體和Fas靶細(xì)胞表面抗原之間作用，二是細(xì)胞釋放PRF后可與靶細(xì)胞膜結(jié)合，PRF嵌入膜內(nèi)形成中空多聚體，損傷胞膜完整，外界水分子、離子及其他小分子物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞滲透壓從而破裂死亡［20-21］。PRF同時(shí)也協(xié)助顆粒酶通過顆粒胞吐作用進(jìn)入靶細(xì)胞，并誘導(dǎo)細(xì)胞核caspases的非依賴性細(xì)胞死亡，因而PRF、GrzB表達(dá)升高有利于抗病毒作用［22］。而本研究中相對于重癥患兒，普通型患兒PRF、GrzB表達(dá)升高，提示其介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和細(xì)胞毒性作用也相應(yīng)增加。推測原因可能是重癥患兒免疫功能不足，引發(fā)病毒大量復(fù)制和擴(kuò)散，PRF、GrzB介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和細(xì)胞毒性作用增強(qiáng)，炎癥因子釋放引發(fā)組織損傷，從而進(jìn)一步加重患兒病情［23］。相關(guān)性分析顯示，CD4+T細(xì)胞與PCIS評分呈正相關(guān)，與PRISMⅢ評分呈負(fù)相關(guān)，PRF反之，提示CD4+T細(xì)胞與PRF均與患兒病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。根據(jù)入院28 d是否死亡將患兒分為預(yù)后良好和預(yù)后不良，發(fā)現(xiàn)預(yù)后良好患兒CD4+T細(xì)胞高于預(yù)后不良患兒，NK細(xì)胞PRF低于預(yù)后不良患兒，提示CD4+T細(xì)胞與PRF能在一定程度上反映HFMD患兒預(yù)后。

綜上所述，手足口病患兒存在明顯CD4+T細(xì)胞表達(dá)過低、NK細(xì)胞PRF表達(dá)過高，兩者可用于重癥患兒細(xì)胞免疫狀況評估，且與患兒病情嚴(yán)重程度和預(yù)后不良有關(guān)。