梅毒血清固定患者NLRP3炎癥小體及細(xì)胞因子表達(dá)的研究

魯東平 張榮 王芬 魏少鳳 賈婕 張偉蓮 劉婷 梁瑞 楊文志

1深圳市寶安中醫(yī)院（集團(tuán)）（廣東深圳518133）；2深圳市寶安區(qū)慢性病防治院皮膚科（廣東深圳518133）；3鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市婦幼保健院產(chǎn)科（湖北黃石435000）；4深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院（廣東深圳518102）

梅毒血清固定是早期梅毒治療后血清學(xué)結(jié)果長期保持陽性的一種特殊狀態(tài)，隨著梅毒發(fā)病率增長迅速，診斷為梅毒血清固定的病例也有明顯增加［1］，梅毒血清固定患者體內(nèi)有沒有梅毒螺旋體（Tp）存在？有沒有必要反復(fù)治療？諸多疑惑困擾著患者，他們的身心健康及家庭關(guān)系受到影響［2］。在臨床隨訪工作中這種現(xiàn)象比較普遍，但是目前關(guān)于該病的成因還不清楚。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)多蛋白復(fù)合物，由NLRP3、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白（ASC）和前體胱天蛋白酶?1（Pro?caspase?1）組成，是天然免疫中重要的模式識別受體，通過信號傳導(dǎo)，激活炎癥因子；一旦該信號通路被激活，會誘導(dǎo)IL?1β和IL?18的分泌和成熟，它們會在感知細(xì)菌、螺旋體等的感染的天然免疫中，以及在宿主對感染而產(chǎn)生的獲得性免疫反應(yīng)中起著重要作用［3-4］。已有報(bào)道證實(shí)在兔模型中NLRP3炎癥小體參與了梅毒感染引起的炎癥過程［5］，但是它們是否與梅毒血清固的形成相關(guān)尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測梅毒血清固定患者及健康人的外周血單核細(xì)胞NLRP3炎癥小體的表達(dá)，探討NLRP3信號通路相關(guān)因子在梅毒血清固定患者中的作用，從天然免疫方向來研究梅毒血清固定可能的發(fā)病機(jī)制，為該病的防治提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象與分組病例的選擇：選取2018年9月至2020年9月在我院就診時(shí)已確診為梅毒血清固定患者50例作為實(shí)驗(yàn)組，其中男26例，女24例，年齡22～40歲，平均（26.3±4.2）歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）配偶或患者有不潔性交史；（2）每例病人均已接受過規(guī)范的梅毒治療方案驅(qū)梅治療，無臨床癥狀或治療后臨床癥狀消失；（3）3年隨訪期間經(jīng)TRUST、TPPA檢測均陽性，第一年每3個(gè)月有復(fù)查1次，第二年每6月復(fù)查血清1次，第三年復(fù)查血清1次；在隨訪期間滴度無下降或上升4倍的情況，TRUST滴度均≤1∶8；（4）HIV抗體檢測陰性；無生物學(xué)假陽性；（5）配偶或性伴長期性接觸未被傳染，育齡女性分娩的嬰兒未被傳染。實(shí)驗(yàn)組所有研究對象同時(shí)滿足以上5個(gè)條件［6］。

健康對照組的選擇：根據(jù)兩組年齡和性別構(gòu)成選健康志愿者50例作為對照組，其中男24例，女26例，年齡24～41歲，平均（25.8±4.1）歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）HIV抗體檢測陰性；（2）血清學(xué)TRUST連續(xù)兩次（間隔1月復(fù)查）檢查陰性。對照組所有研究對象同時(shí)滿足以上2個(gè)條件。兩組性別、年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究符合醫(yī)院倫理委員會要求。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除患有2型糖尿病、肥胖、痛風(fēng)、矽病、阿爾茨海默病及克羅恩病等已知的可以影響NLRP3炎癥小體信號通路的疾??；排除各種急慢性感染性疾病、嚴(yán)重的肺部疾病、肝臟及腎臟疾病。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集采集來我院就診的梅毒血清固定患者（50例）及健康志愿者（50例）的外周血。采集前，進(jìn)行常規(guī)消毒采集點(diǎn)及周圍皮膚，經(jīng)肘部靜脈采集外周靜脈血8 mL，共分二管，迅速置于肝素化的抗凝管中。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT?PCR）采用Ficoll?Hypaque淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法，分離各樣本PBMCs；采用Trizol（大連TaKaRa公司）法提取PBMCs中的mRNA；用BioMate 3S分光光度計(jì)測量260 nm和280 nm波長處理的OD值檢測mRNA純度、含量及完整性；使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（大連TaKaRa公司）進(jìn)行qRT?PCR。簡要步驟為先去除基因組DNA；隨后立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系如下：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃保存；最后于Bio?熒光定量PCR儀（美國伯樂BIO?RAD公司）進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃，30 s；PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，變性95℃，5 s；復(fù)性延伸60℃，30～60 s；PCR各基因所用引物引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成序列如表1；結(jié)果目的基因的表達(dá)水平通過GAPDH（glyceraldehyde?3?phosphate de?hydrogenase）進(jìn)行歸一化處理，采用2?ΔΔCt法對目的基因進(jìn)行相對定量。

表1 qRT?PCR所用引物Tab.1 Primers used for qRT?PCR in this study

1.2.3 ELISA測定血清IL?1β和IL?18的含量取抗凝血4 mL，迅速室溫1 000×g離心30 min收集樣本，小心取上清，分裝后-20℃儲存。采用Hu?man IL?1β High Sensitivity ELISA Kit（人白介素1β高敏ELISA試劑盒）和Human IL?18 ELISA Kit（人白介素18 ELISA試劑盒）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，測定IL?1β和IL?18的含量，步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)檢測結(jié)果均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量及細(xì)胞因子水平的組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梅毒血清固定患者PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，梅毒血清固定組PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的表達(dá)均低于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖1），mRNA具體的相對表達(dá)量見表2。

圖1 梅毒血清固定患者PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的表達(dá)水平Fig.1 Expression of NLRP3，ASC and Caspase?1 mRNA in PBMCs of patients with syphilis serofast state

表2 PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的相對表達(dá)量Tab.2 The relative expression of NLRP3，ASC and Caspase?1 mRNA in PBMCs ±s

表2 PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的相對表達(dá)量Tab.2 The relative expression of NLRP3，ASC and Caspase?1 mRNA in PBMCs ±s

Group Health Serofast state t值P值Case 50 50/ /NLRP3 mRNA 1.18±0.19 0.99±0.15 5.53<0.001 ASC mRNA 1.07±0.19 0.89±0.17 5.02<0.001 Caspase?1 mRNA 1.08±0.18 0.90±0.18 4.96<0.001

2.2 梅毒血清固定患者PBMCs中IL?1β及IL?18 mRNA的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，梅毒血清固定患者PBMCs中IL?1β及IL?18mRNA的表達(dá)水平均較健康者低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2），mRNA具體的相對表達(dá)量見表3。

圖2 梅毒血清固定患者PBMCs中IL?1β和IL?18 mRNA的表達(dá)水平Fig.2 Expression of（A）IL?1β and（B）IL?18 mRNA in PBMCs of patients with syphilis Serofast state

2.3 梅毒血清固定患者血清中的IL?1β和IL?18含量統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，梅毒血清固定患者血清 中IL?1β和IL?18的含量均低于健康者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖3），具體表達(dá)量見表4。

表3 PBMCs中IL?1β及IL?18 mRNA的相對表達(dá)量Tab.3 The relative expression of IL?1β and IL?18 mRNA in PBMCs±s

表3 PBMCs中IL?1β及IL?18 mRNA的相對表達(dá)量Tab.3 The relative expression of IL?1β and IL?18 mRNA in PBMCs±s

GroupCaseIL?1β mRNAIL?18 mRNA Health500.91±0.160.88±0.15 Serofast state t值P值50/ /0.66±0.10 9.24<0.001 0.56±0.11 11.87<0.001

圖3 梅毒血清固定患者血清中IL?1β和IL?18的水平Fig.3 IL?1 β and IL?18 in serum of patients with syphilis serofast state

表4 血清中IL?1β及IL?18水平的差異Tab.4 Difference of IL?1β and IL?18 levels in serum±s

表4 血清中IL?1β及IL?18水平的差異Tab.4 Difference of IL?1β and IL?18 levels in serum±s

GroupCaseIL?1β（pg/mL）IL?18（pg/mL）Health images/BZ_84_1404_2704_1566_2755.png3.55±0.90249.58±22.26 Serofast state502.98±0.87193.75±14.82 t值/3.2514.76 P值 /0.0016<0.001

3 討論

早期梅毒患者確診后經(jīng)規(guī)范用驅(qū)梅治療，絕大部分患者的臨床癥狀完全消失，達(dá)到臨床治愈，但有部分患者治療后梅毒血清學(xué)試驗(yàn)在很長時(shí)間內(nèi)不會轉(zhuǎn)陰，表現(xiàn)為梅毒血清固定，已有報(bào)道其發(fā)生率約為15%～44.4%［7-8］。在臨床隨訪過程中這樣的患者有很多，目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，讓醫(yī)患都感到困惑。該病的相關(guān)研究主要在獲得性免疫方面，關(guān)楊等［9-10］認(rèn)為梅毒血清固定患者存在嚴(yán)重的細(xì)胞免疫失衡和免疫抑制，從而使少量的TP逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)的捕獲，導(dǎo)致慢性感染；周平玉［11］則認(rèn)為：梅毒血清固定可能是機(jī)體的一種特殊的免疫狀態(tài)而非TP的持續(xù)存在。為了弄清楚其成因，近來國內(nèi)外的學(xué)者對天然免疫在梅毒血清固定形成中的作用開展了一些研究，并認(rèn)為天然免疫在其中也有重要的作用［12-14］。NLRs家族的NLRP3炎癥小體在調(diào)節(jié)天然和獲得性免疫反應(yīng)時(shí)，因其具有參與免疫和抗微生物等重要作用而備受關(guān)注［15］。已有研究表明NLRP3炎癥小體在梅毒感染免疫中發(fā)揮了重要作用［15］，但目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見關(guān)于NLRP3炎癥小體與梅毒血清固定的形成關(guān)系的報(bào)道。本研究采用病例對照研究的方法，通過qRT?PCR檢測梅毒血清固定患者和健康者PBMCs中NLRP3炎癥小體及細(xì)胞因子，探究NLRP3炎癥小體與梅毒血清固定的形成關(guān)系。

NLRP3炎性小體是NLRs家族成員中被研究最多的受體，它是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合物，由NLRP3、ASC和Pro?caspase?1組成；ASC是NLRP3炎性小體的重要的接頭蛋白，連接上游的NLRP3和下游的Pro?caspase?1，caspase?1是NLRP3炎性小體的效應(yīng)蛋白，是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的一類蛋白酶家族［16］。正常情況下，它以無活性的前體形式存在，其激活依賴于炎性復(fù)合體被外源入侵微生物或者由組織損傷產(chǎn)生的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號，激活后將無活性Pro?caspase?1轉(zhuǎn)變成有活性的caspase?1，進(jìn)而能將無活性的促炎細(xì)胞因子IL?1β和IL?18的前體剪切加工為成熟的IL?1β和IL?18［17］；這兩個(gè)細(xì)胞因子均屬于IL1家族成員，具有多樣生物學(xué)活性，是Th1細(xì)胞生長和分化因子；可以誘導(dǎo)活化B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN?γ；還可以通過上調(diào)Fasl表達(dá)來促進(jìn)NK細(xì)胞毒性；它們作為促炎癥細(xì)胞因子而參與炎癥反應(yīng)，參與機(jī)體的抗感染免疫，及時(shí)有效地清除病原體［18-20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示梅毒血清固定患者PBMCs中的NLRP3、ASC及Caspase?1mRNA表達(dá)明顯低于健康者（P<0.05），提示梅毒血清固定患者體內(nèi)參與天然免疫的NLRP3信號通路存在異常，且該信號通路下游的IL?1β和IL?18的表達(dá)和分泌也均低于健康者（P<0.05），推測此類患者體內(nèi)IL?1β和IL?18的下調(diào)可能會導(dǎo)致NK細(xì)胞、Th1型細(xì)胞因子、T細(xì)胞減少或表達(dá)失衡，導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能抑制，在梅毒感染免疫的過程中機(jī)體對Tp的免疫清除能力降低，形成梅毒血清固定現(xiàn)象。相關(guān)研究顯示梅毒血清固定患者外周血中NK細(xì)胞顯著降低，NK細(xì)胞數(shù)量降低可能是導(dǎo)致該現(xiàn)象形成的重要原因［21］。國內(nèi)外已有的研究表明梅毒血清固定患者存在外周血Th1型細(xì)胞因子、Th17和CD4+T細(xì)胞減少，會導(dǎo)致Th1/Th2型細(xì)胞因子的失衡、Treg/Th17和CD4+T/CD8+T細(xì)胞免疫失衡，致使機(jī)體的梅毒感染免疫應(yīng)答受到抑制，小部分Tp逃過機(jī)體的細(xì)胞免疫，未能被及時(shí)徹底清除，形成梅毒血清固定［10，22-23］。說明NLRP3炎癥小體及下游細(xì)胞因子可能在抗Tp感染免疫的過程中，對正常啟動(dòng)獲得性免疫起到了關(guān)鍵性調(diào)控作用，并參與了梅毒血清固定的形成。

綜上所述，筆者認(rèn)為梅毒血清固定患者存在天然免疫異常，其體內(nèi)的NLRP3炎癥小體表達(dá)下調(diào)可能會影響到信號通路的下游細(xì)胞因子和相關(guān)細(xì)胞參與的梅毒感染免疫反應(yīng)，導(dǎo)致梅毒血清固定形成。但具體免疫網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)細(xì)胞因子間互相調(diào)節(jié)的分子機(jī)制并不是十分清晰，后續(xù)還需就其具體的分子機(jī)制進(jìn)行深入的研究。