都新新 張文琴 任彩佩 張一楠 孫要軍 崔香麗
山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系(太原030001)
結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種惡性腫瘤,在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第三,病死率位居世界第二,其中發(fā)達(dá)國家結(jié)直腸癌發(fā)病率是發(fā)展中國家的三倍。最近十年,結(jié)直腸癌的發(fā)病率及病死率在包括中國在內(nèi)的一些發(fā)展中國家都呈現(xiàn)上升趨勢[1]。早期結(jié)直腸癌可以通過手術(shù)切除治愈,但仍有復(fù)發(fā)的風(fēng)險,而超過50%的病例確診即為晚期,除需要依靠化療藥物外[2],手術(shù)后并發(fā)癥和藥物的不良反應(yīng),也讓術(shù)后患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降[3]。因此尋找低毒又有效的預(yù)防和治療方法很有必要。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種天然的具有抗炎、抗癌、抗氧化作用的多酚類化合物,存在于紅葡萄等多種植物中。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明白藜蘆醇通過食物給予可起到預(yù)防和治療腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的作用,白藜蘆醇可以促進(jìn)結(jié)腸癌上皮細(xì)胞凋亡,但其機(jī)制尚不明確[3]。
BCL?2家族蛋白(包括Bax、Bcl?2等)控制著細(xì)胞凋亡的一個關(guān)鍵點(diǎn),即線粒體外膜通透性,它們能夠通過調(diào)控關(guān)鍵信號分子如細(xì)胞色素c(Cyto?chrome C,Cyt?C)的釋放啟動細(xì)胞凋亡。Cyt?C能促進(jìn)Caspase?3、Caspase?9的活化,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡從而抑制癌癥發(fā)展[4-8]。
近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展與某些基因的表達(dá)異常有關(guān),例如干擾ZEB1表達(dá)可抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移能力,增加細(xì)胞凋亡,抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[9];一種富含AT序列的DNA結(jié)合蛋白(SATB2)是一種核基質(zhì)相關(guān)蛋白,在生物發(fā)育、基因調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用,SATB2的異常調(diào)控已被發(fā)現(xiàn)與各種類型的癌癥高度相關(guān)[10]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇人結(jié)腸上皮細(xì)胞系HCT 116細(xì)胞作為研究對象,探究白藜蘆醇對SATB2蛋白表達(dá)的影響以及促進(jìn)HCT 116細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的機(jī)制。
1.1 材料人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫,白藜蘆醇(純度≥99%)和DMSO購自美國sigma公司,SATB2 siRNA以及SATB2過表達(dá)質(zhì)粒購自銳博生物公司,轉(zhuǎn)染試劑購自QIAGEN公司,Lip2000購自invitrogen公司,SATB2兔單克隆抗體、Bax兔單克隆抗體、Bcl?2兔單克隆抗體、Cytochrome C兔單克隆抗體、Caspase?9兔單克隆抗體購自美國abcam公司,Caspase?3兔多克隆抗體、β?actin鼠單克隆抗體、HRP山羊抗鼠IgG二抗購自武漢proteintech公司,HRP山羊抗兔IgG二抗購自北京全式金公司,脫脂奶粉購于CST公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清以及含1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基,于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HCT 116細(xì)胞,細(xì)胞傳代一次后,取對數(shù)生長階段的細(xì)胞計數(shù),并接種在六孔板上,接種24 h后,分別加入10 mg/mL的白藜蘆醇儲存液0、2、4、6、8 μL(體系中白藜蘆醇終濃度依次為0、8.33、16.67、25、33.33 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞。
1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種在六孔板上。(1)SATB2敲低實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞分為control組,si?SATB2組,Res組,si?SATB2+Res組。si?SATB2組 和si?SATB2+Res組 進(jìn) 行 瞬 時 轉(zhuǎn) 染si?SATB2,24 h后,Res組、si?SATB2+Res組加入10 mg/mL的白藜蘆醇2 μL,十字搖勻放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。(2)SATB2過表達(dá)實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞分為control組,空質(zhì)粒組,SATB2過表達(dá)組,SATB2過表達(dá)+Res組。種板的細(xì)胞過夜貼壁后,用Lip2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后,SATB2過表達(dá)+Res組加入2 μL 10 mg/mL的白藜蘆醇,十字搖勻,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。
1.2.3 Western blot檢測蛋白的表達(dá)收集培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,加入含有1%PMSF的RIPA裂解液,超聲破碎細(xì)胞,離心后吸取上清,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定提取的蛋白濃度,加入5X loading buffer和RIPA制備蛋白上樣液。制備好的蛋白上樣液按照上樣量20 μg進(jìn)行SDS?PAGE凝膠電泳,電泳條件250 V,25 min,電泳結(jié)束后,室溫下半干轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉(0.25 g脫脂奶粉+5 mL TBST)封閉1.5 h,封閉結(jié)束后注入一抗室溫孵育1 h,然后4℃過夜,第2天回收一抗,TBST洗膜后室溫下二抗孵育1 h,再次TBST洗膜,利用ECL顯影液在Chemic?DocTMMP中顯影,利用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0以及Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)均重復(fù)3次以上,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式顯示,兩組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析,多組之間采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 Res上調(diào)HCT 116細(xì)胞SATB2蛋白的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Res能夠上調(diào)小鼠結(jié)腸組織中miR?31的表達(dá),SATB2是miR?31作用的直接靶基因,因此本研究對HCT 116細(xì)胞給予Res 48 h處理。Western blot結(jié)果顯示,Res可上調(diào)HCT 116細(xì)胞中SATB2蛋白的表達(dá)(P<0.01),且隨著Res濃度升高而變化,Res濃度為8.33 μg/mL時,SATB2蛋白表達(dá)量最高,而Res濃度為16.67、25、33.33 μg/mL時,由于藥物劑量增加可能帶來的非特異性細(xì)胞毒性,細(xì)胞出現(xiàn)非正常死亡,HCT116細(xì)胞SATB2蛋白表達(dá)量反而逐漸降低[3](圖1A、2A,表1)。SATB2過表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)中,其表達(dá)發(fā)生了相應(yīng)的增高和下降,說明實(shí)驗(yàn)方法成功。給予Res 8.33 μg/mL處理24 h后,SATB2蛋白比對照組顯著升高(P<0.05,圖1B、2B,表2)。
2.2 Res可逆轉(zhuǎn)SATB2抑制引起的Bax/Bcl?2比值下降為了探究SATB2對HCT 116細(xì)胞凋亡水平的作用以及Res對這種作用的影響,使用si?SATB2對細(xì)胞進(jìn)行干擾,同時給予Res處理。Western blot結(jié)果顯示,與Control組相比較,用SATB2?siRNA進(jìn)行干擾后,Bcl?2/Bax比值顯著升高(P<0.05);單獨(dú)Res處理組的Bcl?2/Bax比值則顯著下降(P<0.05);而SATB2?siRNA進(jìn)行干擾并給予Res處理組的Bcl?2/Bax比值則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明抑制SATB2基因表達(dá)可抑制Bax表達(dá),促進(jìn)Bcl?2表達(dá),導(dǎo)致Bcl?2/Bax比值上升,減少腸上皮細(xì)胞凋亡,而Res可以逆轉(zhuǎn)此作用。見圖2、表3。
圖1 HCT 116細(xì)胞SATB2蛋白的表達(dá)Fig.1 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells
圖2 不同濃度Res對SATB2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effects of Res concentration on SATB2 expression
表1 不同濃度Res作用后SATB2表達(dá)Tab.1 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after treat with different concentrations of resveratrol±s
表1 不同濃度Res作用后SATB2表達(dá)Tab.1 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after treat with different concentrations of resveratrol±s
注:與Control組比較,**P<0.01;Res2組比較,##P<0.01
組別 例數(shù)SATB2 Control3 0.168 8±0.074 9 Res23 0.500 7±0.029 8**Res4 Res6 Res83 3 3 0.235 9±0.013 2##0.194 6±0,055 7##0.125 5±0.034 3##
表2 不同處理對SATB2表達(dá)的影響Tab.2 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression,knock?down in presence of resveratrol x±s
將SATB2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HCT116細(xì)胞后,同時給予Res處理,Western blot結(jié)果顯示,與Control組相比較,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的Bcl?2/Bax比值并無顯著差異;轉(zhuǎn)染SATB2過表達(dá)質(zhì)粒組Bcl?2/Bax比值下降(P<0.05);而轉(zhuǎn)染SATB2過表達(dá)質(zhì)粒同時給予Res處理組的Bcl?2/Bax比值下降更為顯著(P<0.05)。表明SATB2能夠促進(jìn)Bax表達(dá)并且抑制Bcl?2表達(dá),導(dǎo)致Bcl?2/Bax比值下降,Res則能夠加強(qiáng)這種作用,與Res增加SATB表達(dá)結(jié)果一致。見圖3,表3。
圖3 敲低SATB2同時給予Res處理后的Bax和Bcl?2蛋白表達(dá)Fig.3 Relative expression of Bax and Bcl?2 in HCT 116 cells after SATB2 knock?down in presence of resveratrol
圖4 過表達(dá)SATB2同時給予Res處理后的Bax和Bcl?2蛋白表達(dá)Fig.4 Relative expression of Bax and Bcl?2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol
表3 敲低或過表達(dá)SATB2同時給予Res處理后Bcl?2/Bax比值的變化Tab.3 Relative expression of Bcl?2/Bax Ratio in HCT 116 cells after SATB2 overexpression,knock?down in presence of resveratrol
2.3 Res激活Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路促進(jìn)HCT 116細(xì)胞凋亡為了研究Res通過SATB2調(diào)控HCT 116細(xì)胞凋亡的機(jī)制,采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染SATB2?siRNA以及SATB2過表達(dá)質(zhì)粒同時給予Res處理的相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與Control組相比較,轉(zhuǎn)染SATB2?siRNA后,HCT 116細(xì)胞的細(xì)胞色素C(Cyt?C)表達(dá)水平下降(P<0.01);單獨(dú)給予Res處理組的Cyt?C表達(dá)水平則顯著升高(P<0.05);而轉(zhuǎn)染SATB2?siRNA同時給予Res處理組的Cyt?C表達(dá)水平則與Control組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖5A,表4)。此外檢測位于細(xì)胞凋亡通路下游的Caspase?3、Caspase?9蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示,與Control組相比較,轉(zhuǎn)染SATB2?siRNA后,細(xì)胞的Caspase?3、Caspase?9蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05);單獨(dú)給予Res處理組的Caspase?3、Caspase?9蛋白表達(dá)水平則顯著升高(P<0.05);而轉(zhuǎn)染SATB2?siRNA同時給予Res處理 組的Caspase?3、Caspase?9蛋 白 表達(dá)水平則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖5B、C,表4)。以上結(jié)果表明抑制SATB2基因表達(dá)可抑制Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白的表達(dá)、抑制HCT 116細(xì)胞凋亡,而Res可以逆轉(zhuǎn)此作用。
表4 敲低SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達(dá)Tab.4 Relative expression of Cyt?C,Caspase?3,Caspase?9 in HCT 116 cells after SATB2 knock?down in presence of resveratrol
研究各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平在SATB2過表達(dá)情況下的差異Western blot結(jié)果顯示,與Control組相比較,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義;轉(zhuǎn)染SATB2過表達(dá)質(zhì)粒組Cyt?C(P<0.01)、Caspase?3(P<0.05)、Cas?pase?9(P<0.05)表達(dá)水平明顯升高;而轉(zhuǎn)染SATB2過表達(dá)質(zhì)粒同時給予Res處理組的Cyt?C(P<0.05)、Caspase?3(P<0.05)、Caspase?9(P<0.01)表達(dá)水平升高更為顯著。表明SATB2能夠促進(jìn)Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白的表達(dá),Res則可加強(qiáng)這種作用。見圖6,表5。
圖5 敲低SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達(dá)Fig.5 Relative expression of Cyt?C,Caspase?3,Caspase?9 in HCT 116 cells after SATB2 knock?downin presence of resveratrol
圖6 過表達(dá)SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達(dá)Fig.6 Relative expression of Cyt?C,Caspase?3,Caspase?9 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol
白藜蘆醇是一種在紅葡萄果皮中含量豐富的植物天然合成的非類黃酮多酚類物質(zhì),同時也是一種植物抗毒素,具有抗氧化特性[11]。早在21世紀(jì)初,就有研究報道白藜蘆醇對心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用,有助于控制動脈粥樣硬化、心臟病、關(guān)節(jié)炎和自身免疫性疾病。臨床試驗(yàn)證明,白藜蘆醇在胃腸道中會被迅速吸收,繼而迅速代謝為葡萄糖醛酸苷和硫酸鹽,導(dǎo)致組織和血漿中白藜蘆醇濃度較低,但在對結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn),低劑量的白藜蘆醇對結(jié)直腸癌仍有很好的效果[11-13]。白藜蘆醇能夠減輕結(jié)腸炎小鼠的炎癥癥狀,下調(diào)相關(guān)炎癥標(biāo)志物的表達(dá)[14]。
表5 過表達(dá)SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達(dá)Tab.5 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol ±s
表5 過表達(dá)SATB2同時給予Res處理后的Cyt?C、Caspase?3、Caspase?9蛋白表達(dá)Tab.5 Relative expression of SATB2 in HCT 116 cells after SATB2 overexpression in presence of resveratrol ±s
注:與Control組比較,*P<0.05,**P<0.01
組別Control pEXP?RB?Mam pEXP?RB?Mam?SATB2 pEXP?RB?Mam?SATB2+Res例數(shù)3 3 3 3 Cyt?C 0.472 4±0.098 5 0.485 1±0.070 9 0.973 2±0.103 1**1.352 6±0.431 6*例數(shù)3 3 3 3 Caspase?3 0.190 8±0.005 7 0.199 1±0.015 6 0.337 4±0.081 2*0.363 5±0.097 0*例數(shù)6 6 6 6 Caspase?9 0.396 7±0.006 5 0.418 4±0.006 5 0.704 7±0.120 1*0.793 6±0.099 9**
惡性腫瘤的發(fā)生具有異質(zhì)性,炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制都可能參與了其發(fā)生和發(fā)展。而白藜蘆醇預(yù)防和治療動物腸炎相關(guān)腸癌的作用機(jī)制包括抗氧化、抗炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗血管生成等作用[15]。有研究報道白藜蘆醇單獨(dú)或聯(lián)合用藥也能有效抑制HCT 116細(xì)胞中NF?κB信號通路,從而抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移達(dá)到抗結(jié)直腸癌的作用[16]。白藜蘆醇通過多種途徑抑制腫瘤,例如肖忠盛等[17]證實(shí)白藜蘆醇通過下調(diào)mTOR信號通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖;白藜蘆醇可通過線粒體途徑促進(jìn)人體鱗癌細(xì)胞凋亡,上調(diào)促凋亡蛋白Bax,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl?2,從而使細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞質(zhì)當(dāng)中,Caspase?9、Casapase?3被激活[18-20],可有效抑制小鼠結(jié)腸腫瘤的產(chǎn)生[21]。本研究結(jié)果顯示經(jīng)白藜蘆醇處理的HCT 116細(xì)胞,細(xì)胞色素c的表達(dá)量明顯上升,上游的Bax、Bcl?2蛋白以及下游的Caspase?3、9蛋白都相應(yīng)發(fā)生變化,提示白藜蘆醇促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡的作用與Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路的激活有關(guān)。
作為一種潛在的抗腫瘤藥物,白藜蘆醇抗腫瘤作用的分子機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。SATB2在許多類型的癌癥中都有異常轉(zhuǎn)錄,并且在不同的類型的細(xì)胞中,SATB2既可能是腫瘤抑制因子也可能是腫瘤促進(jìn)因子。同時,SATB2也受很多分子的調(diào)控,如miR?31和miR?34a[10,22-24]。本研究結(jié)果證實(shí)白藜蘆醇對HCT 116細(xì)胞SATB2蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。在敲低和過表達(dá)SATB2基因的情況下,觀察白藜蘆醇對HCT 116細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑凋亡作用的影響。結(jié)果顯示敲低SATB2后,HCT 116細(xì)胞中Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路各蛋白表達(dá)量下降,而白藜蘆醇可以一定程度的逆轉(zhuǎn)此作用;過表達(dá)SATB后,Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路蛋白表達(dá)上調(diào),白藜蘆醇則能加強(qiáng)這種作用;表明白藜蘆醇促進(jìn)Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路的作用與上調(diào)SATB2蛋白的表達(dá)有關(guān)。
綜上所述,本研究證實(shí)了白藜蘆醇能夠通過Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路促進(jìn)HCT 116細(xì)胞凋亡,同時也能上調(diào)SATB2的表達(dá)。過表達(dá)SATB2基因能夠上調(diào)HCT 116細(xì)胞中Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9凋亡通路,表明白藜蘆醇促進(jìn)HCT 116細(xì)胞經(jīng)Bax/Bcl?2/Cyt?C/Caspase3、9途徑凋亡的作用與上調(diào)SATB2表達(dá)有關(guān),為白藜蘆醇抗結(jié)直腸癌機(jī)制的研究提供了新的思路,但關(guān)于白藜蘆醇如何作用于SATB2以及SATB2影響凋亡通路的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。