Dock2通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性和抗原特異性IgG抗體的產(chǎn)生來控制腸道檸檬酸桿菌感染

孟凡 陳峻 劉雨霞 謝璐 李子俊 劉志平，

1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（江西贛州341000）；2贛南醫(yī)學(xué)院2019級研究生（江西贛州341000），3贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室炎癥與免疫中心（江西贛州341000）；4贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（江西贛州341000）；5南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床分委會，廣東省人民醫(yī)院（廣州510000）

細(xì)胞分裂貢獻(xiàn)者2（Dedicator of cytokinesis 2，Dock2）是鳥嘌呤核苷酸交換因子家族的成員，它可以激活小G蛋白Rac，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組［1-2］。Dock2似乎僅在造血細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)［3］。Dock2對于免疫細(xì)胞（包括T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞）的遷移至關(guān)重要［4-6］。Dock2?Rac通過影響突觸的形成來控制NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性［7］。Dock2還顯示出通過下調(diào)IL?4Rα表面表達(dá)來抑制Th2譜系發(fā)育，從而抑制了由利什曼原蟲感染引起的足墊腫脹［8］。Dock2可能是控制移植排斥和阿爾茨海默病的分子靶標(biāo)［9-10］。此外，實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，Dock2在抵抗鼠類檸檬酸桿菌（citrobacter rodentium）感染引起的早期結(jié)腸炎中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［11］。

檸檬酸桿菌感染是一種常用于研究結(jié)腸炎形成的模型［12-13］。檸檬酸桿菌是腸道桿狀菌革蘭氏陰性菌，是黏附/擦拭（attaching and effacing，A/E）病原體家族的成員［14］，因此也可用于研究臨床上重要的人類病原體（例如引起大量腹瀉的腸病原性和腸出血性大腸桿菌）的發(fā)病機(jī)制［15-16］。前期研究表明，Dock2-/-小鼠對檸檬酸桿菌感染比野生型（Wild?type，WT）小鼠更為易感。在感染后第14天，Dock2-/-小鼠具有更嚴(yán)重的死亡率、體質(zhì)量損失、細(xì)菌負(fù)荷、結(jié)腸縮短和組織學(xué)損害等結(jié)腸炎相關(guān)指標(biāo)。進(jìn)一步研究表明Dock2的缺乏并不會導(dǎo)致感染早期保護(hù)性促炎細(xì)胞因子和抗菌肽的產(chǎn)生減少。在感染后14 d Dock2-/-小鼠腸道中的巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞從粘膜下層遷移至黏膜層存在缺陷，這可能直接影響宿主對檸檬酸桿菌感染的易感性［11］。但是，在宿主對抗檸檬酸桿菌感染的適應(yīng)性免疫中Dock2的功能仍然未知。研究檸檬酸桿菌感染后期淋巴細(xì)胞變化與細(xì)菌清除率之間的關(guān)系，并進(jìn)一步探索可能影響宿主對檸檬酸桿菌敏感性的其他因素，將對結(jié)腸炎的治療提供重要思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Dock2-/-小鼠由日本九州大學(xué)Yo?shinori Fukui博士提供。TCRa-/-小鼠購自The Jack?son Laboratory。C57BL/6小鼠用作WT對照。所有動(dòng)物程序均遵循贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物使用和倫理委員會批準(zhǔn)的方案。

1.2 檸檬酸桿菌感染檸檬酸桿菌購于ATCC（ATCC＃51459。挑取檸檬酸桿菌置于LB肉湯中37℃搖震蕩培養(yǎng)8～9 h。小鼠感染前禁食8 h，然后以1×1010CFU/小鼠的濃度通過灌胃方式感染。為確定感染情況，將糞便，脾臟，腸系淋巴結(jié)（mesenter?ic lymph nodes，MLN）和肝臟勻漿，用1×PBS梯度稀釋，種板于麥康凱瓊脂平板上，37℃孵育24 h，計(jì)算各載菌量。

1.3 組織學(xué)分析取結(jié)腸組織固定、包埋、切片，H/E染色觀察病理學(xué)變化；CD3、IgA、F4/80和Gr?1抗體分別對T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察結(jié)腸免疫細(xì)胞浸潤。

1.4 促炎細(xì)胞因子分析利用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液將結(jié)腸組織勻漿，ELISA檢測結(jié)腸組織和血清中的細(xì)胞因子IFN?γ，TNF?α，KC，MCP?1，MIP?2，IL?6和IL?17的蛋白表達(dá)水平。

1.5 抗原特異Ig抗體分析利用ELISA法檢測特異于檸檬酸桿菌的血清抗體產(chǎn)生［17］。將加熱滅活的檸檬酸桿菌包被在ELISA板上，封閉后加入血清樣本，室溫下孵育2 h。檢測血清中IgM，IgG，IgG1，IgG2b，IgG2c和IgG3的含量，用3，3′，5，5′′?四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯影并讀取450 nm的OD值。

1.6 結(jié)腸固有層淋巴細(xì)胞（lamina propria lym?phocytes，LPL）的分離分離結(jié)腸LPL的方法如前所述［18］。用預(yù)冷PBS洗滌結(jié)腸并切成1 cm的小塊。然后將結(jié)腸與5 mmol/L EDTA和10 mmol/L HEPES在37℃孵育10 min，放入含有DNase I和膠原酶D的1640培養(yǎng)基中于37℃消化1 h。

1.7 流式細(xì)胞儀分析取小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液。用CD11b、CD11c、Gr?1、CD4、CD19和CD8進(jìn)行染色。利用不同顏色的抗CD4用作補(bǔ)償對照。染色后，使用FACSCalibur（BD）上機(jī)，F(xiàn)lowJo 10軟件分析細(xì)胞。

1.8 T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)取WT和Dock2-/-小鼠的脾臟，碾磨成單細(xì)胞，通過磁珠分選富集分離出T淋巴細(xì)胞（CD3+），眼靜脈注射入TCRa-/-小鼠（107/每個(gè)小鼠），分別用作TCRa-/-+WT組和TCRa-/-+Dock2-/-組。10 d后，TCRa-/-+WT和TCRa-/-+Dock2-/-小鼠分別灌胃感染1×1010CFU的檸檬酸桿菌，之后檢測體重。在感染后14 d，處死小鼠，測量結(jié)腸長度和重量，取結(jié)腸做組織切片并HE染色。收集血清，通過ELISA檢測的IgM，IgG，IgG1，IgG2b，IgG2c，IgG3和IgA3的水平。

1.9 血清抗體轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)對Dock2-/-小鼠進(jìn)行C.rodentium感染。在感染后第3、4和5天，靜脈注射150 μL未感染的WT小鼠血清（D0血清）或者感染21 d的WT小鼠血清（D21血清）。檢測Dock2-/-+D0血清和Dock2-/-+D21血清小鼠在感染后的生存率。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）。使用studentt檢驗(yàn)或單因素方差分析計(jì)算所有P值。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dock2在檸檬酸桿菌感染后期宿主清除致病菌中起重要作用與WT小鼠相比，Dock2-/-小鼠的體質(zhì)量下降明顯（圖1A）、結(jié)腸更短（圖1C）。測量了糞便和結(jié)腸組織中的病原體負(fù)擔(dān)，發(fā)現(xiàn)在感染后21 d，WT小鼠清除了腸道所有的檸檬酸桿菌但Dock2-/-小鼠糞便中卻有107至108/g的細(xì)菌負(fù)荷（圖1B）。感染后21 d，收集肝臟，脾臟和MLN，分析各組織的活菌負(fù)荷。結(jié)果表明，感染后第21天Dock2-/-小鼠具有更高的檸檬酸桿菌負(fù)荷，并且小鼠結(jié)腸，脾臟，MLN和肝臟中細(xì)菌負(fù)荷的趨勢相似（圖1D?G）。組織學(xué)分析還顯示，在感染后14 d和21 d，Dock2-/-小鼠比WT小鼠具有更嚴(yán)重的組織學(xué)病變和更高的隱窩高度（圖1H?J）。

2.2 感染晚期Dock2-/-小鼠中促炎細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生感染21 d后，Dock2-/-小鼠的結(jié)腸組織和血清中細(xì)胞因子IFN?γ，TNF?α，KC，MCP?1，IL?6和IL?17的水平均顯著升高（圖1A?B；D?I；K?N）。MIP?2水平在Dock2-/-小鼠結(jié)腸組織中顯著升高（圖2C），但在血清中無明顯變化（圖2J）。

2.3 檸檬酸桿菌感染后期Dock2-/-小鼠的炎癥細(xì)胞浸潤在檸檬酸桿菌感染21 d后，與WT相比，Dock2-/-小鼠結(jié)腸中的巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤更多（圖2A）。利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，經(jīng)檸檬酸桿菌感 染21 d后，Dock2?/?小 鼠 的 結(jié) 腸和脾臟中樹突狀細(xì)胞（CD11b+CD11c+），髓樣細(xì)胞（CD11b+）和嗜中性粒細(xì)胞（CD11b+Gr?1+）細(xì)胞數(shù)比例更高（圖2B，C）。Ki67的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，Dock2-/-小鼠表現(xiàn)出更多的腸道上皮細(xì)胞增殖（圖2A）。

圖1 Dock2在檸檬酸桿菌感染后期宿主清除致病菌中起重要作用Fig.1 Dock2 was required for host bacterial clearance after C.rodentium infection

2.4 Dock2-/-小鼠在感染檸檬酸桿菌期間有T細(xì)胞缺陷Dock2-/-小鼠在感染前及感染后第14天，第21天的脾臟CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)量均顯著降低（圖2A?B）。除了CD8+CD69+T細(xì)胞（圖2H），感染后21 d Dock2-/-小鼠的脾臟中激活T細(xì)胞的數(shù)量少于WT小鼠（圖2C?G）。

圖2 檸檬酸桿菌感染后WT和Dock2-/-小鼠結(jié)腸中的炎癥細(xì)胞浸潤Fig.2 Inflammatory cell infiltration in Dock2-/-mice after C.rodentium infection

造血祖細(xì)胞在胸腺發(fā)育為成熟的T細(xì)胞。感染前，WT與Dock2-/-小鼠的胸腺大小相似，但Dock2-/-小鼠的胸腺中CD4+和CD8+細(xì)胞的百分比更低（圖3A?B）。感染14 d后，Dock2-/-小鼠的胸腺明顯縮小且細(xì)胞數(shù)較WT更少（圖3A?C）。此時(shí)，胸腺細(xì)胞的組成急劇變化。與WT小鼠相比，Dock2-/-小鼠的CD4+和CD8+細(xì)胞的百分比略顯著降低，但CD4+CD8-，CD4-CD8+和CD4-CD8-細(xì)胞的百分率有所升高（圖3D?G）。在CD4-CD8-雙陰性（double?negative，DN）細(xì)胞中，Dock2-/-小鼠的DN第4階段（DN4）百分比顯著高于WT小鼠（圖3H），表明Dock2-/-胸腺細(xì)胞再生的缺陷可能始于DN4。

2.5 感染了檸檬酸桿菌的Dock2-/-小鼠相對對照有更少的B細(xì)胞和抗原特異性IgG抗體的產(chǎn)生感染后第14天，在WT結(jié)腸中可見到許多B細(xì)胞，但是，Dock2-/-小鼠的結(jié)腸中幾乎沒有B細(xì)胞（圖4A?B），同時(shí)與WT相比Dock2-/-小鼠脾臟中的B細(xì)胞數(shù)量也明顯更低（圖4C）。這表明Dock2-/-小鼠感染部位的B細(xì)胞數(shù)量較少。

本研究檢測了檸檬酸桿菌特異性血清抗體的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)在感染后第14天及21天，Dock2-/-小鼠的血清中IgG水平均顯著低于WT小鼠，而IgM的水平則無明顯區(qū)別（圖4D?E）。盡管在感染后第21天，Dock2-/-小鼠有更嚴(yán)重的細(xì)菌負(fù)擔(dān)（圖1 B，D），但I(xiàn)gG，IgG1，IgG2b，IgG2c和IgG3的水平仍比WT小鼠低（圖4E?I）。

圖3 檸檬酸桿菌感染后WT和Dock2-/-小鼠胸腺細(xì)胞概況Fig.3 Thymocyte profiles of WT and Dock2-/-mice after C.rodentium infection

2.6 血清轉(zhuǎn)移和T細(xì)胞轉(zhuǎn)移對檸檬酸桿菌誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有抑制作用Dock2-/-小鼠中的T細(xì)胞在檸檬酸桿菌感染過程中存在缺陷（圖4A、B）。為了確定對Dock2-/-小鼠補(bǔ)充T細(xì)胞是否可以抑制檸檬酸桿菌誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，分別將WT和Dock2-/-小鼠的T細(xì)胞注射到TCRa-/-小鼠體內(nèi)。在感染檸檬酸桿菌14 d后，TCRa-/-+Dock2-/-小鼠比TCRa-/-+WT小鼠的體質(zhì)量減輕更為嚴(yán)重（圖5A）。結(jié)腸縮短也更嚴(yán)重（圖5B），且具有更重的結(jié)腸重量（圖5C）和更高的組織學(xué)損傷評分（圖5D）。為確定補(bǔ)充性T細(xì)胞是否通過改變TCRa-/-小鼠血清中抗體的含量來抵抗檸檬酸桿菌感染所致結(jié)腸炎，測試了TCRa-/-+WT和TCRa-/-+Dock2-/-小鼠的IgG，IgG1，IgG2b，IgG2c，IgG3，IgA和IgM的水平。TCRa-/-+Dock2-/-小鼠中的IgG，IgG1，IgG2b，和IgG2c的水平低于TCRa?/?+WT小鼠的水平（圖5E，補(bǔ)圖3A?C）。IgG3，IgA和IgM的水平無顯著差異（補(bǔ)圖3D?F）。補(bǔ)充的T細(xì)胞可能部分通過增加IgG水平抑制結(jié)腸炎。

為了測試補(bǔ)充WT小鼠血清中的抗體是否可以改變Dock2-/-小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，將未感染的WT小鼠的血清（Dock2-/-+D0血清）和檸檬酸桿菌感染21 d后的WT小鼠血清（Dock2-/-+21 d血清），分別注入Dock2-/-小鼠體內(nèi)。與Dock2-/-+D0血清小鼠相比，Dock2-/-+21 d血清小鼠的存活率明顯提高（圖5F），表明檸檬酸桿菌感染后WT小鼠血清中的抗體具有緩解Dock2-/-小鼠結(jié)腸炎的作用。

圖4 感染了檸檬酸桿菌的Dock2-/-小鼠體內(nèi)B細(xì)胞數(shù)量和抗體產(chǎn)生減少Fig.4 The decrease in B cells and antibody production in Dock2-/-mice infected with C.rodentium infection

3 討論

先前研究表明，Dock2-/-小鼠在檸檬酸桿菌感染后第14天表現(xiàn)出感染體征［11］。但是，感染后期Dock2在宿主清除腸道病原菌中的作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，Dock2參與到檸檬酸桿菌感染后宿主清除細(xì)菌中。檸檬酸桿菌感染第21天，Dock2-/-小鼠產(chǎn)生了更多的促炎細(xì)胞因子，表現(xiàn)出更高的死亡率。腸道也有更強(qiáng)的巨噬細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞浸潤。說明Dock2-/-小鼠的嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以到達(dá)細(xì)菌病原體入侵的位置。但是，Dock2-/-小鼠在機(jī)體清除病原菌的過程中仍然存在嚴(yán)重缺陷。Dock2缺失引起的在檸檬酸桿菌感染中的細(xì)菌清除障礙的機(jī)制可能與Dock2-/-小鼠的T細(xì)胞缺陷、B細(xì)胞數(shù)量減少和特異性IgG抗體減少有關(guān)。且轉(zhuǎn)移含Dock2的T細(xì)胞和血清對檸檬酸桿菌誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有保護(hù)作用。

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel diseases，IBDs）包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，是一種病因不明的腸道炎癥，具有慢性、非特異性和復(fù)發(fā)性等特征［19］。IBDs是當(dāng)前世界的主要健康問題之一，發(fā)病率居高不下［20］。在過去的20年中，IBD的患病率在中國迅速增加，已成為中國常見的消化系統(tǒng)疾病之一［21］。IBD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，可能與遺傳缺陷，免疫應(yīng)答功能障礙和腸道菌群紊亂有關(guān)［19，22］。有研究表明，IBD的發(fā)病可能與某些腸道細(xì)菌的過度生長和腸上皮細(xì)胞中的宿主基因缺陷有關(guān)［23］。然而，IBD的發(fā)病機(jī)理目前尚不明確。本研究的結(jié)果提示，Dock2可能參與對結(jié)腸炎或者IBD的調(diào)控。

圖5 T細(xì)胞和血清轉(zhuǎn)移對結(jié)腸炎具有抑制作用Fig.5 T cell and serum transfer has inhibitory effects on colitis

對食管腺癌和大腸癌患者的癌組織進(jìn)行全基因測序鑒定發(fā)現(xiàn)DOCK2基因發(fā)生高頻突變［24-25］，這提示Dock2可能在維持粘膜表面穩(wěn)態(tài)中起重要作用。在5例合并免疫缺陷疾病的嬰兒患者中也發(fā)現(xiàn)了DOCK2突變。在趨化因子刺激下，T細(xì)胞中的Rac1活化受到抑制，且突變個(gè)體患有T細(xì)胞，B細(xì)胞和NK細(xì)胞的遷移缺陷，并且NK細(xì)胞的變性也受到影響［26］。這些研究的結(jié)果和本研究結(jié)果一致，提示調(diào)控Dock2的表達(dá)對于研究機(jī)體腸道功能及抗感染有重要作用。

最近有研究表明，抑制Dock2可能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化，并且Dock2可能是治療內(nèi)毒素血癥相關(guān)性急性肺損傷的新靶標(biāo)［27］。利用shR?NA下調(diào)Dock2的表達(dá)可導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖減弱，該機(jī)制可能與Dock2介導(dǎo)的Rac/ERK有關(guān)［28］。在前列腺癌細(xì)胞的增殖中，Dock2通過介導(dǎo)CXCL13/ERK/Akt信號通路起重要作用，這可能會成為治療前列腺癌的新靶標(biāo)［29］。本研究中確定了Dock2是宿主對抗檸檬酸桿菌感染的重要因子，并且對于腸道病原體感染后期的細(xì)菌清除至關(guān)重要，這與T細(xì)胞活性和抗原特異性IgG抗體產(chǎn)生的缺陷密切相關(guān)。但是Dock2-/-小鼠對檸檬酸桿菌感染的高敏感性是否與CXCL13/ERK/Akt信號通路激活或者腸道相關(guān)菌群失調(diào)密切相關(guān)，目前尚不清楚。下一步研究的方向需要確定Dock2在檸檬酸桿菌感染后炎癥激活的信號通路的作用及維持腸道微生物群平衡中的作用機(jī)制。