糖蛋白絲甘蛋白聚糖促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的化療耐藥和轉(zhuǎn)移

鄧曉芳 彭俊琴 陳歷排 盧斌貴

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1內(nèi)科二區(qū)，2醫(yī)學(xué)影像科，3婦瘤科（廣州510095）

卵巢癌是繼宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌之后發(fā)生率居第三位的婦科惡性腫瘤，其死亡率一直居女性生殖道惡性腫瘤的首位［1］。早期卵巢癌經(jīng)手術(shù)及化療后，其5年生存率達(dá)80%～95%，而中晚期卵巢癌僅為20%～30%。癌細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合化療是目前中晚期卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。盡管治療手段不斷發(fā)展，但中晚期卵巢癌患者的預(yù)后和死亡率仍未得到明顯改善，原因在于化療耐藥和轉(zhuǎn)移［2］。

糖蛋白絲甘蛋白聚糖（Serglycin）是一種小分子蛋白多糖，在造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中最早發(fā)現(xiàn)，參與炎癥介質(zhì)的儲(chǔ)存和分泌［3-4］。最近有報(bào)道指出Serglycin參與多種腫瘤細(xì)胞的耐藥和轉(zhuǎn)移［5-6］，但Serglycin在卵巢癌中的作用鮮有報(bào)道。本研究擬在人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株中，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定干擾Serglycin低表達(dá)的細(xì)胞株，探究Serglycin與卵巢癌耐藥及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為闡明卵巢癌耐藥及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和改善晚期卵巢癌的臨床治療效果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3購(gòu)于美國(guó)ATCC。培養(yǎng)基為RPMI?1640，含10%胎牛血清，將細(xì)胞置于5%CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Serglycin基因的shRNA干擾慢病毒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量PCR試劑購(gòu)于美國(guó)Fermentas公司。由華大基因合成引物。Serglycin、β?actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz。Ecadherin、ZEB1/2抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signal?ling公司。ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。順鉑（cDDP）購(gòu)置美國(guó)Sigma公司。Transwell小室購(gòu)置美國(guó)Corning公司。

1.2 構(gòu)建敲低Serglycin穩(wěn)定細(xì)胞系利用shRNA干擾技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定敲低Serglycin基因的兩株細(xì)胞系：SKOV3/shSerglycin1#和SKOV3/shSerglycin2#，及對(duì)照細(xì)胞株：SKOV3/shCon。具體為接種適量SKOV3細(xì)胞于24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)60%～80%時(shí)將1 mL的shSerglycin1#、shSerglycin2#慢病毒液和陰性對(duì)照的shCon分別加入24孔板中的SKOV3細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱中感染48 h，后將細(xì)胞轉(zhuǎn)至6孔板，并用2 μg/μL的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Serglycin的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3/shSerglycin1#、SKOV3/shSergly?cin2#和空白對(duì)照組SKOV3/shCon細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。Sergly?cin的引物序列是：FP：5′?TCCAACAAGATCCCCC?GTCT?3′，RF：5′?TTCCGTTAGGAAGCCACTCC?3′。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）用RIPA裂解液裂解上皮卵巢癌細(xì)胞，BCA法檢測(cè)蛋白含量，于100℃蛋白變性。用10%SDS?PAGE膠進(jìn)行蛋白垂直電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃搖床孵育抗體過(guò)夜，TBST溶液洗膜3次，用HPR標(biāo)記二抗，然后在室溫下孵育條帶1 h，在暗室內(nèi)用ECL發(fā)光試劑顯影。

1.5 卵巢癌細(xì)胞SKOV3藥物敏感性檢測(cè)取3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，24 h后依次加入梯度濃度（0、3、6、9、12、15 μmol/L）的含化療藥物順鉑（cDDP）的RPMI?1640培養(yǎng)基?；熥饔?8 h后，每孔加入20 μL MTS試劑，37℃繼續(xù)孵育2.5 h，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。計(jì)算各組細(xì)胞的存活率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.6 體外腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)用無(wú)血清的培養(yǎng)基制備1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，吸取0.5 mL的細(xì)胞懸液于鋪膠Transwell小室內(nèi)，置于恒溫箱中孵育36 h，然后吸掉小室里的液體，小心擦拭掉上室面的細(xì)胞，用PBS洗滌3次，用甲醇固定遷移到膜下室面的細(xì)胞30 min，然后用1%結(jié)晶紫染色10 min，漂洗，晾干后在顯微鏡下觀察遷移后的細(xì)胞數(shù)量并拍照記錄結(jié)果。

1.7 生物信息學(xué)分析利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer?pku.cn/index.html）和在線預(yù)后分析軟件（http：//kmplot.com），分析Serglycin在卵巢癌中的表達(dá)及與卵巢癌患者的預(yù)后關(guān)系。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敲低Serglycin增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的化療敏感性qRT?PCR及Western blot結(jié)果顯示：shSerglycin1#和shSerglycin2# mRNA和蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，而shSerglycin1# mRNA和蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量均低于shSerglycin2#（圖1A、B）；MTS法檢測(cè)結(jié)果顯示：相對(duì)于對(duì)照組，不同梯度濃度化療藥物處理的shSerglycin1#卵巢癌細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組（圖1C），表明敲低Serglycin可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的化療敏感性。

圖1 敲低Serglycin與shCont卵巢癌細(xì)胞的化療敏感性比較Fig.1 Chemotherapy sensitivity of Serglycin knockdown versus control ovarian cancer cells

2.2 敲低Serglycin抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低Serglycin基因的SKOV3細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為（42±4.3）個(gè)/視野，而對(duì)照組的穿過(guò)基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)是（141.3±5.6）個(gè)/視野（圖2A）。與對(duì)照組相比，敲低組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明Serglycin可明顯促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移（圖2B）。

圖2 敲低Serglycin卵巢癌細(xì)胞與shCont侵襲轉(zhuǎn)移力的比較Fig.2 Knock down Serglycin inhibit invasion and metastasis of ovarian cancer cells

2.3 Serglycin促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的EMT的改變Western blot檢測(cè)顯示，相對(duì)于對(duì)照組shCont，shSer?glycin1#SKOV3細(xì)胞系間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin蛋白表達(dá)降低，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物Ncadherin蛋白表達(dá)升高，同時(shí)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB2表達(dá)明顯降低（圖3A）。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織標(biāo)本中Serglycin表達(dá)與CDH2（編碼Ncadherin蛋白）表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.099，P=0.041），與VIM表達(dá)（編碼Vimentin蛋白）呈正相關(guān)（r=0.19，P<0.001），而且與ZEB2表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.6，P<0.001，圖3B）。

圖3 Serglycin干擾后卵巢癌細(xì)胞的EMT的改變Fig.3 EMT changes in ovarian cancer cells after Serglycin interference

2.4 Serglycin可作為卵巢癌的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌數(shù)據(jù)集，在426例卵巢癌組織中，Serglycin表達(dá)顯著高于正常卵巢組織（P<0.05）。KMPLOT進(jìn)一步分析在卵巢癌患者中Serglycin與預(yù)后的關(guān)系，Serglycin表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，Serglycin高表達(dá)的患者總生存期較差（平均危險(xiǎn)指數(shù)：HR=1.26，P<0.001），提示Serglycin可作為卵巢癌一個(gè)潛在的治療和預(yù)后靶點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

3 討論

圖4 Serglycin在卵巢癌的表達(dá)和預(yù)后的生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatics analysis of Serglycin expression and prognosis in ovarian cancer

Serglycin是一種主要分布在細(xì)胞內(nèi)的小分子量糖蛋白，也可以分泌和整合到細(xì)胞外基質(zhì)中。其由核心蛋白和附著在其上的多種粘多糖（GAG）組成，根據(jù)結(jié)合的粘多糖的類型分為：硫酸軟骨素類，如CS?4、CS?6、CS?B和肝素類（heparin/heparin sulfate）［6-7］。細(xì)胞內(nèi)的Serglycin通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、蛋白水解酶、TGF?β、IL?8和HGF等分子的釋放，進(jìn)而激活多條級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）以及腫瘤細(xì)胞干性的維持［8-12］。分泌到細(xì)胞外的Serglycin可作為配體與其受體CD44分子結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的多種惡性行為，如侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等［13-14］。近期研究也發(fā)現(xiàn)Serglycin可通過(guò)分泌依賴機(jī)制參與三陰性乳腺癌（TNBC）［15-16］、鼻咽癌等多種腫瘤的化療耐藥與轉(zhuǎn)移［17］。

shRNA干擾是真核生物體內(nèi)由雙鏈RNA介導(dǎo)的降解同源RNA的現(xiàn)象，能特異性抑制靶基因表達(dá)，對(duì)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)控，廣泛應(yīng)用于基因功能研究［18］。本研究中，構(gòu)建了2個(gè)干擾序列：SKOV3/shSerglycin1#和SKOV3/shSerglycin2#以及相應(yīng)的空白載體：SKOV3/shCon。并在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了其敲低效率，顯示shSerglycin1#降低Serglycin效果明顯。進(jìn)一步用不同濃度梯度的化療藥物順鉑進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，敲低Serglycin表達(dá)可在不同程度上增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞SKOV3對(duì)化療藥物的敏感性。

細(xì)胞的侵襲能力是衡量腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的重要方面。有研究指出腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力與其惡性程度較為一致，受細(xì)胞自身因素及機(jī)體等因素影響。Transwell小室實(shí)驗(yàn)因其具有高重復(fù)性，操作簡(jiǎn)便易行，目前被廣泛用于腫瘤細(xì)胞侵襲模型的建立及檢測(cè)。在本研究中，Transwell小室侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示，與SKOV3/shCon相比，敲低Serglycin基因的卵巢癌細(xì)胞，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明Serglycin可明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

EMT的發(fā)生過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性，多個(gè)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子被激活，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin等表達(dá)上調(diào)，上皮標(biāo)志物Ecadherin等表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解酶增加，上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞類型［19-20］。在胚胎組織發(fā)生發(fā)育、傷口愈合、器官纖維化、腫瘤進(jìn)展以及耐藥性的產(chǎn)生等過(guò)程中EMT的調(diào)控都起了一定的作用［21］。有研究指出，靶向EMT發(fā)生可以抑制腫瘤耐藥的發(fā)生［22］。本研究顯示在卵巢癌組織中Serglycin可通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB2促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的EMT改變，敲低Serglycin可通過(guò)EMT影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥。

綜上所述，在卵巢癌中，高表達(dá)Serglycin與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移與耐藥性相關(guān)，降低Serglycin的表達(dá)可抑制卵巢癌的EMT的發(fā)生。Serglycin通過(guò)促進(jìn)EMT的發(fā)生，導(dǎo)致卵巢癌的化療耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移。然而，Serglycin通過(guò)EMT促進(jìn)耐藥發(fā)生和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制還需要繼續(xù)探索。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)Serglycin可成為卵巢癌的預(yù)后指標(biāo)和今后潛在的治療靶點(diǎn)，這為臨床上卵巢癌的診治提供了新的理論基礎(chǔ)及方案。