基于紅色碳量子點(diǎn)的熒光法快速檢測(cè)飲料中的胭脂紅

岳曉月，周子君，李 妍，伍永梅，白艷紅*

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450011；2.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450011；3.河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450011)

顏色是食品中重要的感官特性之一，它直接影響消費(fèi)者的選擇和產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值。食品著色劑是食品添加劑的一種，在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用于改善食品色澤，主要作用包括：①補(bǔ)償因空氣、光、溫度和儲(chǔ)藏條件等因素導(dǎo)致的顏色損失；②提高食品原本的顏色；③為無(wú)固有顏色的食品提供顏色，使其更吸引消費(fèi)者[1]。胭脂紅作為人工合成的食品著色劑之一，廣泛應(yīng)用于果汁[2]、冰淇淋[3]、膨化食品中[4]。胭脂紅是一種偶氮化合物，可在體內(nèi)代謝生成致癌能力很強(qiáng)的α-氨基-1-萘酚等物質(zhì)，在規(guī)定范圍內(nèi)使用是安全的，但若長(zhǎng)期食用超過標(biāo)準(zhǔn)含量的胭脂紅，會(huì)使人體正常代謝功能紊亂[5]，嚴(yán)重威脅人體健康。因此，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014[6]明確規(guī)定果蔬汁(漿)類飲料、碳酸飲料、含乳飲料、風(fēng)味飲料等中胭脂紅的最大使用量為0.05 g/kg。因此,建立胭脂紅的快速檢測(cè)方法對(duì)保障食品安全具有重要意義。

目前，胭脂紅的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)儀器確證法和快速檢測(cè)法，其中儀器確證法主要有高效液相色譜法(HPLC)[7]、高效毛細(xì)管電泳法[8]等，但這些方法耗時(shí)長(zhǎng)且需復(fù)雜的樣品預(yù)處理[9]。近年來(lái)，快速檢測(cè)方法因靈敏度高、選擇性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域備受關(guān)注，主要有薄層層析法[10]、示波極譜法[11]、伏安法[12]、微柱法[13]、分光光度法[14]、熒光分析法[15]等。其中，熒光分析法因具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單以及可視化等優(yōu)點(diǎn)引起了科研工作者的廣泛關(guān)注。碳量子點(diǎn)作為一種新型熒光材料，具有易制備、低毒性、良好光學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品中添加劑[16]、抗生素[17]、重金屬離子[18]、食源性疾病[19]等的檢測(cè)。基于此，本文構(gòu)建了一種基于紅色碳量子點(diǎn)(RCDs)的新型熒光傳感器，旨在為食品中胭脂紅提供一種新型、高靈敏的快速檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-7000熒光分光光度計(jì)、JEM 2100透射電子顯微鏡(日本日立公司)；Alpha-1860紫外分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司)；DHG-9146 A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀(FTIR，德國(guó)Bruker公司)；ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜儀(美國(guó)Thermo Fischer公司)；1290 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。

胭脂紅(分析純)、對(duì)苯二胺(化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸乙酯(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；果汁飲料：美汁源爽麗花語(yǔ)(紅葡萄+玫瑰)(鄭州市某超市)。

1.2 RCDs的制備

采用溶劑熱法合成RCDs：準(zhǔn)確稱取0.3 g對(duì)苯二胺溶于30 mL無(wú)水乙醇中，攪拌均勻，倒入反應(yīng)釜，以180 ℃水熱反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，得到淡灰色懸浮液。將硅膠粉和乙酸乙酯(體積比為1∶3)混合，灌入硅膠柱中。待柱子壓實(shí)后，將反應(yīng)釜中淡灰色懸浮液緩慢滴入處理好的硅膠柱中。用乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，當(dāng)流出的液體在紫外燈照射下發(fā)出紅色熒光時(shí)開始收集。待流出的液體在紫外燈照射下無(wú)明顯的紅色熒光時(shí)，停止收集。將收集到的液體旋蒸后，用少量乙醇溶解，于36 ℃烘箱內(nèi)干燥過夜，得RCDs粉末。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取一定量“1.2”制備的RCDs粉末，用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 8.0)配成100 μg·mL-1的RCDs工作溶液。精確稱取一定量胭脂紅，加入PBS緩沖液(pH 8.0)配成0.5、1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、80 μg·mL-1的系列胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品前處理

精確移取10 mL果汁樣品于20 mL容量瓶中，加入5%甲醇溶液稀釋并定容至刻度，轉(zhuǎn)移至離心管中，以10 000 r/min高速離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 8.0，供熒光分光光度計(jì)和液相色譜測(cè)定。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 熒光測(cè)定條件在3.5 mL熒光比色皿中，加入1 mL RCDs溶液、2 mL經(jīng)過前處理后的樣品溶液，在室溫下靜置1 min。熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。先測(cè)定RCDs的熒光強(qiáng)度IF0，再測(cè)定加入胭脂紅的RCDs的熒光強(qiáng)度IF。

1.5.2 高效液相色譜條件安捷倫C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；柱溫35 ℃。紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相：20 mmol/L 乙酸銨溶液(A)和甲醇(B)，流速 1.0 mL/min，梯度洗脫程序：0～3.0 min，5%～35%B；3.0～7.0 min，35%～100%B；7.0～10 min，100%B；10～10.1 min，100%～5%B；10.1～21 min，5%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 RCDs表征

圖1 RCDs的透射電鏡圖(A)、RCDs的粒徑分析圖(B)以及傅里葉紅外光譜圖(C)Fig.1 TEM images of RCDs(A),the corresponding particle size(B) and FT-IR spectra(C) of RCDs

2.2 熒光檢測(cè)機(jī)理分析

目前，已報(bào)道的熒光猝滅機(jī)理主要包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移、內(nèi)濾效應(yīng)以及光電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)(PET)。本研究通過測(cè)定及分析熒光壽命曲線、紫外-可見吸收光譜和熒光光譜，進(jìn)一步闡明熒光猝滅機(jī)理。如圖3A所示，RCDs的激發(fā)峰最高位于493 nm，而胭脂紅在510 nm處有最高的紫外吸收峰，且與RCDs的激發(fā)光譜明顯重疊，因此兩者之間可產(chǎn)生內(nèi)濾效應(yīng)。如圖3B所示，RCDs的熒光壽命為5.75 ns，加入胭脂紅后，RCDs的熒光壽命為5.99 ns，可見加入胭脂紅前后RCDs的熒光壽命基本一致，排除了熒光共振能量轉(zhuǎn)移和光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移等動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)理。表明胭脂紅猝滅RCDs的原理為靜態(tài)猝滅。

圖4 pH值對(duì)RCDs熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of pH value on the fluorescence response of CDs

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

考察了不同激發(fā)波長(zhǎng)下RCDs的熒光強(qiáng)度變化圖。結(jié)果顯示，在473～523 nm激發(fā)波長(zhǎng)照射下，RCDs的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)，在493 nm時(shí)達(dá)到最大，且RCDs的熒光發(fā)射波長(zhǎng)并未隨激發(fā)波長(zhǎng)的改變而改變，表明RCDs具有激發(fā)獨(dú)立性[20-21]。因此，選擇RCDs的最優(yōu)激發(fā)波長(zhǎng)為493 nm。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)考察了PBS緩沖液的pH值(2.0～12.0)對(duì)胭脂紅熒光檢測(cè)的影響(圖4)。結(jié)果顯示，RCDs的熒光猝滅值(ΔIF=IF0-IF)隨pH值的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)，且在pH 8.0時(shí)RCDs的熒光強(qiáng)度最大，因此，確定PBS緩沖溶液的最佳pH值為8.0。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在優(yōu)化條件下，測(cè)定RCDs樣品的熒光強(qiáng)度，再向溶液中依次加入不同濃度胭脂紅并測(cè)定其對(duì)應(yīng)的熒光光譜(圖5A)。結(jié)果顯示，未加入胭脂紅時(shí)，RCDs在605 nm處具有最大熒光峰，隨著胭脂紅的加入且濃度的增大，RCDs的熒光強(qiáng)度逐漸降低。在0.5～50 μg·mL-1范圍內(nèi)，胭脂紅的質(zhì)量濃度與RCDs熒光強(qiáng)度比值(IF0/IF)呈線性相關(guān)，其線性方程為IF0/IF=0.059c+0.979，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.978，檢出限為0.397 μg·mL-1。此外,RCDs溶液在365 nm紫外燈下的紅色熒光強(qiáng)度隨著胭脂紅的濃度增大而降低，紅色熒光逐漸變暗(圖5C)，故該探針亦可在365 nm紫外燈下可視化檢測(cè)胭脂紅。

2.5 抗干擾實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)通過在RCDs溶液中添加一些干擾物質(zhì)，測(cè)定其熒光強(qiáng)度,考察方法對(duì)胭脂紅檢測(cè)的選擇性(圖5D)。結(jié)果顯示，濃度均為20 μg·mL-1的草酸鈉、甘氨酸、酒石酸鈉、亞硝酸鈉、硼酸、脯氨酸、葡萄糖、蔗糖、Zn2+、Fe3+、K+、Mg2+、Na+對(duì)RCDs檢測(cè)胭脂紅(20 μg·mL-1)的結(jié)果幾乎無(wú)影響。表明RCDs具有很好的抗干擾能力。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

在優(yōu)化條件下，取1 mL RCDs溶液和2 mL處理后的果汁樣品(美汁源爽麗花語(yǔ)(紅葡萄+玫瑰))溶液放入3.5 mL比色皿中，采用本文建立的方法測(cè)得胭脂紅含量為1.34 μg·mL-1(n=3)，采用高相液相色譜法檢測(cè)定值為1.33 μg·mL-1(n=3)，由于前處理時(shí)稀釋了2倍，因此胭脂紅實(shí)際濃度為2.68 μg·mL-1，符合GB 2760-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中食品添加劑的使用量(50 μg·mL-1)[6]，方法滿足檢測(cè)需求。

取上述實(shí)際樣品，向其中添加一定量胭脂紅樣品配成10、20、30 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用本文建立的熒光法和高效液相色譜法檢測(cè)。結(jié)果顯示，采用本方法測(cè)定值分別為10.65、21.68、30.01 μg·mL-1，回收率為93.1%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)0.97%～2.1%為；采用高相液相色譜法檢測(cè)結(jié)果分別為11.57、21.96、18.32.38 μg·mL-1，回收率為98.2%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%～3.0%；由此可見，本方法與液相色譜法測(cè)定結(jié)果一致，且具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，可用于飲料中的胭脂紅的測(cè)定。

3 結(jié) 論

本研究以對(duì)苯二胺為碳源，通過溶劑熱法制備了RCDs，再以RCDs為熒光探針，根據(jù)胭脂紅和RCDs之間的內(nèi)濾效應(yīng)，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)胭脂紅含量的熒光檢測(cè)法。在最優(yōu)條件下，RCDs熒光強(qiáng)度變化的比值與胭脂紅在0.5～50 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.978，最低檢出限為0.397 μg·mg-1，并成功用于實(shí)際果汁樣品中胭脂紅的檢測(cè)。該方法成本低、操作簡(jiǎn)單且具有良好的特異性、靈敏度及準(zhǔn)確性，為飲料中胭脂紅的檢測(cè)提供了一種新方法，并拓展了RCDs在食品分析領(lǐng)域中的應(yīng)用。