基于低共熔溶劑的分散液液微萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定馬肉中非甾體抗炎藥

鄭書展，任彩霞，張春艷，王曉敏，盛萬里

(呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

非甾體抗炎藥(NSAIDs) 在抗炎、止痛、退熱和抗凝血等方面療效顯著，是目前動物養(yǎng)殖業(yè)中使用最廣泛的獸藥種類之一[1]。常見的非甾體抗炎藥有苯基丁氮酮、氟尼辛、萘丁美酮、萘普生、托芬那酸、乙酰氨基酚等。近年的研究表明這類抗炎藥具有明顯的毒副作用，會引起胃腸道、血液、腎臟系統(tǒng)等的不良反應(yīng)，其中較常見的是腸胃潰瘍類嚴(yán)重副作用[2]。NSAIDs可在動物肌肉、牛奶、肝臟和脂肪中積累，會通過食物鏈對消費者健康構(gòu)成威脅[3]。其殘留問題已引起各國食品安全監(jiān)管部門的重視，美國、歐盟、日本等國家均對該類抗炎藥的最大殘留量進(jìn)行了限定[4]。

馬肉肉質(zhì)鮮嫩，脂肪較少，有獨特的鮮香味道，是一類營養(yǎng)價值較高的肉類食品[5]。20世紀(jì)60年代以來中國馬肉產(chǎn)量逐漸提高，到2010年，中國已成為世界馬肉最大生產(chǎn)國。近年來，我國馬肉進(jìn)口量也呈上升趨勢，以我國進(jìn)口蒙古國馬肉唯一指定口岸二連浩特為例，2017年進(jìn)口2.3萬噸，2018年進(jìn)口達(dá)2.9萬噸[6-7]。然而在馬的飼養(yǎng)過程中存在非法使用非甾體抗炎藥的情況，2013年歐洲“馬肉風(fēng)波”中，歐盟檢測結(jié)果顯示有0.5%的待測馬肉檢出含有苯基丁氮酮[8]。而苯基丁氮酮會引起人類再生障礙性貧血，國際上已嚴(yán)禁用于食用動物中。為有效監(jiān)控馬肉品質(zhì)，有必要建立更為快速、高效的馬肉中非甾體抗炎藥殘留的檢測方法。

目前，非甾體抗炎藥殘留的檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法和分光光度法等[9-16]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因靈敏度和選擇性高在NSAIDs殘留分析中最為常用。非甾體抗炎藥的樣品前處理方法主要有固相萃取[17-19]、液-液萃取[20]和固相微萃取等[21-22]，但這些前處理方式存在操作繁冗、時間長、溶劑用量大、不環(huán)保、成本高等不足。分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)是一種集采樣、富集、分離于一體的樣品前處理技術(shù)，具有萃取溶劑用量小、成本低、富集效果好、操作簡便和環(huán)境友好等優(yōu)點，已在殘留檢測中受到廣泛關(guān)注[23-24]。各類新型DLLME萃取劑不斷涌現(xiàn)[25]，其中低共熔溶劑(Deep eutectic solvent,DES)由于其毒性低、可降解、原料豐富、價格低廉、制備簡單的特點得到較多應(yīng)用[26-30]，例如，Dil等[31]開發(fā)了基于DES的人尿中甲芬那酸含量的測定方法：Shishov等[32]將DES用于牛奶中非甾體抗炎藥的測定。然而，現(xiàn)有文獻(xiàn)均聚焦于液態(tài)樣品的前處理，目前尚無基于DES的分散液液微萃取技術(shù)用于動物肌肉等固態(tài)樣品中非甾體抗炎藥的檢測報道。

本研究以廉價易得的氯化膽堿和苯酚為原料經(jīng)過簡單混合合成疏水性DES，并將其作為萃取溶劑，建立了分散液液微萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定馬肉中10種非甾體抗炎藥的方法。該方法操作簡單、準(zhǔn)確高效、環(huán)保節(jié)約，為拓展獸藥殘留檢測的樣品前處理技術(shù)提供了新的思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1260-6460超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)，ST16R冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)，Vortex-Genie 2渦旋振蕩器(美國Scientific Industries)。苯基丁氮酮、氟尼辛、萘丁美酮、萘普生、雙氯芬酸、舒林酸、酮洛芬、托芬那酸、吲哚美辛、乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司，純度均大于98%。氯化膽堿(ChCl，分析純，麥克林公司)，苯酚(分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技公司)，抗壞血酸(分析純，阿拉丁公司)，乙腈(色譜純，安譜公司)，實驗用水為Milli-Q 超純水，含10 mmol/L抗壞血酸的20 mmol/L醋酸銨緩沖液(乙酸調(diào)至pH 3.5)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將各標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋成1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于冰箱4 ℃避光保存。臨用前以乙腈混合逐級稀釋成低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使用時以乙腈稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

表1 低共熔溶劑的合成Table 1 Synthesis of deep eutectic solvents

1.3 DES的制備

按照表1中的比例分別稱取氯化膽堿和氫鍵供體，置于50 mL具塞試管中，其中DES-1～DES-5采用60 ℃加熱攪拌方式，DES-6～DES-9采用室溫渦旋振蕩混合，直至得到透明澄清的均一液體。

1.4 樣品前處理

取代表性馬肉樣品約500 g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器作為試樣，置于-18 ℃冷凍避光保存。稱取2.5 g攪碎均勻的試樣，加入5 mL含抗壞血酸的醋酸銨緩沖液，混勻振蕩10 min，加入1.0 g氯化鈉和0.8 mL低共熔溶劑，混勻1 min，再加入0.8 mL分散劑乙腈，渦旋混勻1 min，10 000 r/min離心5 min。取上清液，用少量乙腈定容至1.0 mL，過濾膜后待測定。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)柱，流動相：A為含5 mmol/L乙酸銨+0.1% 甲酸的水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，20%～60%B；3.0～4.0 min，60%～90%B；4.0～4.5 min，90%～20%B；4.5～7.0 min，20%B；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：三重四極桿質(zhì)譜，電噴霧(ESI)電離源，采用正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;干燥氣溫度為325 ℃；干燥氣流量為10 L/min；霧化氣壓力為137.9 kPa；毛細(xì)管電壓為4 000 V。其他參數(shù)見表2。

表2 10種非甾體抗炎藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS/MS parameters of ten non-steroidal anti-inflammatory drugs

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

不同于液態(tài)樣品的處理方式，肌肉等固態(tài)樣品需先用溶劑提取后再進(jìn)行分散液液微萃取。本實驗考察了不同pH值(pH 3.5、5.0、7.5、9.5)的20 mmol/L醋酸銨緩沖溶液對馬肉樣品中10種藥物的提取效率。結(jié)果顯示，10種藥物在酸性條件下的提取效率明顯高于中性和堿性條件，這是由于非甾體藥物中多含有N、O、S等雜原子和酰胺鍵、羧基鍵等，在酸性條件下易離子化，有利于提高化合物在水中的溶解度。文獻(xiàn)[33]報道紅細(xì)胞的存在會導(dǎo)致苯基丁氮酮氧化分解，使用10 mmol/L抗壞血酸可避免分解，本文最終選擇提取溶劑為含10 mmol/L抗壞血酸的20 mmol/L醋酸銨緩沖溶液(乙酸調(diào)至pH 3.5)。

圖1 不同萃取劑對NSAIDs萃取效率的影響Fig.1 Effect of various extraction agents on extraction efficiencies of NSAIDs

2.2 DES萃取劑的選擇

氯化膽堿無毒安全、價格低，廣泛用作DES的氫鍵受體[27]。本研究使用氯化膽堿按照表1合成了9種DES，按照“1.4”方法對10種目標(biāo)物進(jìn)行分散液液微萃取。結(jié)果顯示，DES-1、DES-2、DES-3的水溶性較好，不能形成兩相系統(tǒng)，無法萃?。籇ES-4、DES-5的黏度較大，不利于在水相中分散，操作難度大；以苯酚為氫鍵供體合成的DES-6、DES-7、DES-8、DES-9作為萃取劑時，可通過加入少量分散劑實現(xiàn)快速萃取，其中氫鍵受體和氫鍵供體比例為1∶2制得的DES-7萃取效率最佳(見圖1)。進(jìn)一步考察了DES-7用量(0.3、0.5、0.8、1.0 mL)對目標(biāo)物萃取效果的影響，發(fā)現(xiàn)其用量為0.3 mL時難以收集DES層，測定結(jié)果不穩(wěn)定；隨著DES-7用量的增加，待測物的萃取效率均呈上升趨勢，用量為0.8 mL時可獲得較好結(jié)果，繼續(xù)增加用量萃取效率無顯著變化，因此選擇DES-7萃取劑用量為0.8 mL。

2.3 分散劑的選擇

常用分散劑包括乙腈、丙酮、四氫呋喃、甲醇等，考察結(jié)果顯示乙腈、丙酮、四氫呋喃均能使DES萃取劑在水相中分散成細(xì)小液滴，增大萃取劑與待測物的接觸面積。上述3種分散劑形成兩相系統(tǒng)的分散能力：四氫呋喃>乙腈>丙酮，但對待測物的萃取效率：乙腈>四氫呋喃 >丙酮，綜合考慮選擇乙腈作為分散劑?？疾炝艘译嬗昧?0.3、0.5、0.8、1.0、1.5 mL)對目標(biāo)物萃取效果的影響，發(fā)現(xiàn)萃取效率隨乙腈體積的增加而增大，乙腈用量為0.8 mL時萃取效率達(dá)到最大值，此后則隨乙腈用量的增加而減小。這是因為乙腈用量少時分散效果差，萃取劑未能均勻分散于水相中，導(dǎo)致萃取效率低；當(dāng)乙腈用量過大時，會影響待測物在水相中的溶解度，導(dǎo)致萃取效率降低，因此實驗選擇分散劑乙腈的最佳用量為0.8 mL。

2.4 鹽加入量的影響

氯化鈉可通過鹽析作用降低非甾體藥物在提取液中的溶解度，同時還能促進(jìn)萃取劑在水相中的分散，因此鹽的加入能夠促進(jìn)待測物在DES萃取劑相的分配?？疾炝寺然c加入量分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 g時10種非甾體抗炎藥的萃取效率，結(jié)果表明，隨著氯化鈉加入量的增加，待測物的萃取回收率逐漸提高，其中舒林酸和吲哚美辛在氯化鈉加入量為1.5 g時的回收率最高，其他8種待測物在氯化鈉加入量為1.0 g時回收率最高。綜合考慮選擇氯化鈉加入量為1.0 g。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

由于肌肉基質(zhì)復(fù)雜，蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂和內(nèi)源性代謝物等對待測物檢測有顯著干擾并影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[34]。采用提取后加入法計算絕對基質(zhì)效應(yīng)，公式為：基質(zhì)效應(yīng)(ME)=(空白基質(zhì)中待測物質(zhì)的響應(yīng)值/乙腈中待測物質(zhì)的響應(yīng)值)×100%，ME>1為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME<1為基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，苯基丁氮酮為中等強(qiáng)度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME=1.46；其余9種待測物為基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME為0.40～0.71。為消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量偏差，本實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行定量。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限在基質(zhì)溶液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行測定，以各組分的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，ng/mL)，在優(yōu)化實驗條件下考察了10種非甾體抗炎藥的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，苯基丁氮酮、萘普生、托芬那酸、乙酰氨基酚的線性范圍為5.0～100 ng/mL，其余6種藥物的線性范圍為0.1～10 ng/mL，相關(guān)系數(shù)(r2) 均大于0.996。根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD) ，10倍信噪比(S/N=10) 計算定量下限(LOQ)，得到10種非甾體抗炎藥的LOD為0.05～2.0 μg/kg，LOQ 為0.10～5.0 μg/kg(見表3)。

表3 10種NSAIDs的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限及定量下限Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r2) ，the method detection and quantitation limits of ten analytes

2.6.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差選取陰性馬肉樣品，分別添加3個濃度水平的非甾體抗炎藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻后按本方法進(jìn)行前處理和檢測，每個濃度水平平行測定6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。表4結(jié)果顯示，在5.0、10、25 μg/kg 3個加標(biāo)水平下，10種NSAIDs的平均回收率為73.5%～94.6%，RSD為1.1%～ 8.1%，方法能夠滿足馬肉中多種非甾體抗炎藥的測定要求。圖2為陰性馬肉低水平(5.0 μg/kg)加標(biāo)樣品的MRM圖。

2.7 實際樣品檢測

應(yīng)用本方法對蒙古國進(jìn)口5批冷凍馬肉和農(nóng)貿(mào)市場銷售2份馬肉樣品進(jìn)行檢測，均未檢出10種非甾體抗炎藥。選取1個蒙古國進(jìn)口冷凍馬肉樣品，按5.0 μg/kg水平添加NSAIDs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行提取并測定，得到加標(biāo)回收率為78.3%～93.2%，符合質(zhì)控要求，方法可用于實際樣品分析。

表4 馬肉樣品中10種非甾體抗炎藥的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and RSDs of 10 NSAIDs in horse meat(n=6)

2.8 與標(biāo)準(zhǔn)方法的對比

將本方法與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2190-2008[9]和GB/T 20754-2006[10]方法進(jìn)行比較，見表5。與傳統(tǒng)的液液萃取法和固相萃取法相比，本方法的有機(jī)溶劑用量明顯減少，大大降低了實驗成本以及對環(huán)境和操作人員的危害；操作簡單，萃取與凈化一步完成，耗時短、效率高；檢測靈敏度與標(biāo)準(zhǔn)方法相當(dāng)或有所提高。

表5 本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的對比Table 5 Comparison between the method in this paper and the standard methods

3 結(jié) 論

本文建立了一種基于低共熔溶劑的分散液液微萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定馬肉中10種非甾體抗炎藥的方法，以廉價易得的氯化膽堿和苯酚經(jīng)過簡單混合合成低共熔溶劑，減少了溶劑用量，節(jié)約了分析成本，降低了環(huán)境污染，且前處理操作簡單快捷，在保證提取效率的同時縮短了萃取時間。方法檢出限為0.05～2.0 μg/kg，平均回收率為73.5%～94.6%，RSD小于10%。該方法穩(wěn)定可靠，滿足動物源性食品質(zhì)量監(jiān)測的需求，為DES在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用提供了新的思路。