經典名方當歸四逆湯物質基準的關鍵質量屬性研究

苗家燕，羅 贛，高曉燕，張志強，蔣宇航， 韓 晨，劉雨涵，關雅戈，韓妮娜，喬延江

(1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100029；2.北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京 101301)

《人用藥物注冊技術要求 國際協(xié)調委員會藥物研發(fā)指導原則》[1]中提出，關鍵質量屬性(CQAs)是用以保證產品質量的物理、化學、生物或微生物性質或特征，這些性質或特征應有適當?shù)南薅取⒎秶蚍植?。經典名方的CQAs在上述基礎上融合了中醫(yī)藥元素，是傳承中醫(yī)理論的重要介質。從傳統(tǒng)湯劑到物質基準再到復方制劑，CQAs貫穿于經典名方研究的整個過程。在安全有效的前提下，經典名方復方制劑還應與其物質基準的CQAs保持一致。

當歸四逆湯(DSD)出自東漢張仲景的《傷寒論》[2]，收錄于《古代經典名方目錄(第一批)》[3]。全方由當歸、桂枝、白芍、細辛、木通、甘草和大棗7味藥組成，方中當歸甘溫，養(yǎng)血和血以補虛，桂枝辛溫，溫經散寒以通脈，細辛溫經散寒，助桂枝溫通血脈，白芍養(yǎng)血和營，助當歸補益營血，木通通利經脈以暢血行，大棗、甘草益氣健脾，養(yǎng)血補虛，重用大棗，既合歸、芍以補營血，又防桂、辛燥烈太過，傷及陰血，甘草調和諸藥，全方共奏溫經散寒、養(yǎng)血通脈之效。DSD是治療血虛寒厥證的代表方劑，臨床上主要用于治療雷諾病、痛經、肩周炎、糖尿病伴隨周圍神經病變等疾病[4-7]，其臨床應用廣泛，具有很好的開發(fā)價值。

物質基準作為經典名方的藥用物質標準[8]，可為復方制劑的開發(fā)提供參照，在經典名方復方制劑開發(fā)過程中起著至關重要的作用。目前關于DSD物質基準關鍵質量屬性研究的報道尚屬空白。針對此問題，本文以DSD物質基準為載體，構建其高效液相色譜(HPLC)特征圖譜，同時測定了DSD物質基準對應實物(DSD凍干粉)的出膏率和5種指標成分的含量，從全方化學輪廓與指標成分含量測定的角度對DSD物質基準進行質量評價與控制，完善DSD物質基準質量控制體系，以期為其復方制劑的開發(fā)提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；XP-6型百萬分之一精密天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ5200DA超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Sorvall ST 8R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；陶瓷鍋(曼達尼旗艦店)；LC-E013S電陶爐(廣東順德忠臣電器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

對照品阿魏酸(批號 DST191112-001)、芍藥苷(批號 DST191024-070)、藁本內酯(批號 DST200610-007)、細辛脂素(批號DST190528-014)、甘草苷(批號 DST191027-009)、甘草酸銨(批號 DST190702-008)均購自成都德思特生物技術有限公司；對照品桂皮醛(批號110710-201418)購于中國食品藥品檢定研究院。上述對照品純度>98%。色譜純乙腈(賽默飛世爾科技有限公司)；分析純甲醇、磷酸(國藥集團化學試劑有限公司)；水為實驗室自制超純水。

1.2 藥 材

DSD中各藥材產地信息見表1，經前期研究確定各藥材的炮制方法，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供各批次飲片。經北京中醫(yī)藥大學楊瑤珺教授鑒定分別為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall的干燥根，馬兜鈴科植物北細辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidtvar.mandshuricum(Maxim.)Kitag的干燥根和根莖，木通科植物三葉木通Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz的干燥藤莖，豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根和根莖，鼠李科植物棗ZiziphusjujubaMill的干燥成熟果實。

表1 當歸四逆湯各藥材產地信息Table 1 Origin information of medicinal materials of Danggui Sini Decoction

(續(xù)表1)

No.OriginAngelicae Sinensis Radix(當歸)Cinnamomi Ramulus(桂枝)Paeoniae Radix Alba(白芍)Asari Radix et Rhizoma(細辛)Akebiae Caulis(木通)Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(甘草)Jujubae Fructus(大棗)S4甘肅岷縣廣東肇慶亳州譙城吉林通化安徽霍山黑石渡鎮(zhèn)甘肅定西山東棗莊S5甘肅岷縣廣東肇慶亳州譙城遼寧撫順安徽霍山與兒街鎮(zhèn)甘肅定西河北石家莊S6甘肅渭源縣廣東省肇慶四川德陽黑龍江牡丹江安徽霍山太陽鄉(xiāng)內蒙古包頭河北石家莊S7甘肅通渭縣廣西南寧亳州譙城遼寧撫順安徽霍山諸佛庵鎮(zhèn)內蒙古包頭河北滄州S8甘肅岷縣云南文山亳州譙城黑龍江牡丹江安徽霍山真龍地鄉(xiāng)寧夏吳忠河北滄州S9甘肅岷縣廣東肇慶四川自貢吉林通化安徽霍山漫水河鎮(zhèn)甘肅定西新疆哈密S10甘肅通渭縣云南文山浙江金華黑龍江牡丹江安徽霍山太陽鄉(xiāng)內蒙古包頭新疆和田S11甘肅岷縣廣西南寧亳州譙城吉林通化安徽霍山道士沖鄉(xiāng)內蒙古包頭新疆和田S12甘肅通渭縣廣西玉林四川瀘州遼寧撫順安徽霍山但家廟鎮(zhèn)內蒙古包頭新疆阿克蘇S13云南麗江玉龍自治縣廣西南寧浙江金華遼寧撫順安徽霍山上土市鎮(zhèn)寧夏吳忠新疆喀什S14云南麗江華坪縣廣東肇慶亳州譙城遼寧撫順安徽霍山東西溪鄉(xiāng)寧夏吳忠河北保定S15云南麗江永勝縣廣西南寧亳州譙城黑龍江佳木斯安徽霍山落兒嶺鎮(zhèn)寧夏吳忠山東棗莊

1.3 樣品制備

1.3.1 當歸四逆湯物質基準對應實物的制備《傷寒論》中記載的DSD的用法用量：“當歸三兩，桂枝三兩(去皮)，芍藥三兩，細辛三兩，甘草二兩(炙)，通草二兩，大棗二十五枚(擘)。上七味，以水八升，煮取三升，去滓，溫服一升，日三服。”經考證，確定東漢一兩相當于今日13.8 g[9]，一升相當于200 mL。因此確定處方劑量為當歸、白芍、桂枝、細辛各41.4 g，木通、炙甘草各27.6 g，大棗25枚(破開去核)。分別稱取相應批次處方量的當歸、白芍、桂枝、細辛、木通、炙甘草和大棗置于3 L陶瓷鍋內，加去離子水1 600 mL，電陶爐武火(8檔)加熱至煮沸后轉文火(5檔)煎煮60 min，趁熱以300目尼龍篩網濾過，棄去藥渣，放冷，定容至500 mL，即得DSD水煎液。取上述水煎液適量，于4 ℃、9 000 r·min-1條件下離心20 min后精密移取100 mL上清液置于恒重的蒸發(fā)皿中，冷凍干燥3 d即得DSD凍干粉，用于含量測定和特征圖譜研究。

1.3.2 混合對照品溶液制備取芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、甘草酸銨、細辛脂素和藁本內酯對照品適量，精密稱定，分別置于7個容量瓶中，加甲醇配制成質量濃度分別為2.710、0.223、0.418、0.943、1.240、0.147、0.512 mg·mL-1的各對照品儲備液；依次量取上述對照品儲備液適量置于10 mL容量瓶中，加甲醇配制成質量濃度分別為26.000、23.000、10.500、23.600、106.000、33.200、 12.800 μg·mL-1的混合對照品溶液。

1.3.3 供特征圖譜研究和4個指標成分含量測定用供試品溶液的制備取凍干粉0.45 g，精密稱定，去離子水定容至10 mL，超聲處理3 min至全部溶解，取1 mL在4 ℃、13 000 r·min-1條件下離心20 min的上清液用于DSD凍干粉的特征圖譜研究及芍藥苷、甘草酸銨、桂皮醛和藁本內酯的含量測定。

1.3.4 供細辛脂素含量測定用供試品溶液的制備取凍干粉0.85 g，精密稱定，去離子水定容至10 mL，超聲處理3 min至全部溶解后倒入50 mL分液漏斗中，以等量乙酸乙酯萃取兩次，合并兩次萃取后的乙酸乙酯層溶液于200 mL蒸發(fā)皿中，80 ℃水浴揮干溶劑，甲醇定容至2 mL，取1 mL在4 ℃、13 000 r·min-1條件下離心20 min的上清液用于細辛脂素的含量測定。

1.3.5 單味藥樣品及陰性樣品溶液制備分別稱取處方量的各飲片，按“1.3.1”項下水煎液制備方法，分別制備各單味藥樣品溶液以及缺各單味藥的陰性樣品溶液。

1.4 色譜條件

1.4.1 特征圖譜色譜條件Phenomenex Luna?C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～8 min，5%～10%A；8～15 min，10%～13%A；15～24 min，13%～15%A；24～30 min，15%～17%A；30～34 min，17%～20%A；34～45 min，20%～30%A；45～50 min，30%～45%A；50～65 min，45%～80%A；65～67 min，80%～95%A；67～70 min，95%A。柱溫30 ℃，體積流量1.0 mL·min-1，檢測波長為230 nm和290 nm，進樣量10 μL。

1.4.2 含量測定色譜條件Phenomenex Luna?C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～8 min，16%A；8～35 min，16%～50%A；35～45 min，50%～100%A；45～50 min，100%～16%A。柱溫30 ℃，體積流量1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm和290 nm，進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 當歸四逆湯物質基準特征圖譜的建立

2.1.1 精密度試驗取同一批凍干粉(S3)供試品溶液，按“1.4.1”色譜條件連續(xù)進樣6次。結果以芍藥苷(230 nm)和桂皮醛(290 nm)為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差(RSD)均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗取同一批凍干粉(S3)供試品溶液，按“1.4.1”色譜條件，分別于樣品制備后0、2、4、8、12、24、48 h進樣，結果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復性試驗平行制備同一批凍干粉(S3)供試品溶液6份，按“1.4.1”色譜條件進樣，結果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.1.4 特征圖譜建立及相似度評價采用“1.3.3”方法制備15批凍干粉供試品溶液，按“1.4.1”色譜條件進行分析。將15批物質基準HPLC數(shù)據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，以S1樣品圖譜為參照圖譜，時間窗寬度設定為0.1 min，采用中位數(shù)法，進行多點校正和全譜峰匹配，得到230 nm和290 nm下15批物質基準特征圖譜(S1～S15)及共有模式(軟件基于15批物質基準的圖譜擬合出的對照圖譜，包含15批物質基準的共有信息，R)(圖1)，混合對照品的色譜圖見圖2。特征圖譜中共標記45個共有峰，共有峰45為當歸特征峰，共有峰42、43、44為桂枝特征峰，共有峰7、8、9、16、20為白芍特征峰，共有峰34、35、36、37、38為細辛特征峰，共有峰11、22、24、26、28、29、32、33為甘草特征峰，共有峰15為木通特征峰。經與對照品比對共指認7個共有成分，分別是9號峰芍藥苷、10號峰阿魏酸、11號峰甘草苷、32號峰甘草酸銨、36號峰細辛脂素、43號峰桂皮醛、45號峰藁本內酯。以生成的共有模式為參照，15批物質基準特征圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.89。

特征圖譜應盡量多的呈現(xiàn)藥材的特征成分信息，兼顧各指標成分的響應強度，故本研究選擇不同波長進行檢測。根據藥典中各指標成分的檢測波長，擬選定230 nm和290 nm作為DSD色譜分析的檢測波長。通過對凍干粉供試品溶液進行全波長掃描(210～400 nm)發(fā)現(xiàn)，230 nm下色譜峰數(shù)量多，290 nm下藁本內酯和桂皮醛色譜峰峰形好，吸收強。因此，確定特征圖譜和含量測定的檢測波長為230 nm和290 nm。

2.2 當歸四逆湯物質基準的出膏率

按“1.3.1”方法制備DSD凍干粉，測定出膏率，計算公式為出膏率=(m/M)×100%，式中m表示凍干粉的質量，M表示飲片投料量，結果見表2。15批物質基準出膏率為13.37%～16.64%，平均值為15.00%，RSD為6.1%。

2.3 當歸四逆湯物質基準的多成分含量測定

2.3.1 系統(tǒng)適應性試驗以“1.3.3”和“1.3.4”方法分別制備用于4個指標成分與細辛脂素含量測定的供試品溶液，按照“1.4.2”色譜條件測定混合對照品溶液、凍干粉的供試品溶液、7個單味藥及其陰性樣品溶液。結果顯示樣品中芍藥苷、桂皮醛、甘草酸銨、細辛脂素和藁本內酯的分離度和理論塔板數(shù)均較好，且陰性無干擾，可進行含量測定。

2.3.2 線性關系考察精密吸取按“1.3.2”制備的芍藥苷、桂皮醛、甘草酸銨、細辛脂素和藁本內酯各對照品儲備液，配制成系列濃度的對照品溶液，于“1.4.2”條件進行色譜分析。記錄不同質量濃度(X)對照品的色譜峰面積(Y)，擬合得到線性回歸方程為：芍藥苷Y=12 588X-89 698(r=0.998 3)，桂皮醛Y=110 079X+181 094(r=0.999 4)，甘草酸銨Y=392 7.5X-26 446(r=0.999 1)，細辛脂素Y=12 697X+5 827.8(r=0.999 9)，藁本內酯Y=19 054X+36 541(r=0.999 9)。結果表明，上述成分依次在0.016 9～2.71、0.000 118～0.236、0.007 72～1.24、0.460～147、0.000 512～0.512 μg·mL-1的范圍內線性關系良好。

圖1 230 nm(A)及290 nm(B)下15批當歸四逆湯物質基準的HPLC特征圖譜(S1～S15) 及當歸四逆湯物質基準的HPLC對照圖譜(R)Fig.1 HPLC characteristic chromatogram of 15 batches substance benchmarks of Danggui Sini Decoction (S1～S15) and HPLC reference chromatogram of substance benchmarks of Danggui Sini Decoction (R) at 230 nm(A)and 290 nm(B)

圖2 230 nm和290 nm下當歸四逆湯混合對照品溶液色譜圖Fig.2 Chromatograms of Danggui Sini Decoction mixed control solution at 230 nm and 290 nm A:230 nm,B:290 nm;9.paeoniflorin(芍藥苷) ,10.ferulic acid(阿魏酸),11.liquiritin (甘草苷),32.ammonium glycyrrhizinate (甘草酸銨),36.asarinin(細辛脂素),43.cinnamaldehyde (桂皮醛),45.ligustilide(藁本內酯)

2.3.3 精密度試驗取同一批凍干粉(S3)供試品溶液，按“1.3.3”和“1.3.4”方法分別制備用于4個指標成分與細辛脂素含量測定的供試品溶液，按“1.4.2”色譜條件連續(xù)進樣6次。結果顯示各成分峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗取同一批凍干粉(S3)供試品溶液，按“1.3.3”和“1.3.4”方法分別制備用于4個指標成分與細辛脂素含量測定的供試品溶液，按“1.4.2”色譜條件分別于樣品制備后0、2、4、8、12、24、48 h進樣。結果顯示各成分峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗平行制備同一批凍干粉(S3)供試品溶液6份，按“1.3.3”和“1.3.4”方法分別制備用于4個指標成分與細辛脂素含量測定的供試品溶液，按“1.4.2”色譜條件進樣。結果顯示各成分峰面積RSD均小于2.0%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加標回收率試驗取凍干粉(S3)0.25 g，精密稱定，以指標成分含量的50%、100%、150%分別加入芍藥苷、桂皮醛、藁本內酯和甘草酸銨對照品溶液各3份，按“1.3.3”方法制備供試品溶液；另取凍干粉(S3)0.85 g，精密稱定，以細辛脂素含量的50%、100%、150%加入細辛脂素對照品溶液各3份，按“1.3.4”方法制備供試品溶液。上述各供試品溶液按“1.4.2”條件進行色譜分析。結果顯示5種成分的加標回收率為95.0%～105%，RSD為1.7%～2.4%，表明該方法準確可靠。

2.4 樣品含量測定

采用“1.3.3”和“1.3.4”方法分別制備15批凍干粉供試品溶液，按“1.4.2”條件進樣。如表2所示，15批物質基準中芍藥苷、甘草酸銨、細辛脂素、桂皮醛和藁本內酯的含量分別為8.226～13.46、1.929～6.535、0.020 02～0.034 30、0.076 61～0.543 3和0.075 94～0.140 6 mg·g-1。

表2 15批當歸四逆湯物質基準的出膏率及5種指標成分的質量分數(shù)Table 2 Yield of dry extract and mass fraction of 5 index components in 15 batches substance benchmarks of Danggui Sini Decoction

以2020年版《中國藥典》中各藥味的含測項為基礎，結合各供試品溶液及混合對照品溶液的色譜圖綜合分析，以含量高、性質穩(wěn)定、無陰性干擾、易于檢測、峰形良好且保留時間適中為原則，選擇芍藥苷、甘草酸銨、細辛脂素、桂皮醛作為指標成分進行DSD物質基準的含量測定研究。藥典中對當歸飲片缺少質控成分，而當歸中主要為揮發(fā)油和有機酸，其中含量最高的為藁本內酯和阿魏酸[10-12]，但阿魏酸存在陰性干擾，且不具有專屬性，故將藁本內酯納入含測項；最終確定藁本內酯、桂皮醛、芍藥苷、細辛脂素和甘草酸銨作為含量測定的指標成分。

對15批DSD凍干粉的指標成分進行含量測定，發(fā)現(xiàn)芍藥苷、細辛脂素和藁本內酯的含量為均值的70%～130%[13]，3個批次的桂皮醛和10個批次的甘草酸銨含量超出了均值的70%～130%。對處方中的各藥材及其飲片進行含量測定，發(fā)現(xiàn)藥材和飲片中同批次的桂皮醛和甘草酸銨也超出含量均值的70%～130%，由此說明飲片質量的均一性是保證經典名方關鍵質量屬性一致性的必要條件。

將特征圖譜中的45個共有峰進行藥材歸屬，結果顯示，除大棗外其余藥味均存在特征峰，故需對大棗進行單獨的質控研究。首先，采用HPLC對大棗中的白樺脂酸、齊墩果酸進行檢測[14]，但在紫外檢測器(UV)和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)下二者均未檢出，推測以上兩個成分的極性較弱，難以煎出。據報道，大棗的主要成分為氨基酸和多糖[15]，但方中當歸也富含多糖，故無法對大棗多糖進行薄層色譜(TLC)鑒別。嘗試對大棗氨基酸進行薄層鑒別[16]，發(fā)現(xiàn)陰性樣品亦存在嚴重干擾。因此需進行后續(xù)研究以實現(xiàn)對大棗的質量控制。

3 結 論

本文基于HPLC特征圖譜、出膏率指標成分含量，闡明了DSD物質基準的關鍵質量屬性，為經典名方DSD的開發(fā)提供了基礎數(shù)據，為經典名方關鍵質量屬性的研究提供了參考思路。