超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查中成藥中49種違法添加化學(xué)藥物

許曉輝，楊志敏，吳興強，吳福祥，張 文，馮 翀，王小喬*

(1.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅 蘭州 730050;2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

中成藥是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，以中藥材為原料，按規(guī)定的處方和方法加工成具有一定劑型的藥物。近年來,藥品流通市場上存在打著天然中藥制劑的旗號，卻在中成藥中違法添加化學(xué)藥物以增強療效的現(xiàn)象[1-2]。由于中成藥的化學(xué)成分復(fù)雜，使得在其中違法添加化學(xué)藥物具有隱蔽性，不易被發(fā)現(xiàn)，若被患者長期服用會造成不可逆轉(zhuǎn)的健康損害，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，甚至危及生命安全。開展中成藥中違法添加化學(xué)藥物的監(jiān)控對于保證中成藥的安全使用具有重要意義。

目前，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)監(jiān)測中成藥中違法添加化學(xué)藥物的應(yīng)用研究日漸增多，能夠監(jiān)控的藥物類別也在增多[3-12]。國家藥品監(jiān)管部門歷來嚴厲打擊中成藥中違法添加化學(xué)藥物，頒布了相關(guān)檢測標準與檢驗方法，如止咳平喘類(批準件編號2009031)、抗風(fēng)濕類(批準件編號2009025)、降糖類(批準件編號2009029)、安神類(批準件編號2009024)、補腎壯陽類(批準件編號2009030)、降壓類(批準件編號2009032)等[13]。這些標準與檢驗方法大部分采用液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，對于復(fù)雜樣品中痕量組分的檢測常用三重四極桿質(zhì)譜(QQQ)及多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，QQQ的MRM模式具有較高的靈敏度和選擇性。從監(jiān)控現(xiàn)狀來看，違法添加化學(xué)藥物一般是多類別多組分同時添加，化合物數(shù)目達到幾十種甚至上百種，因此通常要求一針進樣實現(xiàn)多類別多組分化合物的監(jiān)測，此時選用MRM會受循環(huán)時間限和離子駐留時間限的影響，導(dǎo)致檢測靈敏度和選擇性下降。動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式(d-MRM)[14-15]消除了以上限制，當(dāng)組分離子從液相色譜洗脫時，d-MRM只監(jiān)測組分離子，可根據(jù)保留時間自動分配采集時間和采集點數(shù)，能夠獲得所需的循環(huán)時間，保證每個峰均能獲得足夠的數(shù)據(jù)點和定量分析的準確度，對于共流出峰能最大限度利用離子駐留時間，在保持恒定循環(huán)時間的同時可增強分析物的信噪比，以顯著改善樣品負載循環(huán)時間，提高監(jiān)測化合物的靈敏度和選擇性。

本文運用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)的d-MRM模式建立了中成藥中違法添加化學(xué)藥物的測定方法，根據(jù)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)、峰形以及加標回收率，最終篩選出8類49種目標藥物，包括止咳平喘類、抗風(fēng)濕類、 降壓類、降糖類、 減肥類、輔助降血脂類、補腎壯陽類、鎮(zhèn)靜安神類。該方法前處理簡單，一針進樣可在15 min內(nèi)實現(xiàn)49種藥物的同時測定，能夠為中成藥中違法添加化學(xué)藥物的監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

1290-6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源(美國安捷倫有限公司)；MS105DU分析天平(梅特勒-托利多公司)；真空泵(天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)；移液器(20 μL、100 μL、1 mL)、5810R離心機(德國Eppendorf公司)；Vortex-genie 2渦旋混合器(美國Scientific公司)；SBL-10DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)，甲酸、乙酸銨(色譜純，東京化成工業(yè)株式會社)。

對照品：除伐地那非二鹽酸鹽購自Dr.Ehrenstorfer GmbH，羥基豪莫西地那非、他達拉非、利血平購自北京曼哈格生物科技有限公司外；其他標準品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度≥98.3%。供試樣品來源于涉案委托檢驗樣品、網(wǎng)購樣品、委托檢驗樣品等，樣品劑型為膠囊、片劑和顆粒劑。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A為0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～2.0 min，10%B；2.0～3.0 min，10%～35%B；3.0～4.0 min，35%B；4.0～5.0 min，35%～40%B；5.0～6.0 min，40%B；6.0～12.0 min，40%～85%B；12.0～14.0 min，85%B；14.0～14.1 min，85%～10%B；14.1～15.0 min，10%B。

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，d-MRM掃描模式，霧化氣為N2，干燥氣流速為8 L/min，噴霧電壓為500 V，氣流溫度為325 ℃，毛細管電壓為4 000 V，鞘氣流速為12 L/min，鞘氣溫度為350 ℃；其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 49種藥物的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The main mass spectral parameters of 49 drugs

*quantitative ions

1.3 溶液制備

1.3.1 對照溶液49種藥物標準儲備溶液：精密稱取10.0 mg各對照品，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的儲備液，于4 ℃冷藏備用?；旌蠘藴手虚g溶液：分別準確吸取上述標準儲備溶液0.025 mL至25 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，配制成1 μg/mL的混合標準中間溶液，于4 ℃冷藏備用?；旌蠘藴适褂萌芤海壕芤迫∩鲜龌旌蠘藴手虚g溶液1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，即得。

1.3.2 供試品溶液精密稱取樣品1 g，置于50 mL離心管中，精密加入10.00 mL乙腈，渦旋1 min，在300 W功率下超聲提取30 min，放冷至室溫，5 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液作為待測液。

1.3.3 陰性樣品溶液取未檢出49種藥物的樣品，按照“1.3.2”步驟制成陰性樣品溶液，即空白基質(zhì)樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的選擇

本文的49種目標藥物大部分在甲醇和乙腈中具有良好的溶解性，因此對比了分別以甲醇和乙腈為提取溶劑時的提取效果。結(jié)果表明，兩個提取溶劑的回收率均在85.0%以上?？紤]到乙腈毒性小、價格低，因此選擇以乙腈為提取溶劑，并采用超聲輔助提取，提取溶液經(jīng)離心后取上清液，過0.22 μm微孔濾膜。優(yōu)化的前處理條件如“1.3.2”所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于49種藥物的極性相差較大，因此選擇適于極性化合物分離的C18色譜柱。在流動相的選擇上，由于甲酸可提高藥物在ESI+模式下的離子化效率，乙酸銨可穩(wěn)定水相和改善峰形，因此考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈以及0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液3種流動相的分離效果。實驗發(fā)現(xiàn)，以0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液為流動相時，大部分目標藥物的分離效果、檢測時間及靈敏度均較優(yōu)，故本方法選其作為流動相。優(yōu)化的色譜條件如“1.2”所示。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于目標藥物種類多，采用MRM采集模式時受循環(huán)時間限的影響，導(dǎo)致有些藥物的響應(yīng)低。因此，將待測藥物分別配制成單個標準溶液，利用MassHunter采集軟件，以手動和自動兩種方式同時優(yōu)化定性和定量離子、碰撞能量、裂解電壓等參數(shù)，建立MRM方法。為了建立d-MRM方法，首先在MRM方法下分析混合標準使用溶液，將所采集數(shù)據(jù)文件從MassHunter質(zhì)譜采集工作站軟件導(dǎo)入自動生成d-MRM方法，包含化合物名稱、MRM離子對、碎裂電壓、碰撞能量、動態(tài)MRM的保留時間和保留時間增量窗口，對于軟件不能自動識別保留時間及保留時間增量窗口的化合物，在安捷倫定性軟件通過提取化合物的離子對手動識別。優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.2”所示。

圖1 49種藥物的MRM總離子流圖(50 ng/mL)Fig.1 MRM of total ion chromatogram of 49 drugs(50 ng/mL)

以d-MRM 模式測定49種藥物的定性和定量離子對色譜圖，共有98個離子監(jiān)測通道。圖1為49種藥物混合標準溶液(50 ng/mL)的總離子流圖，各化合物峰形對稱，每個檢測通道無干擾，定量準確可靠。

2.4 專屬性考察

取“1.3.3”陰性樣品溶液 2 μL，按“1.2”條件進樣并采集譜圖，得到陰性樣品溶液的 MRM 色譜圖(圖略)，均無干擾49種化學(xué)藥物的色譜峰。結(jié)果表明，樣品基質(zhì)不干擾目標物的測定，方法專屬性好。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

用空白基質(zhì)樣品溶液稀釋混合標準使用溶液，得到質(zhì)量濃度分別為0、2、5、10、20、30、40、50、60 ng/mL的標準曲線溶液，采用本方法進行測定。以待測藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(x，ng/mL)，對應(yīng)組分的定量離子對峰面積為縱坐標(y)，得到各藥物的線性回歸方程。將混合標準使用溶液加入空白基質(zhì)中，加標濃度逐級遞減至1.0 ng/mL，按“1.3.2”方法處理后上機檢測，以3 倍信噪比計算各藥物的檢出限(LOD)。結(jié)果顯示，49種藥物在0～60 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2為0.993 2～0.999 5，檢出限為0.290～2.546 ng/g(見表2)。

表2 49種藥物的線性關(guān)系、檢出限、回收率與相對標準偏差Table 2 Linear relationships,limits of detection,recoveries and RSDs of 49 drugs

圖2 西地那非(A)與他達拉非(B) 陽性樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of positive samples for sildenafil(A) and tadalafil(B)

2.6 回收率與相對標準偏差

在陰性樣品中分別按15.0、35.0、70.0 ng/g 3個濃度添加混合標準中間溶液，平行制備3份樣品，按“1.3.2”方法進行處理后上機檢測，每份樣品重復(fù)測定3次。結(jié)果顯示，49種藥物的平均回收率為86.4%～107%，相對標準偏差(RSD)為0.80%～3.5%(見表2)。

2.7 實際樣品測定

采用本方法測定收集的20批樣品，發(fā)現(xiàn)陽性樣品5批，檢出的藥物為二甲雙胍、苯乙雙胍、格列苯脲、西地那非、他達拉非和西布曲明，檢出量分別為0.076 97、1.153、0.013 41、69 500、2 400、724.0 mg/kg。西地那非與他達拉非陽性樣品的總離子流色譜圖見圖2。

3 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化前處理方法、色譜條件和質(zhì)譜條件，采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式，建立了一種同時測定多類別違法添加化學(xué)藥物的UPLC-MS/MS檢測方法，并進行了方法學(xué)考察。運用建立的方法測定20批實際樣品，檢出了二甲雙胍、苯乙雙胍、格列苯脲、西地那非、他達拉非和西布曲明。該方法前處理簡單，靈敏度高，準確度好，專屬性強，適用于中成藥中違法添加化學(xué)藥物的檢測。