表兒茶素對大鼠缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡及Caspase?3、Bcl?2、Bax 蛋白的影響

黃凡 李德麗 蔣嫦月 胡婉湘 謝露

缺血性腦血管病是臨床多見的腦血管疾病，臨床上首選恢復(fù)血氧供應(yīng)，在恢復(fù)血流的同時將進(jìn)一步加重?fù)p傷，稱之為腦缺血再灌注損傷（Cere?bral ischemia reperfusion injury，CIRI）。神經(jīng)元凋亡是CIRI 的主要環(huán)節(jié)，抗凋亡治療可能成為腦缺血治療的主要內(nèi)容。表兒茶素（Epicatechin，EC）主要存在于可可、綠茶中，易透過血腦屏障，其抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性已作廣泛研究，也有研究表明EC 可抑制?；撬崦撗跄懰嵴T導(dǎo)的Huh7 細(xì)胞促凋亡蛋白Bax 表達(dá)，細(xì)胞色素C 釋放及p38 蛋白激酶磷酸化從而抑制線粒體損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡［1］，這表明EC 在抗神經(jīng)元凋亡上具有潛在的價(jià)值。本研究通過觀察EC 對大鼠CIRI 后缺血側(cè)腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡及Caspase?3、Bcl?2、Bax 蛋白的影響，旨在為臨床治療缺血性腦血管病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物54 只雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200-240 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號SCXK（桂）2020-0003。（2）主要材料表兒茶素，純度≥98.0%（北京索萊寶科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）、一抗稀釋液（碧云天生物技術(shù)）；通用型抗體稀釋液（新賽美生物科技有限公司）；兔抗大鼠β?tublin 抗體；兔抗大鼠Caspase?3 抗體，兔抗大鼠Bax 抗體，兔抗大鼠Bcl?2 抗體（華安生物）；Dylight 800 標(biāo)記山羊抗兔二抗（CST 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）動物分組與造模將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham 組）、模型組（I/R 組）、EC5mg/kg 組、EC10mg/kg 組、EC20mg/kg 組、依達(dá)拉奉（ED）3mg/kg 組，每組9 只。除Sham 組外，其余組采用線栓法制備大腦中動脈栓塞模型（MCAO）［2］，大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定，頸部去毛，消毒，縱向切開頸部正中皮膚，結(jié)扎頸外動脈，在頸總動脈上距離頸內(nèi)動脈交叉處5 mm造口，插入線栓至有微弱阻力時停止，扎緊線栓，缺血2 h 后拔栓，假手術(shù)組僅結(jié)扎而不進(jìn)行栓塞操作，各組術(shù)后于23±2℃溫度條件下喂養(yǎng)，正常飲食進(jìn)水。（2）給藥EC5mg/kg 組、EC10mg/kg 組、EC20mg/kg 組分別于再灌注后0 h、12 h、24 h 三個時間點(diǎn)腹腔注射5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg 劑量的表兒茶素，ED 組腹腔注射3 mg/kg的依達(dá)拉奉，Sham 組和I/R 組注射同體積的生理鹽水。（3）神經(jīng)功能評分與腦指數(shù)依照modified neu?rological severity scores（mNSS）［3］評 分 法，于 再 灌注后12 h、24 h 分別進(jìn)行評分，評分越高，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。各組大鼠處死后，迅速取出大腦，快速稱取大腦濕質(zhì)量并計(jì)算腦指數(shù)，腦指數(shù)=濕腦質(zhì)量/體質(zhì)量×1000‰。（4）Tunel 染色法觀察缺血側(cè)腦組織神經(jīng)元凋亡情況經(jīng)甲醛灌注后取腦，固定，包埋，切片，按TUNEL 檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。病理顯微鏡下觀察，400倍視野下隨機(jī)選取5個不同視野，計(jì)算凋亡指數(shù)（凋亡指數(shù)=凋亡神經(jīng)元數(shù)/神經(jīng)元總數(shù)×100%）。（5）Western Blot 檢測缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)Caspase?3、Bax、Bcl?2 蛋白表達(dá)水平提取缺血側(cè)腦皮質(zhì)總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，蛋白變性，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育，掃膜，以β?tublin 為內(nèi)參，Image J 軟件測定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用 SPSS 22.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析，方差齊時多重比較采用LSD 法；方差不齊則采用Welch 檢驗(yàn)，若差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多重比較則用Tambane's T2，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對神經(jīng)功能缺損mNSS 評分及腦指數(shù)的影響 見表1。

表1 EC 對大鼠CIRI 后神經(jīng)功能mNSS 評分及腦指數(shù)的影響（± s，n=9）

表1 EC 對大鼠CIRI 后神經(jīng)功能mNSS 評分及腦指數(shù)的影響（± s，n=9）

注：與sham 組比較，*P＜0.05；與I/R 組比較，#P＜0.05

組別Sham 組I/R 組EC5mg/kg 組EC10mg/kg 組EC20mg/kg 組ED3mg/kg 組12 h 0 6.67±1.03*5.67±1.21 5.25±1.17#4.92±0.66#5.08±0.39#24 h 0 7.73±1.17*6.92±1.36 5.25±1.25#5.17±1.17#5.5±1.05#腦指數(shù)（‰）8.90±0.40 8.89±0.84 9.18±0.99 9.21±0.23 8.46±0.23 9.46±0.62

2.2 對缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡的影響經(jīng)Tunel 染色后，正常的細(xì)胞核為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核為棕褐色。結(jié)果顯示，Sham 組無明顯凋亡，I/R 組神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯增大（P＜0.05）；與I/R 組比較，EC5mg/kg 組、EC10mg/kg 組、EC20mg/kg 組、ED3mg/kg 組凋亡指數(shù)明顯減?。≒＜0.05）。見圖1、表2。

2.3 對缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)Caspase?3、Bax、Bcl?2 蛋白相對表達(dá)水平的影響 見圖2。

圖1 Tunel 染色檢測缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡情況（400×，n=5）

表2 EC 對缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)的影響（±s，n=5）

表2 EC 對缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)的影響（±s，n=5）

注：與sham 組比較，*P＜0.05；與I/R 組比較，#P＜0.05

凋亡指數(shù)（%）1.42±0.40 49.88±3.89*42.91±1.02#26.96±3.85#14.83±1.94#15.61±2.29#組別Sham 組I/R 組EC5mg/kg 組EC10mg/kg 組EC20mg/kg 組ED3mg/kg 組

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是引發(fā)臨床腦卒中的重要因素，其損傷機(jī)制十分復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、能量障礙、鈣超載等病理生理過程，這些環(huán)節(jié)互為因果，相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)。因此，研究改善CIRI 的藥物是極其重要的。

已有研究表明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）預(yù)處理可通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡減輕大鼠腎缺血再灌注損傷［4］。ED 臨床上常用于治療腦卒中，因此作為本研究的陽性藥物，研究發(fā)現(xiàn)，造模后，EC、ED 組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低，神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著降低，表明EC 能對CIRI后大鼠發(fā)揮抗凋亡作用。這與Young 等［5］的研究結(jié)果一致。

缺血再灌注損傷后，最終會導(dǎo)致細(xì)胞最終凋亡或壞死。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞死亡，促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl?2 等在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。缺血再灌注損傷時，凋亡信號被激活，Bax 蛋白進(jìn)入線粒體中，破壞線粒體膜的完整性誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。Bcl?2作為目前研究最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一，是最重要的抗凋亡基因，可通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性、直接控制ROS 的產(chǎn)生、維持細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)來發(fā)揮抗凋亡的作用。Caspase?3 是凋亡過程的主要執(zhí)行者，它的活化是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志［6］。表兒茶素，一種黃酮類化合物，已有研究表明，在乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型中，EC 可減少Caspase?3、Bax 蛋白的表達(dá)，增加Bcl?2 蛋白的表達(dá)，從而減輕肝損傷［7］。本研究也發(fā)現(xiàn)，EC、ED組Caspase?3、Bax 蛋白表達(dá)減少，Bcl?2 蛋白表達(dá)增加，與Cai［8］等研究結(jié)果一致。由此表明EC 可通過減少促凋亡蛋白Caspase?3、Bax 的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl?2 的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元凋亡發(fā)揮腦保護(hù)作用。

圖2 EC 對CIRI 后大鼠缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)凋亡蛋白的影響（n=3）