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    CdCl2對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用

    2021-05-27 02:02:48陸玉建張弘揚(yáng)朱婷婷鄒星月
    關(guān)鍵詞:存活率毒性蛋白質(zhì)

    陸玉建, 張弘揚(yáng), 朱婷婷, 郭 好, 鄒星月, 楊 瑩

    (1.濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院;2.山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心;3.山東省黃河三角洲生態(tài)脆弱帶工程技術(shù)研究中心,山東 濱州 256603)

    鎘(Cd)是一種廣泛存在于生產(chǎn)生活中的重金屬,其化合物對(duì)哺乳動(dòng)物的許多組織和器官有較強(qiáng)的毒性作用,可影響細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至癌變[1].例如,氯化鎘(CdCl2)可導(dǎo)致雞肝細(xì)胞CaM基因表達(dá)量降低,鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂,進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[2].這是由于Cd能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),從而誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷[3-4].研究證實(shí),Cd對(duì)條斑星鰈(Veraspermoseri)卵巢細(xì)胞具有顯著的毒性作用,能引起細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性降低和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量增高,這種氧化應(yīng)激作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5];Cd暴露會(huì)導(dǎo)致大鼠成骨細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)改變,線粒體損傷,出現(xiàn)典型的凋亡特征[6];Cd容易引起小鼠生殖細(xì)胞凋亡及DNA損傷[7].大量的數(shù)據(jù)表明,Cd可以與DNA形成加合物,損傷DNA分子,引發(fā)細(xì)胞中ROS含量升高,進(jìn)而啟動(dòng)與線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[8];此外,ROS能通過c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號(hào)通路降低Bcl-2/Bax值,激活caspase-3和caspase-7表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9-10].犬腎上皮(Madin-Daby canine kidney, MDCK)是由Madin和Darby從犬腎臟組織分離培養(yǎng)建立的細(xì)胞系,通常該細(xì)胞呈上皮樣,以貼壁方式生長,可連續(xù)傳代培養(yǎng)[11].MDCK細(xì)胞系可廣泛用于多種病毒的擴(kuò)增和純化,尤其對(duì)流感病毒的感染具有效率高、增殖快、不易產(chǎn)生變異的優(yōu)點(diǎn)[12],是目前公認(rèn)的最適合流感疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系之一[13-14].國外的研究表明,CdCl2能促進(jìn)MDCK細(xì)胞中流感病毒的增殖[15],但目前我國尚未見相關(guān)報(bào)道.本試驗(yàn)用不同濃度的CdCl2處理MDCK細(xì)胞,利用毒理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法研究CdCl2對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用,以期為進(jìn)一步了解Cd的作用機(jī)制提供依據(jù),也為揭示Cd污染和流感病毒流行之間的關(guān)系提供線索.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    MDCK細(xì)胞(上皮型,貼壁生長),由山東綠都生物科技有限公司提供.DMEM(Dulbecco′s modified eagle medium)高糖培養(yǎng)基,購自賽默飛世爾科技有限公司,附加10%胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司).CdCl2為Sigma公司產(chǎn)品,稱取其粉末加入適量的超純水,配制濃度為0.1 mol·L-1儲(chǔ)存液,過濾后4 ℃保存?zhèn)溆?蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司.MTT細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司.

    1.2 方法

    1.2.1 MDCK細(xì)胞經(jīng)CdCl2處理后的形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)文獻(xiàn)[16]進(jìn)行試驗(yàn),稍作改動(dòng).MDCK細(xì)胞以1×105個(gè)·mL-1接種于24孔板,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,依次加入終濃度為15、25、50、75、100 μmol·L-1的CdCl2,設(shè)置對(duì)照孔(無CdCl2),分別處理24、48、72和96 h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化.每種處理并列設(shè)3個(gè)孔,相同的試驗(yàn)重復(fù)3次.

    1.2.2 MDCK細(xì)胞存活率檢測 利用MTT法檢測細(xì)胞存活和生長情況,具體操作詳見MTT細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒說明書.MDCK細(xì)胞以1×105個(gè)·mL-1接種于96孔板,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,分別加入終濃度為15、25、50、75、100 μmol·L-1的CdCl2,設(shè)置對(duì)照孔(無CdCl2).每種濃度并列設(shè)3個(gè)孔,將96孔板在CO2培養(yǎng)箱(37 ℃)中孵育24 h后取出,將MTT用稀釋液稀釋5倍,每孔加50 μL, 37 ℃孵育4 h,使MTT還原為甲臜.棄上清,每孔加150 μL二甲基亞砜,搖勻使甲臜溶解.用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo ScientificTMMultiskanTMFC)在570 nm波長處檢測每孔的光密度.相同的試驗(yàn)重復(fù)3次.

    細(xì)胞存活率/%=(加藥細(xì)胞D570 nm值/對(duì)照細(xì)胞D570 nm值)×100

    1.2.3 MDCK細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取及其含量測定 參照蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行總蛋白質(zhì)的提取.MDCK細(xì)胞以1×105個(gè)·mL-1接種于24孔板,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,加入終濃度為15、25、50、75、100 μmol·L-1的CdCl2,設(shè)置對(duì)照孔(無CdCl2),每種濃度并列設(shè)3個(gè)孔.分別培養(yǎng)24、48、72和96 h后棄細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS沖洗,每孔加50~100 μL RIPA蛋白裂解液,吹打細(xì)胞.將裂解后的細(xì)胞吸入EP管內(nèi),10 000~14 000g離心3~5 min,取上清,上清液即為全細(xì)胞蛋白質(zhì).

    蛋白質(zhì)含量測定:取標(biāo)準(zhǔn)蛋白(1 g·L-1)50 μL、待測樣品50 μL,另取蒸餾水50 μL,分別加入G-250 3 mL混勻,靜置10 min,于波長595 nm處,1 cm光徑,空白管(蒸餾水)調(diào)零,測量光密度,根據(jù)下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)含量[17].相同的試驗(yàn)重復(fù)3次.

    蛋白質(zhì)含量=(測定管D595 nm值/標(biāo)準(zhǔn)管D595 nm值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(1 g·L-1)

    1.2.4 總蛋白SDS-PAGE檢測與硝酸銀染色 根據(jù)文獻(xiàn)[18]進(jìn)行測定,稍作改動(dòng).將提取的蛋白質(zhì)和等體積的上樣緩沖液混勻,沸水浴5 min,離心后冷卻備用.制備聚丙烯酰胺凝膠,其中分離膠濃度為10%(質(zhì)量體積比),濃縮膠濃度為5%(質(zhì)量體積比).上樣后進(jìn)行電泳,濃縮膠電壓設(shè)定為80 V,進(jìn)入分離膠后調(diào)到120 V.電泳結(jié)束后進(jìn)行硝酸銀染色:用無離子水漂洗凝膠5 min,固定液固定30 min,敏化液處理30 min,無離子水漂洗3次,加入硝酸銀溶液染色20 min,顯色處理2~10 min,觀察到清晰的條帶后,立即用停顯液處理10 min,終止顯色.利用凝膠成像儀(SYSTEM GelDoc XR+IMAGELA Bio-Rad)觀察、拍照.

    1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 2007和SPSS 17軟件處理數(shù)據(jù).通過Duncan′s多重比較進(jìn)行多組樣本間的差異顯著性分析.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 CdCl2濃度對(duì)MDCK細(xì)胞生長狀態(tài)的影響

    對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)48 h內(nèi)生長正常(圖1A、2A),貼壁狀況良好;之后,隨著培養(yǎng)基營養(yǎng)的消耗,對(duì)照細(xì)胞開始聚團(tuán)(圖3A);培養(yǎng)96 h后,對(duì)照細(xì)胞大量聚團(tuán),有少量細(xì)胞出現(xiàn)脫落(圖4A).15和25 μmol·L-1CdCl2處理24 h后MDCK細(xì)胞生長基本正常(圖1B-C);48~72 h部分細(xì)胞脫落(圖2B-C、3B-C);96 h后細(xì)胞脫落程度加重(圖4B),且25 μmol·L-1CdCl2處理的大量細(xì)胞變圓脫落,漂浮于培養(yǎng)基中(圖4C).50 μmol·L-1CdCl2處理24 h后部分細(xì)胞開始變圓脫落,細(xì)胞密度有所降低(圖1D);48 h后細(xì)胞進(jìn)一步脫落(圖2D);72~96 h大量細(xì)胞變圓脫落,貼壁細(xì)胞少,細(xì)胞生長明顯受到抑制(圖3D、4D).75和100 μmol·L-1CdCl2處理48 h內(nèi)已有大量細(xì)胞脫落,漂浮于培養(yǎng)基中(圖1E-F、2E-F);72 h后細(xì)胞已完全脫落,并且逐漸碎片化(圖3E-F、4E-F).

    A-F:培養(yǎng)基中CdCl2的濃度分別為0、15、25、50、75和100 μmol·L-1(箭頭指示部分變圓脫落的細(xì)胞).圖1 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理24 h后的生長狀態(tài)(40×)Fig.1 Growth states of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 24 h(40×)

    A-F:培養(yǎng)基中CdCl2的濃度分別為0、15、25、50、75和100 μmol·L-1(箭頭指示部分變圓脫落的細(xì)胞).圖2 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理48 h后的生長狀態(tài)(40×)Fig.2 Growth states of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 48 h(40×)

    2.2 CdCl2濃度對(duì)MDCK細(xì)胞存活率的影響

    MDCK細(xì)胞經(jīng)15 μmol·L-1CdCl2處理24 h后的存活率接近100%;隨著CdCl2濃度的不斷增大,細(xì)胞存活率逐漸降低,當(dāng)CdCl2濃度達(dá)到75和100 μmol·L-1時(shí),細(xì)胞存活率小于20%(圖5).

    A-F:培養(yǎng)基中CdCl2的濃度分別為0、15、25、50、75和100 μmol·L-1(箭頭指示部分變圓脫落的細(xì)胞).圖3 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理72 h后的生長狀態(tài)(40×)Fig.3 Growth states of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 72 h(40×)

    A-F:培養(yǎng)基中CdCl2的濃度分別為0、15、25、50、75和100 μmol·L-1(箭頭指示部分變圓脫落的細(xì)胞).圖4 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理96 h后的生長狀態(tài)(40×)Fig.4 Growth states of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 96 h(40×)

    柱上不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05),相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05).圖5 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理24 h后的存活率Fig.5 Survival rates of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 24 h

    2.3 CdCl2濃度對(duì)MDCK細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響

    利用SDS-PAGE檢測處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量.圖6顯示,與對(duì)照相比,15和25 μmol·L-1CdCl2處理24 h后細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量變化不明顯;隨著CdCl2濃度的升高,蛋白質(zhì)含量逐漸減少,當(dāng)CdCl2濃度達(dá)到100 μmol·L-1時(shí),蛋白質(zhì)含量明顯降低.培養(yǎng)48 h后,對(duì)照細(xì)胞及15和25 μmol·L-1CdCl2處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量都有所下降,50~100 μmol·L-1CdCl2處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量則顯著降低.隨著處理時(shí)間的延長和CdCl2濃度的增大,細(xì)胞蛋白質(zhì)含量下降幅度更加明顯.

    圖6 不同濃度CdCl2處理后細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的變化Fig.6 Changes in cellular protein contents after treated with different concentrations of CdCl2

    表1也顯示,對(duì)照細(xì)胞和CdCl2處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量都隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低;CdCl2處理時(shí)間相同時(shí),蛋白質(zhì)含量隨CdCl2濃度的增大而降低.15 μmol·L-1CdCl2處理24和48 h后細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量與對(duì)照差異不顯著(P>0.05),其他濃度處理的細(xì)胞蛋白質(zhì)含量與對(duì)照相比差異均達(dá)顯著水平(P<0.05).這表明CdCl2對(duì)MDCK細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成具有抑制作用.

    表1 CdCl2濃度對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響1)Table 1 Effects of CdCl2 concentrations on cellular protein synthesis

    3 討論與結(jié)論

    外源性因子對(duì)細(xì)胞的潛在毒性作用可通過觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞受損的性質(zhì)與程度進(jìn)行判斷,如細(xì)胞形態(tài)的改變、貼壁狀況、生長速度、退化程度及完整性等[19].有研究表明,CdCl2不僅對(duì)成纖維細(xì)胞具有一定的毒性作用,而且這種作用存在劑量和時(shí)間依賴性[3].本試驗(yàn)結(jié)果也顯示,CdCl2處理濃度越大、時(shí)間越長,MDCK細(xì)胞凋亡和脫落現(xiàn)象越嚴(yán)重,表明CdCl2對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用具有明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng).已有研究表明,隨著CdCl2濃度升高,機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過量的ROS,SOD、GSH-Px、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferases, GST)等多種抗氧化酶類活性降低,MDA含量上升,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡失調(diào),誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷,線粒體結(jié)構(gòu)與功能被破壞,細(xì)胞色素C(cytochrome C, CytC)大量釋放,激活Caspase-9,形成凋亡復(fù)合體,進(jìn)一步激活下游的Caspases,啟動(dòng)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡程序[4,20-21].由此可以推測,隨著CdCl2濃度的增大和處理時(shí)間的延長,MDCK細(xì)胞內(nèi)活性氧大量積蓄,抗氧化酶類活性降低,導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力下降,氧化應(yīng)激作用增強(qiáng),進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡.通過SDS-PAGE檢測和蛋白質(zhì)含量測定得出,MDCK細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的變化同樣呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴性.可能的原因:隨著CdCl2濃度的增大、時(shí)間的延長,細(xì)胞生長受到的影響越來越明顯,蛋白質(zhì)合成受到的抑制作用越來越強(qiáng)烈;同時(shí),細(xì)胞存活率不斷下降,細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,蛋白質(zhì)含量隨之降低.有研究證實(shí),CdCl2作用的MDCK細(xì)胞以劑量依賴方式增加流感病毒的復(fù)制,這表明Cd污染物可能加速流感病毒的傳播[15].但CdCl2促進(jìn)MDCK細(xì)胞中流感病毒復(fù)制的機(jī)制尚不明確.此外,細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜,CdCl2引起MDCK細(xì)胞凋亡的具體途徑是什么?CdCl2促進(jìn)流感病毒的增殖與MDCK細(xì)胞凋亡之間是否存在必然的聯(lián)系?要解決這些問題,未來還要開展大量的研究.

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