稻瘟病菌MoSCJ1基因的生物學(xué)功能分析

陳 浩, 王 敏, 楊子峰, 廖 煌, 吳 歡, 凌 菡, 湯 蔚

(福建農(nóng)林大學(xué)閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

稻瘟病是全球水稻生產(chǎn)上的重要病害之一，對(duì)水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有巨大的威脅，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)能造成整片稻田絕收.稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)通過(guò)分生孢子傳播,分生孢子在水稻葉片表面萌發(fā)產(chǎn)生芽管并形成附著胞，后產(chǎn)生侵染栓穿透葉片的角質(zhì)層和表皮細(xì)胞壁，在寄主細(xì)胞內(nèi)分化產(chǎn)生次生菌絲并侵染鄰近細(xì)胞和組織，繼而發(fā)病.

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由囊狀、管狀和泡狀結(jié)構(gòu)組成的一個(gè)連續(xù)的網(wǎng)膜系統(tǒng).真核細(xì)胞中，在折疊酶、伴侶結(jié)合蛋白等協(xié)助下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)分泌性蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和加工并運(yùn)輸?shù)较嚓P(guān)的細(xì)胞部位發(fā)揮功能.為了保證蛋白質(zhì)能正確折疊和修飾，以達(dá)到天然構(gòu)象從而轉(zhuǎn)運(yùn)到目標(biāo)細(xì)胞器或分泌到胞外，細(xì)胞內(nèi)部有一套嚴(yán)格的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，一旦蛋白質(zhì)由于轉(zhuǎn)錄翻譯失敗或不同條件壓力等原因發(fā)生錯(cuò)誤折疊并聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)就會(huì)產(chǎn)生壓力，影響細(xì)胞的正常生理功能[1-2].

真核細(xì)胞存在兩條途徑調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力：非折疊蛋白響應(yīng)(unfolded protein response, UPR)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(endoplasmic reticulum-associated protein degradation, ERAD)[3].其中，ERAD主要通過(guò)泛素化降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白[4]，其包括底物識(shí)別、定位、泛素化、逆向運(yùn)輸和蛋白酶體降解等步驟.底物識(shí)別水平?jīng)Q定底物的降解程度.蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊是由于其本應(yīng)在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水區(qū)暴露在外從而引起蛋白質(zhì)之間的聚集而發(fā)生，在底物識(shí)別的過(guò)程中，熱休克蛋白Hsp70家族成員(Bip/Kar2)會(huì)與疏水區(qū)結(jié)合促進(jìn)多肽鏈折疊，從而避免蛋白質(zhì)分子的聚集[5].與Hsp70長(zhǎng)時(shí)間作用后的底物會(huì)被E3泛素連接酶Hrd1復(fù)合物識(shí)別[6].Hsp40/DnaJ是一個(gè)可以調(diào)節(jié)Hsp70分子伴侶活性的蛋白質(zhì)家族，Hsp40s刺激Hsp70蛋白固有的弱腺苷三磷酸(adenosine triphosphate， ATP)酶活性，使其由ATP狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘斩姿?adenosine diphosphate， ADP)狀態(tài)，從而對(duì)底物有強(qiáng)親和性，促進(jìn)Hsp70與多肽底物的相互作用.Hsp70家族成員通常有多個(gè)Hsp40伴侶，其特定的配對(duì)控制Hsp70伴侶參與調(diào)控特定過(guò)程.所有Hsp40均含有高度保守的75個(gè)氨基酸J結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與Hsp70的ATP酶結(jié)構(gòu)域相互作用，促進(jìn)ATP水解[7].研究表明，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組的Hsp40/DnaJ家族中有22種蛋白質(zhì)，其中包括Scj1蛋白[8].

Scj1作為一種蛋白分子伴侶參與蛋白的折疊過(guò)程.已有研究發(fā)現(xiàn),缺失Scj1會(huì)影響Hsp70的活性，進(jìn)而影響ERAD途徑中底物的識(shí)別及降解過(guò)程，最終啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡程序[8].目前，有關(guān)Scj1在絲狀真菌中的研究較少.本試驗(yàn)利用基因敲除技術(shù)獲得MoSCJ1基因敲除突變體(ΔMoscj1)，研究其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、無(wú)性繁殖、致病力及對(duì)細(xì)胞壁脅迫劑的應(yīng)答等情況，以探討MoSCJ1基因在稻瘟病菌中的生物學(xué)功能，為其他病原真菌中SCJ1基因的研究提供一定的參考.

1 材料與方法

1.1 供試菌株及其他材料

本研究中所用稻瘟病菌野生型菌株Guy11由福建農(nóng)林大學(xué)閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，ΔMoscj1突變體和互補(bǔ)菌株ΔMoscj1/MoSCJ1均由本試驗(yàn)獲得.

試驗(yàn)所用的水稻品種CO39、大麥種子均保存于福建農(nóng)林大學(xué)閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的4 ℃冷庫(kù)中.

完全培養(yǎng)基(complete medium, CM)：20×硝酸鹽50 mL·L-1,1 000×微量元素1 mL·L-1,1 000×維生素溶液1 mL·L-1,葡萄糖10 g·L-1,蛋白胨2 g·L-1,水解酪蛋白1 g·L-1,酵母提取物1 g·L-1,瓊脂粉15 g·L-1.基本培養(yǎng)基(minimal medium, MM)：NaNO36 g, KCl 0.52 g, MgSO4·7H2O 0.152 g, KH2PO41.52 g,維生素B1 0.01 g,微量元素溶液1 mL,葡萄糖10 g,瓊脂粉15 g.稻稈培養(yǎng)基(straw decoction and corn, SDC)：稻稈100 g·L-1(煮沸20 min，兩層紗布過(guò)濾),玉米粉40 g·L-1,瓊脂粉15 g·L-1[9].TB3培養(yǎng)基：水解酪蛋白3 g·L-1,酵母提取物3 g·L-1,蔗糖20%,瓊脂粉12 g·L-1.色氨酸缺陷型合成葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(synthetic dextrose minimal medium without tryptophan, SD-Trp)：無(wú)氨基酵母氮源6.7 g, D-山梨糖醇182.2 g,缺色氨酸氨基酸粉末0.74 g,葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，pH 5.8[10].LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1,酵母提取物5 g·L-1, NaCl 10 g·L-1,瓊脂15 g·L-1；酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium， YPD):葡萄糖20 g·L-1,蛋白胨20 g·L-1,酵母提取物10 g·L-1,瓊脂粉15 g·L-1.

試劑與儀器：潮霉素B，北京索萊寶科技有限公司；博來(lái)霉素，美國(guó)Innivogen公司； Southern雜交試劑盒，美國(guó)羅氏公司；rTaq酶、RNase，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；剛果紅(congo red, CR)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；microcloth, EMD Millipore公司；T100 PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；智能培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；Nikon E200生物顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡，日本尼康公司；血球計(jì)數(shù)板，北京索萊寶科技有限公司；Centrifuge 5420離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；PowerShot G7 X Mark Ⅱ相機(jī)，佳能(中國(guó))有限公司.

1.2 MoScj1的系統(tǒng)發(fā)育分析

在酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到釀酒酵母Scj1的蛋白質(zhì)序列，根據(jù)其與本試驗(yàn)稻瘟病菌Guy11的序列同源性比對(duì)結(jié)果，得到的同源蛋白為MoScj1.在NCBI中利用Blast比對(duì)得到一組MoScj1的同源蛋白序列，選取8個(gè)不同物種的序列在MEGA 5.0軟件中采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[11].

1.3 MoSCJ1突變體的獲得

1.3.1MoSCJ1基因的敲除 以稻瘟病菌野生型菌株Guy11基因組為模板，以MoSCJ1-F1/MoSCJ1-F2和MoSCJ1-F3/MoSCJ1-F4(表1)兩對(duì)引物對(duì)MoSCJ1基因上游和下游各1 000 bp左右的DNA片段進(jìn)行PCR大量擴(kuò)增.與此同時(shí)，將pCX62質(zhì)粒作為模板，以引物HYH-F/HYH-R(表1)對(duì)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因全長(zhǎng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行純化回收.將擴(kuò)增好的MoSCJ1基因上游和下游各1 000 bp左右的DNA片段及潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因全長(zhǎng)中的目的片段進(jìn)行融合PCR，獲得長(zhǎng)度約為3 400 bp的重組片段.以引物MoSCJ1-F1/MoSCJ1-F4(表1)對(duì)重組片段進(jìn)行大量擴(kuò)增，純化回收所得片段，將回收產(chǎn)物用于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化[12].用潮霉素(600 μg·mL-1)篩選轉(zhuǎn)化子.

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.2MoSCJ1突變體的鑒定 用滅菌的牙簽挑選轉(zhuǎn)化子至CM培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 d后，用CTAB法粗提轉(zhuǎn)化子DNA[13].然后以粗提的轉(zhuǎn)化子DNA為模板，用引物MoSCJ1-KO-F/MoSCJ1-KO-R(表1)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性對(duì)照以野生型菌株Guy11基因組為模板，陰性對(duì)照以無(wú)菌水為模板，在陽(yáng)性對(duì)照有條帶、陰性對(duì)照無(wú)條帶的前提下，對(duì)無(wú)條帶出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行下一步驗(yàn)證；以無(wú)條帶的粗提轉(zhuǎn)化子DNA為模板，用引物MoSCJ1-BY-F/HY-R(表1)再次進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照同上，在陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照均無(wú)條帶的前提下，有條帶的轉(zhuǎn)化子即為突變體.

1.4 回補(bǔ)菌株的獲得

1.4.1 回補(bǔ)載體的構(gòu)建 以野生型菌株Guy11基因組為模板，以引物NP-SCJ1-F/NP-SCJ1-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為4 247 bp的片段.將其與pYF11骨架片段共同轉(zhuǎn)入XK-125酵母感受態(tài)細(xì)胞中，并于SD-Trp培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h.以酵母轉(zhuǎn)化子為模板，用引物MoSCJ1-KO-F/GFP-R(表1)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，取有條帶的酵母轉(zhuǎn)化子在YPD培養(yǎng)基中搖培18 h，提取質(zhì)粒.將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，再進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并將結(jié)果測(cè)序，獲得回補(bǔ)載體.

1.4.2 回補(bǔ)菌株的鑒定 將回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入突變體的原生質(zhì)體中，培養(yǎng)4 d后挑出轉(zhuǎn)化子，在激光掃描共聚焦顯微鏡下用博來(lái)霉素(200 μg·mL-1)進(jìn)行篩選.

1.5 MoSCJ1突變體的生物學(xué)表型分析

1.5.1 突變體在不同培養(yǎng)基上的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng) 從保菌袋中取出野生型菌株Guy11、突變體和回補(bǔ)菌株的存菌濾紙片分別接種于CM培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d.然后在各菌落邊緣切取3 mm×3 mm的菌塊并接種于CM、MM、SDC培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù).在28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，測(cè)量、記錄其直徑并拍照.

1.5.2 突變體對(duì)細(xì)胞壁脅迫劑的響應(yīng) 從野生型菌株Guy11、突變體和回補(bǔ)菌株的菌落邊緣切取3 mm×3 mm的菌塊，分別接種于含有脅迫劑CR(400 μg·mL-1)的CM培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù).在28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，測(cè)量、記錄其直徑并拍照，同時(shí)計(jì)算抑制率，抑制率=(空白組菌株直徑-處理組菌株直徑)/空白組菌株直徑×100%.

1.6 MoSCJ1突變體的產(chǎn)孢量測(cè)定及分生孢子梗觀察

1.6.1 產(chǎn)孢量的測(cè)定 從野生型菌株Guy11、突變體和回補(bǔ)菌株的菌落邊緣切取3 mm×3 mm的菌塊，分別接種于SDC培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，在28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d.刮去表面氣生菌絲，置于黑光燈下培養(yǎng)5 d后，用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基，2層microcloth過(guò)濾于10 mL離心管中得到孢子液，并最終定容至2 mL.在血球計(jì)數(shù)板上統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)目，并記錄數(shù)據(jù).

1.6.2 分生孢子梗的觀察 菌株培養(yǎng)方法同1.6.1.切2 cm×2 cm的菌塊于載玻片上，菌絲面貼載玻片，黑光燈下培養(yǎng)2 d后，在Nikon E200生物顯微鏡下觀察分生孢子梗產(chǎn)孢情況并拍照.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.7 MoSCJ1突變體的附著胞萌發(fā)試驗(yàn)

孢子液的制備方法同1.6.1，調(diào)整孢子液濃度為8×105個(gè)·mL-1.將疏水性蓋玻片置于載玻片上，向蓋玻片上滴40 μL孢子液后，將載玻片放入保濕盒中，于28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于4、8、12、24 h在Nikon E200生物顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)情況并拍照，每個(gè)菌株統(tǒng)計(jì)100個(gè)孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率和附著胞形成率.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.8 MoSCJ1突變體的侵染試驗(yàn)

1.8.1 水稻侵染 種植感病水稻品種CO39，于26 ℃溫室中培養(yǎng)至三葉一心期.孢子液的制備方法同1.6.1，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子液濃度為8×105個(gè)·mL-1，向孢子液中加入0.2%(體積分?jǐn)?shù))明膠，混勻，用噴壺均勻地噴灑在水稻葉片上.然后將水稻置于28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再放在接種室培養(yǎng)6 d，觀察水稻的感染情況，統(tǒng)計(jì)并記錄病斑等級(jí)[14]，對(duì)感病水稻葉片進(jìn)行拍照.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.8.2 離體大麥侵染 種植大麥，于溫室中培養(yǎng)9 d.孢子液的制備方法同1.6.1，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子液濃度為8×105個(gè)·mL-1，向孢子液中加入0.2%(體積分?jǐn)?shù))明膠.剪取長(zhǎng)度一致的大麥葉片，滴20 μL孢子液于大麥葉片背部，將大麥葉片置于28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)24 h.撕取大麥背部表皮，在Nikon E200生物顯微鏡下觀察菌絲侵染情況并拍照.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.9 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行單因素統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 MoScj1系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為兩大分支，MoScj1與釀酒酵母S288C具有高度同源性，且從整體來(lái)看與其他7個(gè)物種裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、粘菌(DictyosteliumdiscoideumAX4)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、利什曼原蟲(chóng)(Leishmaniadonovani)、秀麗線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)、人類(Homosapiens)的同源蛋白序列均有相似性.由此推測(cè)這些物種的Scj1同源蛋白在功能上可能具有保守性.

圖1 稻瘟病菌Scj1與其他8個(gè)物種同源蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of the homologous amino acid sequences of Scj1 in M.oryzae and other 8 species

2.2 MoSCJ1突變體的鑒定

利用同源重組原理構(gòu)建了基因敲除載體(圖2A)，通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，得到具潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子.粗提轉(zhuǎn)化子基因組DNA，利用基因內(nèi)部引物、臂外引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,基因內(nèi)部引物驗(yàn)證無(wú)條帶、臂外引物驗(yàn)證有條帶的轉(zhuǎn)化子即為突變體.結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子ΔMoscj1-4、ΔMoscj1-22、ΔMoscj1-23和ΔMoscj1-37為符合條件的MoSCJ1基因敲除突變體(圖2B).隨機(jī)選取ΔMoscj1-22突變體用于后續(xù)試驗(yàn).

2.3 MoSCJ1突變體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)

圖3顯示，突變體菌株在CM和SDC培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的直徑與野生型菌株和回補(bǔ)菌株相比無(wú)明顯差異，而在MM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的直徑相比于野生型菌株和回補(bǔ)菌株極顯著縮小(P<0.01).可見(jiàn)，MoSCJ1參與調(diào)控稻瘟病菌在基本培養(yǎng)基上的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程.

A.MoSCJ1基因的敲除策略；B.PCR驗(yàn)證結(jié)果(Guy11為以野生型菌株為模板的陽(yáng)性對(duì)照，Mock為以無(wú)菌水為模板的陰性對(duì)照).圖2 MoSCJ1基因的靶向敲除Fig.2 The targeted deletion of MoSCJ1 gene

**表示同一培養(yǎng)基下不同菌株之間的差異極顯著(P<0.01).圖3 野生型菌株Guy11、突變體ΔMoscj1、回補(bǔ)菌株ΔMoscj1/MoSCJ1在CM、MM、SDC培養(yǎng)基上的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)情況(A)和菌落直徑(B)Fig.3 Vegetative growth (A) and colony diameters (B) of Guy11, ΔMoscj1 and ΔMoscj1/MoSCJ1 on CM, MM, SDC plates

2.4 MoSCJ1突變體對(duì)細(xì)胞壁脅迫劑的響應(yīng)

相比于野生型菌株和回補(bǔ)菌株，突變體對(duì)CR更加敏感(圖4)，抑制率呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01).這說(shuō)明MoSCJ1參與調(diào)控稻瘟病菌對(duì)細(xì)胞壁脅迫劑的應(yīng)答過(guò)程.

CK為不加入脅迫劑的對(duì)照組;CR為加入剛果紅的處理組.**表示差異極顯著(P<0.01).圖4 野生型菌株Guy11、突變體ΔMoscj1、回補(bǔ)菌株ΔMoscj1/MoSCJ1在含有CR的CM培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況(A)和抑制率(B)Fig.4 The growth (A) and inhibition rate of Guy11, ΔMoscj1 and ΔMoscj1/MoSCJ1 on CM plates containing CR

2.5 MoSCJ1突變體的無(wú)性繁殖

結(jié)果顯示，野生型菌株、突變體和回補(bǔ)菌株均能產(chǎn)生大量孢子(圖5A)，且三者之間的產(chǎn)孢量無(wú)顯著差異(圖5B).由此推測(cè)MoSCJ1不參與調(diào)控稻瘟病菌的無(wú)性繁殖過(guò)程.

圖5 野生型菌株Guy11、突變體ΔMoscj1、回補(bǔ)菌株ΔMoscj1/MoSCJ1在SDC培養(yǎng)基上分生孢子梗的產(chǎn)孢情況(A)和產(chǎn)孢量(B)Fig.5 Conidia formation (A) and conidial production (B) of Guy11, ΔMoscj1 and ΔMoscj1/MoSCJ1 strains on SDC plates

2.6 MoSCJ1突變體的附著胞形成

圖6A顯示，野生型菌株、突變體和回補(bǔ)菌株均能正常形成附著胞，4 h后均能形成圓球狀的附著胞，黑色素在8 h后均明顯累積，24 h后三者的附著胞已經(jīng)完全形成.統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，突變體的分生孢子萌發(fā)率在4 h后達(dá)到80%以上，且與野生型菌株和回補(bǔ)菌株無(wú)顯著差異； 24 h后3種菌株的分生孢子萌發(fā)率均超過(guò)90%(圖6B).不同時(shí)間段突變體的附著胞形成率與野生型菌株和回補(bǔ)菌株相比也不存在顯著差異.由此推測(cè)MoSCJ1不參與調(diào)控稻瘟病菌附著胞的形成過(guò)程.

圖6 野生型菌株Guy11、突變體ΔMoscj1、回補(bǔ)菌株ΔMoscj1/MoSCJ1的附著胞形態(tài)(A)、孢子萌發(fā)率(B)和附著胞形成率(C)Fig.6 Morphology of appressorium (A) , spore germination rate (B) and appressorium formation ratio (C) of Guy11, ΔMoscj1 and ΔMoscj1/MoSCJ1 strains

2.7 MoSCJ1突變體的致病性

突變體能在水稻葉片表面形成清晰、典型的病斑(圖7A)，其發(fā)病程度與野生型菌株和回補(bǔ)菌株無(wú)顯著差異，且同一等級(jí)的病斑數(shù)量與野生型菌株和回補(bǔ)菌株也無(wú)顯著差異(圖7B).接種24 h后，野生型菌株、突變體和回補(bǔ)菌株均能在大麥葉片背部表皮形成附著胞，且附著胞形成的侵染菌絲能大量擴(kuò)展至相鄰細(xì)胞(圖7C).這說(shuō)明MoSCJ1不參與調(diào)控稻瘟病菌的致病過(guò)程.

A.水稻葉片的發(fā)病情況；B.水稻葉片的病斑比例；C.大麥葉片背面侵入菌絲的擴(kuò)展情況.圖7 野生型菌株Guy11、突變體ΔMoscj1、回補(bǔ)菌株ΔMoscj1/MoSCJ1的致病性Fig.7 Pathogenicity of Guy11, ΔMoscj1 and ΔMoscj1/MoSCJ1 strains

3 討論

有研究表明，SCJ1p的缺失會(huì)引起釀酒酵母的細(xì)胞壁缺陷[8].本研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌MoSCJ1基因缺失突變體在MM培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率較野生型菌株顯著下降，表明MoSCJ1參與對(duì)稻瘟病菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的調(diào)控.相比于CM培養(yǎng)基和SDC培養(yǎng)基，MM培養(yǎng)基的成分比較簡(jiǎn)單，均為無(wú)機(jī)物，推測(cè)MoSCJ1基因在稻瘟病菌利用無(wú)機(jī)物進(jìn)行菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的過(guò)程中具有重要作用.而突變體在CM和SDC培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率正常，提示MoSCJ1可能參與了稻瘟病菌對(duì)于部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收過(guò)程.另外，與野生型菌株和回補(bǔ)菌株相比，突變體對(duì)于細(xì)胞壁脅迫劑更為敏感，推測(cè)在缺失MoSCJ1基因后，稻瘟病菌本身的細(xì)胞壁組分和結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化，導(dǎo)致其對(duì)于細(xì)胞壁脅迫劑的應(yīng)答反應(yīng)出現(xiàn)缺陷，敏感性增加，提示MoSCJ1基因可能參與調(diào)控稻瘟病菌對(duì)細(xì)胞壁脅迫劑的應(yīng)答過(guò)程.同時(shí)，該結(jié)果與釀酒酵母[8]的表現(xiàn)類似，提示SCJ1基因在維持不同物種細(xì)胞壁完整性的功能上存在一定的保守性.

細(xì)胞壁是真菌細(xì)胞最外層的結(jié)構(gòu)，由幾丁質(zhì)、α-1,3-葡聚糖、β-葡聚糖等物質(zhì)組成，其對(duì)病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育、侵染性等有重要的作用[15].有研究表明，缺失了幾丁質(zhì)合酶(CHS7)的稻瘟病菌，附著胞功能異常，致病過(guò)程受影響[16].由此可得，細(xì)胞壁的完整性對(duì)稻瘟病菌的生長(zhǎng)和致病性具有重要作用.根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，突變體細(xì)胞壁的某些組分和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得細(xì)胞壁的滲透性和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的選擇性受到影響，從而降低了稻瘟病菌對(duì)于部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率，導(dǎo)致稻瘟病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)異常，提示MoSCJ1基因缺失突變體對(duì)部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收功能的異常與細(xì)胞壁完整性的改變存在關(guān)系.另外，敲除稻瘟病菌細(xì)胞壁中的α-1,3-葡聚糖合酶(AGS1)會(huì)導(dǎo)致突變體的致病性喪失[17]；而本試驗(yàn)中，突變體細(xì)胞壁的破壞未對(duì)該菌致病性產(chǎn)生影響，與張夢(mèng)園等[18]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明MoSCJ1基因的敲除對(duì)于細(xì)胞壁完整性的改變是輕微的.

綜上所述，MoSCJ1基因不參與調(diào)控稻瘟病菌的無(wú)性繁殖、附著胞形成及致病過(guò)程，但調(diào)控稻瘟病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和對(duì)細(xì)胞壁脅迫劑的響應(yīng)過(guò)程.具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.