土貝母苷甲通過調(diào)控circ_0000376/miR-203軸影響皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞惡性表型

王娟, 肖春才, 屈小燕, 張晨陽

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院皮膚科,河南 鄭州 450007

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)是常見的非黑色素性皮膚癌，多見于手背、頭發(fā)和面部等光暴露部位，可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移，危及患者生命[1]。目前，CSCC的治療以根治性手術(shù)切除為主，多數(shù)患者預(yù)后良好，但晚期及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍不佳[2]。因此，尋找有效治療CSCC的方法仍然十分必要。土貝母苷甲是中藥土貝母的主要活性成分之一，具有抗炎、抗病毒和免疫抑制等功效。近年來研究顯示，土貝母苷甲還發(fā)揮抗腫瘤作用，其可通過調(diào)控PI3k-Akt-mTOR信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬[3]，通過抑制MMP-2和MMP-9活性降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲性[4]，具有研發(fā)為腫瘤治療藥物的潛在價值。但目前土貝母苷甲對CSCC細(xì)胞惡性表型的影響及作用機(jī)制還未知。

環(huán)狀RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA，circRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA與miRNA靶向結(jié)合，調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5-6]。研究顯示，circ_0000376在非小細(xì)胞肺癌[7]、乳腺癌[8]和胃癌[9]等腫瘤中表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。但目前，circ_0000376對CSCC發(fā)生發(fā)展的影響也還未知。StarBase生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，circ_0000376可能靶向結(jié)合miR-203。有報道稱，miR-203在CSCC組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可靶向抑制PRC1的表達(dá)并阻斷Wnt /β-catenin信號通路，降低CSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并加速細(xì)胞凋亡，可作為CSCC治療的分子靶點[10]。因此，本研究以CSCC細(xì)胞系SCL-1為研究對象，circ_0000376/miR-203軸為切入點，探究了土貝母苷甲對SCL-1細(xì)胞惡性表型(增殖、遷移、侵襲和凋亡)的影響及可能機(jī)制，以期為CSCC的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株SCL-1(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；土貝母苷甲(純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000試劑盒、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(北京索萊寶公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(大連寶生物公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；PCR引物、circ_0000376小干擾RNA(si-circ_0000376)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、circ_0000376過表達(dá)載體(pcDNA-circ_0000376)、空載體(pcDNA)、miR-203 模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、circ_0000376野生型質(zhì)粒(WT-circ_0000376)和突變型質(zhì)粒(MUT-circ_0000376)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；兔抗人Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)抗體(美國Santa Cruz公司)；雙熒光素酶活性檢測試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇SCL-1細(xì)胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長密度至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化，以1 ∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將SCL-1細(xì)胞以2.5×105個/孔接種于6孔板中，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0000376、pcDNA、pcDNA-circ_0000376。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，RT-qPCR法檢測細(xì)胞中circ_0000376表達(dá)驗證轉(zhuǎn)染效果，同時檢測細(xì)胞中miR-203的表達(dá)，觀察circ_0000376對miR-203表達(dá)的影響。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 未轉(zhuǎn)染的SCL-1細(xì)胞分為對照組、土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲中劑量組、土貝母苷甲高劑量組，對照組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，土貝母苷甲低劑量、中劑量、高劑量組細(xì)胞分別用含5、10、20 μg/mL[3]土貝母苷甲的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0000376的細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為si-NC組、si-circ_0000376組。轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circ_0000376的細(xì)胞用含20 μg/mL 土貝母苷甲的培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為土貝母苷甲+pcDNA組、土貝母苷甲+pcDNA-circ_0000376組。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將分組處理后的細(xì)胞均接種于96孔板中(2.5×104個/孔)，培養(yǎng)24 h后，加10 μL CCK-8，孵育2 h，用酶標(biāo)儀450 nm測吸光度(A)值。抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

1.2.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 將分組處理后的細(xì)胞均接種于24孔板中(5.0×104個/孔)，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，并調(diào)整密度為5×104個/mL。遷移實驗：Transwell小室置于24孔板中，上室加100 μL細(xì)胞懸液，下室加500 μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，取出小室。用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡觀察。隨機(jī)取5個視野計數(shù)。侵襲實驗：預(yù)先在Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干后，再加100 μL細(xì)胞懸液，后續(xù)操作同遷移實驗。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將分組處理后的細(xì)胞均接種于6孔板中(2.5×105個/孔)，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，PBS清洗2次。取1.0×106個細(xì)胞，加500 μL結(jié)合緩沖液，混懸細(xì)胞。依次加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.6 Western blot法檢測Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 將分組處理后的細(xì)胞均接種于6孔板中(2.5×105個/孔)，培養(yǎng)24 h后，RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA法檢測蛋白含量。然后行SDS-PAGE電泳。電泳后，將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5 %脫脂奶粉溶液中封閉1 h。分別于Ki-67(1 ∶500)、MMP-2(1 ∶500)、MMP-9(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶ 1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)一抗孵育液中，4 ℃過夜。再于山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)孵育液中，37 ℃孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照。

1.2.7 RT-qPCR檢測circ_0000376和miR-203表達(dá) 將分組處理后的細(xì)胞均接種于6孔板中(2.5×105個/孔)，培養(yǎng)24 h后，用Trizol試劑提取細(xì)胞中RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。引物序列：circ_0000376上游5′-AGGTTCTCCAGCATTTGGCT-3′，下游5′-TGAATGAAAAAGTTAGTCAGGCAT-3′；miR-203上游5′-GTCGCAGATCGACGACGACG-3′，下游5′-CGACG-ATACGAGCGGGCC-3′；GAPDH上游5′-GGTCTC-CTCTGACTTCAACA-3′，下游5′-GTGAGGGTCTCT-CTCTTCCT-3′；U6上游5′-GTAGATACTGCAGTA-CG-3′，下游5′-ATCGCATGACGTACCTGAGC-3′。2-△△Ct法計算circ_0000376相對于GAPDH、miR-203相對于U6的表達(dá)水平。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將SCL-1細(xì)胞以2.5×105個/孔接種于6孔板中，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或WT-circ_0000376與miR-203 mimics或miR-NC、MUT-circ_0000376與miR-203 mimics。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS.22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。對照組、土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲中劑量組和土貝母苷甲高劑量組四組間各檢測指標(biāo)比較首先用單因素方差分析，進(jìn)而組間兩兩比較用LSD-t檢驗；si-NC組與si-circ_0000376、土貝母苷甲+pcDNA組與土貝母苷甲+pcDNA-circ_0000376組各檢測指標(biāo)比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 土貝母苷甲對皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖的影響

用含不同劑量(5、10、20 μg/mL)土貝母苷甲的培養(yǎng)基培養(yǎng)SCL-1細(xì)胞24 h后，與對照組比較，SCL-1細(xì)胞增殖抑制率提高(P<0.05)，增殖相關(guān)蛋白Ki-67表達(dá)抑制(P<0.05)，且與土貝母苷甲呈劑量依賴性，說明土貝母苷甲可抑制SCL-1細(xì)胞增殖，詳見表1。

表1 土貝母苷甲對SCL-1細(xì)胞增殖的影響Tab.1 The effects of tubeimoside-1 on the

2.2 土貝母苷甲對皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響

如圖1和表2所示，用含不同劑量(5、10、20 μg/mL)土貝母苷甲的培養(yǎng)基培養(yǎng)SCL-1細(xì)胞24 h后，SCL-1細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)降低(P<0.05)，遷移和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低(P<0.05)，且與土貝母苷甲呈劑量依賴性，說明土貝母苷甲可抑制SCL-1細(xì)胞遷移和侵襲。

圖1 Transwell檢測土貝母苷甲對SCL-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響Fig.1 The effects of tubeimoside-1 on the migration and invasion of SCL-1 cells were detected by Transwell.

表2 土貝母苷甲對SCL-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響Tab.2 The effects of tubeimoside-1 on the migration and invasion of SCL-1

2.3 土貝母苷甲對皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞凋亡的影響

用含不同劑量(5、10、20 μg/mL)土貝母苷甲的培養(yǎng)基培養(yǎng)SCL-1細(xì)胞24 h后，與對照組比較，SCL-1細(xì)胞凋亡率提高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加(P<0.05)，且與土貝母苷甲呈劑量依賴性，說明土貝母苷甲可促進(jìn)SCL-1細(xì)胞凋亡，詳見表3。

表3 土貝母苷甲對SCL-1細(xì)胞凋亡的影響Tab.3 The effects of tubeimoside-1 on the apoptosis of SCL-1

2.4 土貝母苷甲對皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞circ_0000376和miR-203表達(dá)的影響

如表4所示，用含不同劑量(5、10、20 μg/mL)土貝母苷甲的培養(yǎng)基培養(yǎng)SCL-1細(xì)胞24 h后，與對照組比較，SCL-1細(xì)胞中circ_0000376的表達(dá)降低(P<0.05)，而miR-203表達(dá)增加(P<0.05)，且與土貝母苷甲呈劑量依賴性，說明土貝母苷甲可抑制SCL-1細(xì)胞中circ_0000376表達(dá)，而促進(jìn)miR-203表達(dá)。

表4 土貝母苷甲對SCL-1細(xì)胞中circ_0000376和miR-203表達(dá)的影響Tab.4 The effects of tubeimoside-1 on the expression of circ_0000376 and miR-203 in SCL-1

2.5 circ_0000376靶向調(diào)控miR-203的表達(dá)

StarBase生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，circ_0000376與miR-203的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點，見圖2。與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0000376+miR-NC的細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0000376+miR-203 mimics的細(xì)胞熒光素酶活性降低(0.56±0.04比1.06±0.08，t=16.77，P<0.05)；而與共轉(zhuǎn)染MUT-circ_0000376+miR-NC的細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染MUT-circ_0000376+miR-203 mimics的細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化(1.01±0.06比1.03±0.07，t=0.65，P=0.524)，說明circ_0000376可與miR-203靶向結(jié)合。pcDNA-circ_0000376組SCL-1細(xì)胞中miR-203表達(dá)水平低于pcDNA組(0.39±0.03比1.00±0.04，t=36.60，P<0.05)，而si-circ_0000376組SCL-1細(xì)胞中miR-203表達(dá)水平高于si-NC組(3.15±0.21比1.02±0.09，t=27.97，P<0.05)，說明circ_0000376負(fù)調(diào)控miR-203。

圖2 circ_0000376與miR-203互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.2 The complementary nucleotide sequences of circ_0000376 and miR-203.

2.6 敲減circ_0000376對皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

如圖3、表5和表6所示，轉(zhuǎn)染si-circ_0000376的SCL-1細(xì)胞中circ_0000376表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞(P<0.01)，說明敲減circ_0000376的SCL-1細(xì)胞構(gòu)建成功；敲減circ_0000376后，SCL-1細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高(P值均<0.01)，遷移和侵襲數(shù)降低(P值均<0.01)，相關(guān)蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2的表達(dá)降低(P值均<0.01)，而Bax表達(dá)升高(P<0.01)，說明敲減circ_0000376抑制SCL-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，且促進(jìn)其凋亡。

圖3 Transwell檢測敲減circ_0000376后SCL-1細(xì)胞遷移、侵襲Fig.3 The migration and invasion of SCL-1 cells after knocking down circ_0000376 were detected by Transwell.

表5 敲減circ_0000376對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Tab.5 The effects of knocking down circ_0000376 on the proliferation, migration, invasion and apoptosis of SCL-1

表6 敲減circ_0000376對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Tab.6 The effects of knocking down circ_0000376 on the proliferation, migration, invasion and expression of apoptosis-related proteins in SCL-1

2.7 過表達(dá)circ_0000376逆轉(zhuǎn)土貝母苷甲對皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用

如圖4、表7和表8所示，與土貝母苷甲+pcDNA組比較，土貝母苷甲+pcDNA-circ_0000376組SCL-1細(xì)胞中circ_0000376表達(dá)升高(P<0.01)，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率降低(P值均<0.01)，遷移和侵襲數(shù)升高(P值均<0.01)，相關(guān)蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2表達(dá)升高(P值均<0.01)，而Bax表達(dá)降低(P<0.01)，說明過表達(dá)circ_0000376逆轉(zhuǎn)了土貝母苷甲對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及對凋亡的促進(jìn)作用。

圖4 Transwell檢測土貝母苷甲對過表達(dá)circ_0000376的SCL-1細(xì)胞遷移、侵襲的影響Fig.4 The effects of tubeimoside-1 on the migration and invasion of SCL-1 cells overexpressing circ_0000376 were detected by Transwell.

表7 過表達(dá)circ_0000376逆轉(zhuǎn)土貝母苷甲對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用Tab.7 Overexpressing circ_0000376 reversed the effects of tubeimoside-1 on the proliferation, migration, invasion and apoptosis of SCL-1

表8 過表達(dá)circ_0000376逆轉(zhuǎn)土貝母苷甲對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用Tab.8 Overexpressing circ_0000376 reversed the effects of tubeimoside-1 on proliferation, migration, invasion and apoptosis-related proteins expression in SCL-1

3 討論

土貝母是我國傳統(tǒng)中藥，其活性成分包括土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙。研究顯示，土貝母苷甲可通過下調(diào)VEGF/VEGFR2和Ang2/Tie2信號傳導(dǎo)途徑抑制非小細(xì)胞肺癌異種移植瘤血管生成[11]。本研究將5、10、20 μg/mL土貝母苷甲作用于CSCC細(xì)胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSCC細(xì)胞的增殖能力、遷移和侵襲數(shù)均明顯降低，且凋亡加劇，提示土貝母苷甲可抑制CSCC細(xì)胞的惡性行為，具有抗CSCC的作用。

腫瘤細(xì)胞的惡性表型受多種分子調(diào)控。Ki-67是細(xì)胞增殖核抗原，腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)志性蛋白[12]。MMP-2和MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，其可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力[13]。Bax和Bcl-2參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，其中Bax為促凋亡分子，表達(dá)增加時形成同源二聚體，改變細(xì)胞線粒體膜通透性，引起細(xì)胞色素C釋放量增加，進(jìn)而激活caspase信號途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而Bcl-2是抗凋亡分子，其表達(dá)增加時與Bax形成異源二聚體，減弱Bax的促凋亡作用[14]。本研究顯示，土貝母苷甲可呈劑量依賴性抑制CSCC細(xì)胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表達(dá)，而促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，提示土貝母苷甲可能通過直接或間接調(diào)控與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡相關(guān)的蛋白活性來影響CSCC細(xì)胞的惡性表型。

circRNA是一類呈閉合環(huán)狀的非編碼RNA，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。目前，研究已表明，circ_0070934[15]、circ_0070934[16]等多種circRNA在CSCC組織或細(xì)胞系中異常表達(dá)，參與調(diào)控CSCC細(xì)胞的增殖和侵襲等惡性行為，為CSCC的發(fā)病機(jī)理提供了新的見解。本研究顯示，敲減circ_0000376可有效減弱CSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示circ_0000376促進(jìn)CSCC的發(fā)展進(jìn)程，其也可作為CSCC治療的分子靶點。本研究還顯示，土貝母苷甲可劑量依賴性降低CSCC細(xì)胞中circ_0000376的表達(dá)，而過表達(dá)circ_0000376逆轉(zhuǎn)土貝母苷甲對CSCC細(xì)胞惡性表型的抑制作用，提示土貝母苷甲可能通過下調(diào)circ_0000376來抑制CSCC細(xì)胞的惡性表型。

為了進(jìn)一步探究土貝母苷甲可能通過下調(diào)circ_0000376抑制CSCC細(xì)胞惡性表型的分子機(jī)制，本研究利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了circ_0000376可靶向結(jié)合miR-203，且敲減circ_0000376促進(jìn)了CSCC細(xì)胞中miR-203的表達(dá)，說明circ_0000376靶向負(fù)調(diào)控miR-203。以往研究顯示，miR-203在前列腺癌[17]、食管癌[18]、三陰性乳腺癌[19]和甲狀腺癌[20]等腫瘤中表達(dá)升高，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型，在腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究顯示，土貝母苷甲可促進(jìn)CSCC細(xì)胞中miR-203的表達(dá)，且過表達(dá)circ_0000376逆轉(zhuǎn)土貝母苷甲對CSCC細(xì)胞中miR-203表達(dá)的促進(jìn)作用，進(jìn)一步提示土貝母苷甲通過靶向下調(diào)circ_0000376進(jìn)而促進(jìn)miR-203的表達(dá)來抑制CSCC細(xì)胞的惡性表型。

綜上所述，土貝母苷甲可劑量依賴性減弱CSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，且加速細(xì)胞凋亡，發(fā)揮一定的抑制CSCC的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控circ_0000376/miR-203軸有關(guān)。