姜黃素對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠PI3K/AKT/GSK‐3β通路及肥大細(xì)胞活化的影響

曹立花 李麗娟 胡曉丹 張曉鈿（?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，?？?570100）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）是一種發(fā)生在育齡婦女之間常見(jiàn)的慢性炎癥疾病，給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1‐2］。目前，手術(shù)是EM治療的常規(guī)方法，但必須權(quán)衡手術(shù)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和卵巢儲(chǔ)備的潛在減少，給EM的手術(shù)治療帶來(lái)困難，因此開(kāi)發(fā)新藥對(duì)改善臨床EM治療至關(guān)重要［3］。與EM相關(guān)的異常免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等，其中肥大細(xì)胞活化能夠釋放炎癥因子，導(dǎo)致疼痛發(fā)生［4］。姜黃素（curcumin）是姜黃傳統(tǒng)藥物的一種多酚成分，具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，能夠改善腦功能、控制肥胖癥和糖尿病，還可用作香料和食用色素［5］。JELODAR等［6］研究證實(shí)，姜黃素可以預(yù)防大鼠EM異位灶組織生長(zhǎng)。磷脂酰肌醇3‐激酶（phosphatidylinositol 3‐kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK‐3β）信號(hào)通路的減弱與肥大細(xì)胞活化較少密切相關(guān)，但姜黃素對(duì)EM的治療作用及其機(jī)制是否與PI3K/AKT/GSK3β途徑相關(guān)尚不明確［7］。本研究通過(guò)建立EM模型，研究姜黃素對(duì)EM大鼠的治療效果及其對(duì)PI3K/AKT/GSK3β通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以期為揭示姜黃素的治療機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠70只，雌性未孕，6周齡，體重（200±10）g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2017‐0001。實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵守3R保護(hù)原則。

1.1.2 藥品與試劑姜黃素（MF‐008974）購(gòu)自信陽(yáng)市沐凡生物科技有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（G1120）、大鼠TNF‐α（SEKR‐0009）、IL‐6（SEKR‐0005）和IL‐1β（SEKR‐0002）ELISA試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；PI3K（PA5‐86800）、p‐AKT（PA5‐104866）和β‐肌動(dòng)蛋白（β‐actin）（PA1‐183）兔抗大鼠多克隆抗體、AKT兔抗大鼠單克隆抗體（MA5‐14916）、山羊抗兔lgG（H+L）（A32731）和山羊抗小鼠IgG（H+L）（A32723）二級(jí)抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；GSK‐3β（ab185141）和p‐GSK‐3β（ab68476）兔抗大鼠單克隆抗體和購(gòu)自英國(guó)Ab-cam公司。

1.1.3 主要儀器MA100N型倒置顯微鏡由日本Nikon生產(chǎn)；Gel DocTMXR+型凝膠成像儀由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備參照文獻(xiàn)［8］方法，將大鼠禁食24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，剖開(kāi)大鼠腹部，分離右側(cè)子宮與周圍組織，結(jié)扎兩端子宮血管后，分離子宮內(nèi)膜，修剪為5 mm×5 mm的子宮內(nèi)膜碎片，內(nèi)膜向里移植入大鼠左側(cè)腹部腹壁后，縫合大鼠腹部。術(shù)后連續(xù)5 d向上述各組大鼠腹腔注射容量為4 000 U/只的硫酸慶大霉素注射液，術(shù)后次日開(kāi)始給予大鼠0.1 mg/kg的雌二醇（1%羧甲基纖維素納溶液溶解）灌胃處理，1次/4 d，共灌胃3次，在末次灌胃雌二醇后第4天麻醉大鼠，觀察異位內(nèi)膜形成透明囊狀，內(nèi)有積液和表面血管生成，則造模成功。假手術(shù)組進(jìn)行右側(cè)子宮截取，但不進(jìn)行左側(cè)異位內(nèi)膜移植處理，術(shù)后次日給予等量1%羧甲基纖維素納溶液，其余參照上述造模方法進(jìn)行。

1.2.2 分組及藥物處理造模成功大鼠為56只，隨機(jī)分為模型組（11只，給予等量蒸餾水灌胃）、姜黃素低（11只）、中（11只）、高（12只）劑量組（分別給予60、120和240 mg/kg姜黃素灌胃）、陽(yáng)性對(duì)照組（11只，給予125 mg/kg孕三烯酮灌胃），灌胃1次/d，連續(xù)21 d。21 d假手術(shù)組（10只，給予等量蒸餾水連續(xù)灌胃）［9］。

1.2.3 樣品采集末次給藥12 h后，戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠，脫頸處死，剖腹，觀察大鼠異位灶個(gè)數(shù)，參考文獻(xiàn)［10］方法，評(píng)價(jià)盆腔黏連情況，計(jì)算異灶面積。分別剪取假手術(shù)組正常子宮內(nèi)膜組織和各實(shí)驗(yàn)組異位子宮內(nèi)膜異位灶組織，部分經(jīng)脫水、石蠟包埋后制成切片，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；其余部分組織分別用PBS清洗后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HE染色實(shí)驗(yàn)取1.2.3各組大鼠切片，經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察異位灶組織病理學(xué)變化。

1.2.5 甲苯胺藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說(shuō)明書步驟，對(duì)1.2.3各組大鼠組織切片染色后，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)每平方毫米肥大細(xì)胞個(gè)數(shù)，取均值。將形態(tài)規(guī)則、邊界清晰的肥大細(xì)胞定義為未脫落肥大細(xì)胞，周圍可見(jiàn)明顯顆粒的肥大細(xì)胞定義為脫落顆粒肥大細(xì)胞。

1.2.6 炎癥因子ⅠL‐1β、ⅠL‐6和TNF‐α檢測(cè)將1.2.3中-80℃保存的組織制備勻漿液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)異位灶組織中IL‐1β、IL‐6和TNF‐α水平。

1.2.7 蛋白免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)將1.2.3中-80℃保存的組織勻漿后，加入RIPA提取各組總蛋白并測(cè)量蛋白含量。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、清洗后，依次加入PI3K、AKT、p‐AKT、GSK3β、p‐GSK3β和β‐actin一抗（1∶1 000）孵育過(guò)夜后，添加二抗（1∶5 000）繼續(xù)孵育2 h，曝光顯影，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用±s表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠內(nèi)異灶和盆腔黏連情況除假手術(shù)組外，其余各組內(nèi)異灶個(gè)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)組無(wú)內(nèi)異灶，與假手術(shù)組相比，模型組EM大鼠內(nèi)異灶面積和盆腔黏連評(píng)分均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，姜黃素低、中、高劑量組EM大鼠內(nèi)異灶面積和盆腔黏連評(píng)分依次降低（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組大鼠上述指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 異位內(nèi)膜組織病理學(xué)觀察如圖1所示，假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜完整，上皮細(xì)胞柱狀排列整齊，腺體自然；模型組大鼠異位內(nèi)膜組織生長(zhǎng)狀態(tài)良好，腺體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均正常；姜黃素低、中、高劑量組大鼠異位子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形狀逐漸變?yōu)榈貑螌又鶢?，腺體和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，并出現(xiàn)空化現(xiàn)象；陽(yáng)性對(duì)照組上述現(xiàn)象介于姜黃素中劑量組和高劑量組之間。

圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜異位灶組織HE染色圖片（×200）Fig.1 HE staining pictures of endometriosis tissue in each group（×200）

圖2 各組大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況Fig.2 Mast cell infiltration of heterotopic foci in each group

表1 各組大鼠EM內(nèi)異灶解剖觀察結(jié)果（±s）Tab.1 Anatomical observation results of EM in rats of each group（±s）

表1 各組大鼠EM內(nèi)異灶解剖觀察結(jié)果（±s）Tab.1 Anatomical observation results of EM in rats of each group（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Sham operation group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Curcumin low dose group；4）P＜0.05 vs Curcumin medium dose group.

Pelvic adhesion score（points）0.00±0.00 5.42±1.001）4.37±0.672）3.26±0.512）3）2.15±0.482）3）4）3.09±0.332）Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 Several different foci（piece）0.00±0.00 4.12±1.031）3.73±0.87 4.02±0.62 3.96±0.74 4.25±0.96 Area of heterotopic lesion（mm2）0.00±0.00 49.65±7.071）38.20±9.112）25.54±8.232）3）16.61±9.322）3）4）23.66±7.282）

2.3 姜黃素對(duì)EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞數(shù)量和活化的影響如圖2所示，假手術(shù)組異位灶組織肥大細(xì)胞及脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)較少，模型組大鼠肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)明顯增加，而姜黃素低、中和高劑量組大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯差異，脫顆粒肥大細(xì)胞相對(duì)數(shù)量呈減少趨勢(shì)；陽(yáng)性對(duì)照組的脫顆粒肥大細(xì)胞相對(duì)數(shù)量介于姜黃素中高劑量組之間。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞總數(shù)、脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒肥大細(xì)胞與肥大細(xì)胞總數(shù)比值均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，姜黃素低、中、高劑量組大鼠異位灶組織脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒肥大細(xì)胞與肥大細(xì)胞總數(shù)比值依次降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 姜黃素治療對(duì)各組大鼠異位灶部位炎癥因子表達(dá)影響與假手術(shù)組相比，模型組EM大鼠異位灶 組 織TNF‐α、IL‐1β和IL‐6表 達(dá)顯 著 增加（P＜0.05）；與模型組相比，姜黃素低、中、高劑量組EM大鼠異位灶組織TNF‐α、IL‐1β和IL‐6表達(dá)依次減少（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組上述指標(biāo)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.5 姜黃素治療對(duì)各組大鼠異位灶組織PⅠ3K、AKT和GSK‐3β蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組相比，模型組EM大鼠異位灶組織PI3K、p‐AKT和p‐GSK‐3β蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，姜黃素低、中、高劑量組EM大鼠異位灶組織PI3K、p‐AKT和p‐GSK‐3β蛋白表達(dá)依次降低（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組上述指標(biāo)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖3。

表2 各組大鼠異位灶組織中肥大細(xì)胞及脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of mast cells and degranulated mast cells in ectopic foci of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠異位灶組織中肥大細(xì)胞及脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of mast cells and degranulated mast cells in ectopic foci of rats in each group（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Sham operation group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Curcumin low dose group；4）P＜0.05 vs Curcumin medium dose group.

Degranulated mast cells/total mast cells 0.21±0.06 0.46±0.051）0.37±0.022）0.25±0.032）3）0.17±0.022）3）4）0.21±0.032）Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 Total number of mast cells（piece）1.46±0.47 4.13±1.531）3.24±0.51 3.11±0.96 3.96±1.03 4.07±0.88 Number of degranulated mast cells（piece）0.26±0.13 1.69±0.231）0.98±0.262）0.58±0.112）3）0.25±0.132）3）4）0.39±0.092）

表3 各組大鼠異位灶組織TNF‐α、IL‐1β及IL‐6表達(dá)情況（±s，pg/ml）Tab.3 Expressions of TNF‐α，IL‐1β and IL‐6 in ectopic foci of rats in each group（±s，pg/ml）

表3 各組大鼠異位灶組織TNF‐α、IL‐1β及IL‐6表達(dá)情況（±s，pg/ml）Tab.3 Expressions of TNF‐α，IL‐1β and IL‐6 in ectopic foci of rats in each group（±s，pg/ml）

Note：1）P＜0.05 vs Sham operation group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Curcumin low dose group；4）P＜0.05 vs Curcumin medium dose group.

IL‐6 73.49±8.35 135.61±9.921）117.32±7.232）70.58±8.522）3）43.83±9.542）3）4）51.95±8.851）Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 TNF‐α 31.14±6.32 98.78±10.431）70.36±9.182）52.52±10.022）3）12.39±3.222）3）4）29.64±5.131）IL‐1β 0.67±0.09 2.44±0.121）2.05±0.082）0.99±0.082）3）0.37±0.132）3）4）0.59±0.101）

表4 各組大鼠異位灶組織中PI3K、AKT和GSK‐3β蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of PI3K，Akt and GSK‐3 β protein expression in ectopic foci of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠異位灶組織中PI3K、AKT和GSK‐3β蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of PI3K，Akt and GSK‐3 β protein expression in ectopic foci of rats in each group（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Sham operation group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Curcumin low dose group；4）P＜0.05 vs Curcumin medium dose group.

p‐GSK‐3β/GSK‐3β 0.29±0.03 0.83±0.061）0.61±0.022）0.36±0.062）3）0.10±0.022）3）4）0.23±0.032）Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 PI3K/β‐actin 0.16±0.03 1.26±0.031）0.98±0.042）0.57±0.062）3）0.21±0.022）3）4）0.34±0.042）p‐AKT/AKT 0.32±0.04 1.18±0.021）0.99±0.072）0.65±0.042）3）0.13±0.032）3）4）0.22±0.022）

3 討論

通過(guò)外科手術(shù)將子宮組織移植到腹壁和腸系膜是常見(jiàn)的建立小鼠或大鼠的實(shí)驗(yàn)性異位癥子宮內(nèi)膜模型的方法，該模型的廣泛應(yīng)用對(duì)EM的發(fā)病及治療機(jī)制的研究具有重要意義［10‐11］。研究發(fā)現(xiàn)，EM大鼠的惡化程度與內(nèi)異灶體積大小及盆腔黏連變化密切相關(guān)［12‐13］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠內(nèi)異灶個(gè)數(shù)、內(nèi)異灶體積和盆腔黏連相較于假手術(shù)組均顯著升高，提示EM造模成功。此外，模型組大鼠異位內(nèi)膜組織生長(zhǎng)狀態(tài)良好，腺體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均正常，表明EM病灶組織生長(zhǎng)未得到有效控制。給予EM大鼠不同劑量的姜黃素治療后，各組大鼠內(nèi)異灶體積和盆腔黏連均相應(yīng)減少，表明姜黃素對(duì)EM具有治療作用，與既往研究結(jié)果一致［6］。

肥大細(xì)胞在炎癥性疾病中至關(guān)重要，研究表明，肥大細(xì)胞脫顆?？梢葬尫叛装Y因子促進(jìn)EM病理性疼痛持續(xù)發(fā)生，且EM病變中的肥大細(xì)胞和活化數(shù)明顯增加［14］。病理水平上EM會(huì)導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)增加，而改善炎癥水平能夠阻止異位灶組織生長(zhǎng)［15］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞數(shù)、肥大細(xì)胞總數(shù)、脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒肥大細(xì)胞與肥大細(xì)胞總數(shù)比值、炎癥因子TNF‐α、IL‐1β和IL‐6表達(dá)顯著增加，提示EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞及其活化狀態(tài)升高，處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)。給予姜黃素治療后，各組異位灶組織肥大細(xì)胞脫顆粒占比和上述炎癥因子表達(dá)顯著降低，提示姜黃素可抑制EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞活化，可能與降低炎癥反應(yīng)相關(guān)。另有研究證實(shí)，姜黃素能夠通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)對(duì)高果糖飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征大鼠和中腦動(dòng)脈阻塞大鼠產(chǎn)生治療作用，因此推測(cè)姜黃素可能是EM治療的潛在有效藥物，這可能與降低肥大細(xì)胞活化，抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)［16‐17］。

PI3K是細(xì)胞信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)劑，LIN等［18］研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K及其下游激酶AKT表達(dá)能夠抑制肥大細(xì)胞活化。徐南輝等［19］利用肥大細(xì)胞脫顆粒肽誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)明顯升高。GSK3β是AKT下游效應(yīng)分子之一，激活小鼠下丘腦中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白/AKT/GSK3β級(jí)聯(lián)反應(yīng)可觸發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒［20］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠異位灶組織中PI3K蛋白、AKT和GSK3β磷酸化水平相較于假手術(shù)組顯著升高，提示EM大鼠異位灶組織PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。給予姜黃素治療后上述蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性降低，提示姜黃素能夠抑制EM大鼠異位灶組織中PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路激活。在心肺旁手術(shù)誘導(dǎo)的腦損傷中，使用PI3K抑制劑降低AKT和GSK3β磷酸化水平可減輕腦組織的炎癥反應(yīng)，抵制腦損傷，因此推測(cè)姜黃素可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/GSK3β途徑降低異位灶組織的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到抑制EM異位灶組織生長(zhǎng)的效果，但姜黃素干預(yù)下EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞活化受到抑制是否與PI3K/AKT/GSK3β途徑相關(guān)尚待更深入的探索［21］。

綜上所述，姜黃素能夠抑制EM異位灶組織生長(zhǎng)，可能與抑制PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路、降低肥大細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)相關(guān)，揭示了姜黃素用于治療EM的潛在價(jià)值。但EM是一種多因素疾病，機(jī)制比較復(fù)雜，因此本課題組將進(jìn)一步聯(lián)合動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)以期提供更多數(shù)據(jù)支持姜黃素在EM病理學(xué)中的治療效果。