補腎活血方對抗磷脂綜合征小鼠母胎界面VEGF、HIF‐1α、TGF‐β、sflt‐1蛋白表達影響研究①

韓永梅 劉蔚霞肖惠冬子 衛(wèi)愛武（河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450000）

抗磷脂綜合征（anti‐phosphoric syndrome，APS）是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的主要病因，以體內(nèi)產(chǎn)生大量抗磷脂抗體（an-tiphospholipid antibodies，APL）為特征［1］。APL通過抑制前列腺素，增加胎盤血栓素，促使低密度脂蛋白被滋養(yǎng)細胞氧化，抑制滋養(yǎng)細胞分化，造成胎盤功能不全，導(dǎo)致流產(chǎn)［2］。母胎界面血管發(fā)生和血管化是胎盤蛻膜毛細血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的基礎(chǔ)。研究表明RSA小鼠存在蛻膜血管減少、血管內(nèi)皮細胞破壞等病理變化，血管生長因子失衡是導(dǎo)致RSA的重要原因之一［3‐5］。本文研究補腎活血方對抗磷脂綜合征模型小鼠母胎界面VEGF、HIF‐1α、TGF‐β、sflt‐1蛋白表達的影響，探討APS致RSA的發(fā)病機制及治療機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物42只，6～8周齡BALB/c雌性小鼠，平均體重（20.00±0.20）g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份公司，SPF級，許可證號：SCXK（遼）2015‐0001，屏障環(huán)境標準飼養(yǎng)，恒定濕度（40%～55%）及恒定溫度（25±1℃），高壓滅菌的水和標準飼料供動物自由食用。連續(xù)觀察1周無異常者入組實驗。實驗研究過程嚴格遵守減量化、再利用和再循環(huán)的原則。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過，倫理審查編號2009HL‐053‐03。

1.1.2 主要試劑與藥品全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、一抗二抗去除液、SDS‐PAGE凝膠快速制備試劑盒、Western洗滌液、SDS‐PAGE蛋白上樣緩沖液、HIF‐1α antibody、VEGF antibody、TGF‐β1 antibody、sflt‐1 antibody、羊抗兔IgG‐HRP、內(nèi)參抗體β‐actin（萬類生物有限公司）。補腎活血方藥：菟絲子30 g、桑寄生15 g、續(xù)斷15 g、阿膠15 g、當(dāng)歸10 g、熟地黃20 g、川芎6 g、黨參20 g、白術(shù)15 g、海螵蛸12 g、藕節(jié)炭15 g、白芍30 g、炙甘草6 g，采用江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的顆粒劑型，由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院顆粒劑藥房提供。腸溶阿司匹林片，北京中新藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準文號，國藥準字H13023461，規(guī)格25 mg。

1.1.3 實驗儀器水平搖床（北京六一，型號：WD‐9405B）、電泳儀（北京六一，型號：DYY‐7C）、轉(zhuǎn)移槽（北京六一，型號：DYCZ‐40D）、超速冷凍離心機（湖南湘儀，型號：H‐2050R）、酶標儀（美國BIOTEK，型號：ELX‐800）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特，型號：DH36001B）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模方法將42只小鼠隨機分為正常妊娠組、模型組、模型對照組、補腎活血高劑量組、補腎活血低劑量組、陽性對照組，每組動物數(shù)均為6只。模型組、高劑量組、低劑量組、阿司匹林組：造模第1天雌性小鼠宮腔內(nèi)注射（采用自制的注射器，將毛細玻璃管進行均勻加熱，將融化的尖端拉長至3 cm，直徑為1 mm，然后將其連接到1 ml注射器，用石蠟密封。將小鼠麻醉后腹部消毒，剪開皮膚逐層分離暴露子宮，采用自制注射器進行宮腔內(nèi)注射。注射完成后，逐層縫合傷口。）10 ug弗氏完全佐劑CFA乳化的人β2GP‐1進行免疫；第8天再次用弗氏不完全佐劑IFA乳化的10 ug人β2GP‐1免疫小鼠。模型對照組：造模第1天雌性小鼠宮腔注射等劑量的CFA進行免疫；第8天再次注射等劑量的IFA進行免疫。正常妊娠組：不行免疫。第18天將各組雌性小鼠與雄性小鼠連夜配對。第19天早上檢測出陰道栓的雌鼠納入實驗，確定為實驗開始第0天。各組小鼠頜下采血0.5 ml，應(yīng)用ELISA方法檢測血清抗β2糖蛋白抗體1抗體（anti‐β2GP‐1）；應(yīng)用APTT檢測試劑盒（高嶺土激活）檢測血漿活化部分凝血活酶時間（APTT）；應(yīng)用血細胞自動分析儀檢測靜脈血血小板計數(shù)（PLT）。如小鼠anti‐β2GP‐1滴度明顯升高，APTT明顯延長，PLT明顯降低，提示孕鼠抗磷脂綜合征實驗?zāi)Ｐ驮炷３晒Γ?‐8］。

1.2.2 給藥方法正常妊娠組、模型組、模型對照組等容量蒸餾水灌胃，每日1次。其余3組給藥劑量參照徐叔云主編《藥理實驗方法學(xué)》（第三版）方法計算：小鼠20 g與70 Kg人換算關(guān)系是0.0026，計算低劑量組0.826 8 g/(kg·d)（相當(dāng)于臨床成人等效劑量1.5倍），高劑量1.653 6 g/(kg·d)（相當(dāng)于臨床成人等效劑量3倍）。陽性對照組腸溶阿司匹林片，按上法計算小鼠按0.585 mg/(kg·d)（相當(dāng)于臨床成人等效劑量3倍）給藥，連續(xù)灌胃給藥15 d，每天2次。

1.2.3 胚胎吸收率給藥結(jié)束后將小鼠腹腔注射200 mg/kg戊巴比妥鈉安樂處死，剪取子宮記錄正常胚胎數(shù)和流產(chǎn)胚胎數(shù)，記錄被吸收胚胎數(shù)和存活胚胎數(shù)。胚胎吸收率計算公式：R=Re/（Re+F）×100%（R表示胚胎吸收率，Re表示吸收胚胎數(shù)，F(xiàn)表示存活胚胎數(shù)）［9］。

1.2.4 Western blot檢測每個樣品剪取胎盤組織100 mg。提前將裂解液置于室溫融化，估算實驗所用體積進行分裝，并混入分裝體積1%的PMSF備用。根據(jù)每個樣本的質(zhì)量及體積加入相應(yīng)體積的裂解樣本，然后繼續(xù)置于冰上靜置5 min。開啟低溫冷凍離心機，12 000 r/min，4℃，離心10 min，分離上清為所得的蛋白質(zhì)抽提物。然后進行蛋白質(zhì)定量、SDS‐PAGE、轉(zhuǎn)印至PVDF膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、ECL底物發(fā)光、圖像保存。將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel‐Pro‐Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值。

1.2.5 胎盤組織HE染色取胎盤組織，生理鹽水清洗后，采用10%中性甲醛液固定，再進行包埋、切片脫蠟至水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、自來水返藍、伊紅染色、脫水、透明、封片、鏡檢。制成小鼠胎盤組織病理切片，用×200顯微鏡下觀察染色效果，進行拍照。

1.2.6 指標檢測檢測各組小鼠胚胎吸收率；各組小鼠胎盤病理形態(tài)、螺旋動脈及滋養(yǎng)細胞情況；各組小鼠胎盤VEGF、TGF‐β1、HIF‐1α、sflt‐1的蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。所得結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析（One‐Way ANOVA），采用Pearson分析進行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胚胎丟失率的比較與正常妊娠組比較，模型組胚胎吸收率顯著升高（P＜0.05）；連續(xù)給藥15 d后，與模型組比較，補腎活血方高劑量組、低劑量組、阿司匹林組胚胎吸收率均顯著降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠胎盤病理形態(tài)、螺旋動脈及滋養(yǎng)細胞分析見圖1、2，正常妊娠組：胎盤滋養(yǎng)細胞排列整齊，細胞規(guī)則，細胞核染色清晰，胞漿豐富，染色淡紅，細胞核位于中央。血管形態(tài)相對完好，血管數(shù)量正常，管壁完整，管壁內(nèi)未見明顯瘀血。模型對照組：與正常妊娠組類似。模型組：細胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，胞漿水腫，絕大部分細胞核消失、壞死、核固縮，細胞空泡樣變，組織空泡結(jié)構(gòu)明顯，細胞核染不清晰，細胞核固縮，甚至消失。血管內(nèi)皮細胞損傷，同時可見炎癥細胞浸潤。血管數(shù)量明顯減少，血管壁不完整，管壁內(nèi)見明顯瘀血。補腎活血方高劑量組：病理改變有較為明顯的減輕，胎盤滋養(yǎng)細胞有一定程度損傷，可見炎癥細胞浸潤和部分細胞空泡樣變，但較模型組減輕。補腎活血方低劑量組：病理改變有較為明顯的減輕，胎盤滋養(yǎng)細胞有一定程度損傷，可見炎癥細胞浸潤和部分細胞空泡樣變，但較模型組減輕。阿司匹林組：與模型組比較小鼠胎盤病理形態(tài)、螺旋動脈及滋養(yǎng)細胞均有改善。

表1 各組小鼠胚胎吸收率比較（n=6）Tab.1 Comparison of embryo absorption rate of each group（n=6）

圖1 各組小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞HE染色（×200）Fig.1 HE staining of placental trophoblast of mice in each group（×200）

圖2 各組小鼠胎盤螺旋動脈HE染色（×200）Fig.2 HE staining of placental spiral artery of mice in each group（×200）

圖3 各組小鼠VEGF、TGF‐β1、HIF‐1α、sflt‐1蛋白表達量灰度圖Fig.3 Gray scale of VEGF，TGF‐β1，HIF‐1α and sflt‐1 protein expression in each group

圖4 各組妊娠小鼠胎盤組織VEGF、HIF‐1α、TGF-β1、sflt‐1蛋白相對表達量比較Fig.4 Comparison of relative expression of VEGF，HIF‐1α，TGF‐β1，sflt‐1 protein in placenta of pregnant mice in each group

圖5 VEGF、TGF‐β1蛋白表達量灰度分析比值相關(guān)性分析Fig.5 Correlation Analysis of gray scale analysis ratio of VEGF and TGF‐β1 protein expression

2.3 小鼠胎盤組織中VEGF、TGF‐β1、HⅠF‐1α、sflt‐1的蛋白表達量與正常妊娠組比較，模型組妊娠小鼠VEGF蛋白表達顯著降低；與模型組比較，高劑量、低劑量組、阿司匹林組VEGF蛋白表達顯著升高；補腎活血方高劑量組VEGF蛋白表達顯著高于低劑量組及阿司匹林組。各組小鼠胎盤組織HⅠF‐1α蛋白表達量無顯著性差異。與正常妊娠組比較，模型組TGF‐β1蛋白表達顯著降低；與模型組比較，補腎活血方高劑量組、低劑量組、阿司匹林組TGF‐β1蛋白表達顯著升高。與正常妊娠組比較，模型組妊娠小鼠sflt‐1蛋白表達顯著升高；與模型組比較，補腎活血方高劑量組、低劑量組、阿司匹林組sflt‐1蛋白表達顯著下降；高劑量組sflt‐1的蛋白表達顯著低于低劑量組及阿司匹林組。見圖3、4。

2.4 VEGF、TGF‐β1蛋白表達量灰度分析比值相關(guān)性分析VEGF、TGF‐β1蛋白表達量灰度分析比值呈明顯正相關(guān)（R2=0.999 6）。見圖5。

3 討論

RSA在中醫(yī)中屬“滑胎”范疇，先天腎氣不足，后天脾胃虛弱、房勞多產(chǎn)、憂思勞倦、跌撲閃挫、情志失宜等是其發(fā)病的主要因素。胞宮乃孕育之所，其生理特點為“瘀血不去，新血不生”，胞宮藏瀉失調(diào)，血瘀阻滯胞宮，胎元失養(yǎng)，故而“屢孕屢墮”。APS致RSA患者，辯證多屬血瘀，其病機以腎虛為本，血瘀為標，腎虛血瘀為其主要發(fā)病機制，中醫(yī)辨證以補腎活血多能奏效。目前有關(guān)VEGF、HIF‐1、TGF‐β、sflt‐1等血管活性因子對妊娠的影響，尤其是APS與母胎界面的血管活性因子的相關(guān)性研究較少。因此，本文針對APS小鼠，研究補腎活血方對母胎界面VEGF、HIF‐1、TGF‐β、sflt‐1蛋白表達的影響，探討中醫(yī)藥防治RSA的作用機制。

VEGF具有促使血管內(nèi)皮細胞生長、分化、遷移，修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，誘導(dǎo)血管生成，維持血管壁通透性、完整性等作用。妊娠期VEGF主要分布在滋養(yǎng)細胞、血管內(nèi)皮細胞中，促進滋養(yǎng)細胞的浸潤和分化，促使胎盤血管形成，維持血管通透性［10］。VEGF表達不足、血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移能力下降、血管通透性相關(guān)活性物質(zhì)下調(diào)，胚胎血管、蛻膜血管、絨毛及胎盤血管生成障礙，導(dǎo)致流產(chǎn)［11］。VEGF在正常妊娠絨毛組織中表達率為100%，在稽留流產(chǎn)等病理妊娠絨毛組織中表達僅70%，RSA與VEGF的異常表達存在相關(guān)性［12‐14］。HIF‐1α是血管生成的啟動因子，通過誘導(dǎo)血管生成發(fā)揮作用［15‐16］。研究表明稽留流產(chǎn)絨毛組織中HIF‐1α表達上升，其蛋白過度表達抑制滋養(yǎng)細胞向侵入型分化，使滋養(yǎng)細胞侵入子宮螺旋動脈變淺，減少胚胎、胎盤血管灌注，胚胎缺血、缺氧導(dǎo)致流產(chǎn)［17‐18］。TGF‐β1主要表達于胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞，并調(diào)節(jié)胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞增殖、分化、浸潤。孕期TGF‐β1調(diào)控胎盤新生血管形成、血管通透性，促進胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞增殖［19］。TGF‐β1在RSA患者外周血的表達低于正常妊娠者，低濃度TGF‐β1使母體免疫失衡，炎癥反應(yīng)加劇，破壞胎盤血管形成［20‐21］。sflt‐1由胎盤合體滋養(yǎng)細胞分泌，具有抑制血管內(nèi)皮細胞有絲分裂，降低血管內(nèi)皮細胞增殖；破壞血管壁完整性、通透性，抗血管生成等作用［22］。RSA患者血清及絨毛中sflt‐1表達顯著高于正常人群［23］。可能與sflt‐1異常升高，加速VEGF滅活，抑制滋養(yǎng)細胞浸潤，阻礙蛻膜、胎盤血管形成，引起子宮螺旋小動脈循環(huán)障 礙 有 關(guān)［24］。研究認為檢測外周血sflt‐1對RSA的診斷有一定價值［25］。

有關(guān)中藥對母胎界面血管活性因子影響的研究較少，大多以補腎健脾益氣為治療原則。有實驗研究結(jié)果表明補腎健脾中藥可上調(diào)流產(chǎn)小鼠模型蛻膜中VEGF的表達［26］。臨床研究認為補腎中藥可上調(diào)RSA患者外周血TGF‐β1表達，而補腎活血方可調(diào)節(jié)RSA患者血清中VEGF、sflt‐1水平，降低流產(chǎn)率，提高活產(chǎn)率［27‐28］。補腎活血方藥對APS致RSA外周血及母胎界面的血管活性因子的研究較少見。因此，針對本病腎虛血瘀的發(fā)病機制，本研究方藥以全國名老中醫(yī)王自平教授經(jīng)驗方為基礎(chǔ)，以補腎活血為主旨，方中菟絲子補腎益精，固攝沖任以陰胎；桑寄生、續(xù)斷補益肝腎；阿膠滋養(yǎng)陰血安胎。當(dāng)歸養(yǎng)血活血；川芎活血祛瘀、行氣開郁；熟地黃補血滋陰、益精填髓。黨參補氣益、健脾養(yǎng)血；白術(shù)健脾益氣；補氣以推動血行，助當(dāng)歸、川芎祛瘀之效。上藥合用則腎精充、脾氣旺、祛瘀而不損胎。海螵蛸、藕節(jié)炭收斂止血、固攝沖任、清熱化瘀，止血而不留瘀滯。白芍緩急止痛，甘草調(diào)和諸藥。前期臨床研究表明：補腎活血方治療腎虛血瘀型APS致RSA療效顯著，提高中醫(yī)證候療效、抗磷脂抗體轉(zhuǎn)陰率及活產(chǎn)率［29］。其作用機制有待進一步深入研究。

針對APS對母胎界面及胚胎的不良影響，補腎活血方藥可上調(diào)VEGF、TGF‐β1蛋白表達，下調(diào)sflt‐1蛋白表達，促進胎盤血管生成，改善胎盤血管通透性，提高血管內(nèi)皮細胞及胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞增殖；同時可改善小鼠胎盤組織、螺旋動脈及滋養(yǎng)細胞病理改變。最終達到促進胚胎發(fā)育，降低流產(chǎn)率的作用。但其對母胎界面血管生成因子的調(diào)節(jié)機制及作用環(huán)節(jié)有待進一步深入探討。