白藜蘆醇通過調(diào)控microRNA-506/sphingosine kinase 1抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其凋亡①

黎展華 周繼紅 陳斯寧 潘玲 馮原 羅美群 李瑞祥 王浩舟 劉劍

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530021）

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率與病死率居首位的惡性腫瘤，全世界的年發(fā)病人數(shù)約為123萬［1‐2］。其中85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer，NSCLC）。目前對(duì)NSCLC的主要治療手段為手術(shù)、物理療法、放療和化療，但總體治療效果差強(qiáng)人意，因此開發(fā)出安全高效的肺癌治療藥物乃是當(dāng)前肺癌研究的熱點(diǎn)之一［3‐4］。

天然來源的小分子白藜蘆醇（resveratrol）具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、毒性小等特點(diǎn)，可以通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，已被證實(shí)具有較為肯定的抗腫瘤作用，但具體的作用機(jī)制尚未完全闡明［5］。

microRNA在腫瘤中的作用類似于癌基因或抑癌基因，通過調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因影響多種信號(hào)通路，調(diào)節(jié)一系列腫瘤細(xì)胞的功能如增殖、凋亡、侵襲和分化［6‐7］。在我們的前期研究中，microRNA506（miR‐506）在肺癌細(xì)胞及肺癌組織中表達(dá)明顯減少［8］。鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）是一種高度保守的脂酶，是調(diào)控神經(jīng)酰胺/1‐磷酸鞘氨醇的限速酶。SPHK1作為一個(gè)致癌激酶在多種癌癥中被顯著上調(diào)，它與癌癥的發(fā)展和侵襲密切相關(guān)［9‐10］。在我們的前期研究中，qRT‐PCR、免疫印跡和熒光素酶報(bào)告基因的結(jié)果表明SPHK1是miR‐506的一個(gè)直接靶點(diǎn)；通過作用于SPHK1，miR‐506的上調(diào)可以抑制NSCLC的細(xì)胞增殖、侵襲，并且促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的凋亡［8］。

本研究通過探討白藜蘆醇對(duì)人肺腺癌細(xì)胞（A549細(xì)胞）增殖、周期、凋亡的影響以及白藜蘆醇對(duì)miR‐506、SPHK1的影響，進(jìn)一步探索白藜蘆醇抑制NSCLC的作用機(jī)制，為白藜蘆醇在NSCLC治療方面提供新的思路與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人肺腺癌A549細(xì)胞（貨號(hào)：NA）購(gòu)自上海細(xì)胞庫。白藜蘆醇（分子質(zhì)量228 g/mol，純度＞99.99%，貨號(hào)：501‐36‐0）購(gòu)自上海麥克林公司。DMEMH培養(yǎng)基（貨號(hào)：12100046）、胎牛血清（貨號(hào)：10270‐106）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。QuantiNova SYBR（貨號(hào)：208054）購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。CCK‐8試劑盒（貨號(hào)：CK04）購(gòu)自上海Dojindo公司。hsa‐miR‐506‐3p inhibitor購(gòu) 自 吉 瑪 基 因。Green PCR Kit（500T，貨號(hào)：D7268M）購(gòu)自上海碧云天公司。First strand cDNA synthesis kit（貨號(hào)：K1622）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。FITC Annexin V（貨號(hào)：556547）購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公 司。HRP‐Conjugated GAPDH Antibody（貨號(hào)：HRP‐60004）、HRP‐Conjugated Beta Actin Antibody（貨號(hào)：HRP‐60008）購(gòu)自美國(guó)Potein-tech公司。Anti‐Mouse IgG（Fc specific）‐Peroxidase antibody produced in goat（貨號(hào)：A2554‐1ml）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Anti‐rabbit IgG、HRP‐linked Antibody#7074（貨號(hào)：7074S）購(gòu)自美國(guó)CST公司。Anti‐SPHK1 antibody（貨號(hào)：Ab71700）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEMH培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組培養(yǎng)及藥物干預(yù)

1.2.2.1 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)將A549細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中分為以下各組（白藜蘆醇干預(yù)24 h和48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)）：①空白對(duì)照組：A549細(xì)胞單純培養(yǎng)；②白藜蘆醇30μmol/L組：A549細(xì)胞使用濃度為30μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h；③白藜蘆醇50μmol/L組：A549細(xì)胞使用濃度為50μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h；④白藜蘆醇100μmol/L組：A549細(xì)胞使用濃度為100μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h。

1.2.2.2 miR‐506、SPHK1實(shí)驗(yàn)根據(jù)說明書使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor至A549細(xì)胞，然后將A549細(xì)胞接種于6孔板中并分為以下各組（白藜蘆醇干預(yù)24 h和48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)）：①空白對(duì)照組：A549細(xì)胞單純培養(yǎng)；②A549細(xì)胞（miR‐506‐inhibi-tor）組：轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor的A549細(xì)胞單純培養(yǎng)；③白藜蘆醇30 μmol/L（miR‐506‐inhibitor）組：A549細(xì)胞（miR‐506‐inhibitor）使用濃度為30μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h；④白藜蘆醇50μmol/L（miR‐506‐inhibitor）組：A549細(xì) 胞（miR‐506‐inhibi-tor）使用濃度為50 μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h；⑤白 藜蘆醇100 μmol/L（miR‐506‐inhibitor）組：A549細(xì) 胞（miR‐506‐inhibitor）使 用 濃 度 為100μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h或48 h。

1.2.3 CCK‐8法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖按CCK‐8實(shí)驗(yàn)說明書操作，細(xì)胞分別孵育24 h、48 h后加入CCK‐8顯色液，于培養(yǎng)箱中孵育100 min后細(xì)胞培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中讀取各孔450 nm處吸光度值。每個(gè)時(shí)間段設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞周期收集各組細(xì)胞，使用70%的甲醇固定，離心，洗滌細(xì)胞后加入500μl PI/RNase染料孵育后，使用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)說明書使用Annexin V‐FITC和PI雙標(biāo)記免疫熒光染色，流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，用一波長(zhǎng)為515 nm的熒光通道檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于560 nm的熒光通道檢測(cè)PI值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 qRT‐PCR檢 測(cè)A549細(xì) 胞miR‐506及SPHK1 miR‐506引 物 序 列：上 游5'‐TATTCAG-GAAGGTGTTACTTAA‐3'，下 游5'‐CGCAGGGTCC-GAGGTATTC‐3'。SPHK1引 物 序 列：上 游5'‐GC-GCTTCACTCTGGGCACCTTCC‐3'，下游5'‐GTCCTC-GTCGGGCACCACTGTCC‐3'。miR‐506的內(nèi)參U6引物序列：上游5'‐CTCGCTTCGGCAGCACA‐3'，下游5'‐AACGCTTCACGAATTTGCGT‐3'。SPHK1的內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5'‐CAAATTCCATGGCACC-GTCA‐3'，下游5'‐GACTCCACGACGTACTCAGC‐3'。收集各組細(xì)胞，根據(jù)說明書裂解細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞SPHK1收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，按照使用說明書提取蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，煮沸使蛋白變性，按照凝膠試劑說明書及檢測(cè)指標(biāo)的分子量大小，配置相應(yīng)濃度的蛋白膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，按照抗體說明書推薦的稀釋比，稀釋相應(yīng)抗體，SPHK1一抗室溫?fù)u床孵育2 h，HRP標(biāo)記的二抗室溫?fù)u床孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值計(jì)算，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水平以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇抑制A549細(xì)胞增殖CCK‐8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各白藜蘆醇干預(yù)組對(duì)A549細(xì)胞的增殖均有抑制作用，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。并且白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞的增殖作用和白藜蘆醇的藥物濃度及干預(yù)時(shí)間密切相關(guān)。其中30 μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)24 h對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用最弱，100 μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)48 h對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用最明顯。見圖1。

2.2 白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后使大部分細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0‐G1階段，少部分細(xì)胞停滯在G2‐M階段和S階段，并且白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞周期的影響在48 h更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 白藜蘆醇抑制A549細(xì)胞增殖的抑制率Fig.1 Inhibition rate of A549 cultivated with resveratrol

2.3 白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示：各白藜蘆醇干預(yù)組均能誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中100μmol/L的白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞48 h組凋亡的細(xì)胞數(shù)量最多，呈現(xiàn)濃度時(shí)間依賴性。見圖3。

2.4 白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞miR‐506表達(dá)的影響qRT‐PCR法檢測(cè)A549細(xì)胞miR‐506表達(dá)情況，結(jié)果顯示：白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后，使A549細(xì)胞中的miR‐506表達(dá)明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞24 h時(shí)間點(diǎn)，100μmol/L濃度組上調(diào)miR‐506的表達(dá)量最多；白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞48 h時(shí)間點(diǎn)，30μmol/L濃度組上調(diào)miR‐506的表達(dá)量最多。miR‐506‐in-hibitor轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后使miR‐506的表達(dá)量下降，使用白藜蘆醇干預(yù)miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞后，miR‐506表達(dá)量明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4、5。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effects of resveratrol on A549 cell cycle tested by flow cytometry

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of resveratrol on A549 cell apoptosis tested by flow cytometry

2.5 白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞SPHK1 mRNA表達(dá)的影響qRT‐PCR法檢測(cè)A549細(xì)胞SPHK1 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后，可以使SPHK1 mRNA的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染組，沉默miR‐506使SPHK1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但白藜蘆醇干預(yù)miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后能夠使SPHK1 mRNA表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6、7。

圖4 qRT‐PCR檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞miR‐506的影響Fig.4 Effect of resveratrol on miR‐506 in A549 cells de-tected by qRT‐PCR

圖5 qRT‐PCR檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor的A549細(xì)胞miR‐506的影響Fig.5 Effect of resveratrol on miR‐506‐inhibitor trans-fected A549 cells detected by qRT‐PCR

圖6 qRT‐PCR檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞SPHK1 mRNA的影響Fig.6 Effect of resveratrol on SPHK1 mRNA expression in A549 cells by qRT‐PCR

2.6 白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞SPHK1蛋白表達(dá)的影響Western blot法檢測(cè)A549細(xì)胞SPHK1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后，SPHK1蛋白表達(dá)水平降低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染組，沉默miR‐506后SPHK1蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。但白藜蘆醇干預(yù)miR‐506‐in-hibitor轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠使SPHK1蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖8、9。

圖7 qRT‐PCR檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor的A549細(xì)胞SPHK1 mRNA的影響Fig.7 Effect of resveratrol on mRNA expression of SPHK1 in A549 cells transfected with miR‐506‐in-hibitor by qRT‐PCR

圖8 Western blot檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞SPHK1蛋白的影響Fig.8 Effect of resveratrol on SPHK1 protein in A549 cells by Western blot

圖9 Western blot檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)轉(zhuǎn)染miR‐506‐inhibitor的A549細(xì)胞SPHK1的蛋白的影響Fig.9 Effect of resveratrol on expression of SPHK1 pro-tein in A549 cells transfected with miR‐506‐inhibi-tor by Western blot

3 討論

已有研究表明，白藜蘆醇可以抑制人類宮頸癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［11‐14］。YU等［15］的研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過抑制miR‐520‐h‐PP2A/C‐Akt‐NF‐B‐grade FOXC2通路從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖。另一項(xiàng)研究中，BAE等［16］通過miRNA表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后能使71個(gè)miRNAs的表達(dá)量增加，并且這些miRNAs直接影響肺癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和凋亡。

在我們的前期研究中，miR‐506的表達(dá)量在NSCLC中明顯減少［8］。上調(diào)miR‐506可以有效抑制NSCLC的增殖及侵襲，MMP‐9和MMP‐2的表達(dá)也明顯被抑制［8］。此外，還發(fā)現(xiàn)SPHK1是miR‐506的一個(gè)直接靶點(diǎn)，通過作用于SPHK1，miR‐506的上調(diào)可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲，并且促進(jìn)NSCLC的凋亡［8］。

目前白藜蘆醇治療NSCLC的機(jī)制尚未完全闡明，我們的實(shí)驗(yàn)首先證實(shí)了白藜蘆醇能夠抑制A549細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，并且白藜蘆醇抑制A549細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡具有濃度和時(shí)間依賴性。白藜蘆醇干預(yù)后大部分A549細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0‐G1階段。qRT‐PCR結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)組均能使A549細(xì)胞的miR‐506表達(dá)量上調(diào)；使用miR‐506‐shRNA轉(zhuǎn)染沉默miR‐506后，白藜蘆醇亦能明顯提高miR‐506的表達(dá)；總的來說白藜蘆醇能有效提高miR‐506的表達(dá)量。TIAN等［17］研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過調(diào)控SPHK1/（sphingosine‐1‐phosphate，S1P）通路和神經(jīng)酰胺表達(dá)量從而抑制白血病細(xì)胞株K562的增殖及誘導(dǎo)其凋亡。我們通過qRT‐PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞的SPHK1，結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后SPHK1，mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少，白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后SPHK1蛋白表達(dá)量亦較對(duì)照組明顯減少，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果和TIAN等［12］的研究結(jié)果一致；并且使用miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn)染沉默miR‐506后白藜 蘆 醇 干 預(yù)miR‐506‐inhibitor轉(zhuǎn) 染 組SPHK1的mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯下降，大體上說明白藜蘆醇可以抑制A549細(xì)胞的SPHK1表達(dá)。結(jié)果表明白藜蘆醇可能通過調(diào)控miR‐506和SPHK1從而抑制A549細(xì)胞的增殖且促進(jìn)其凋亡。

LI等［18］的 研 究 表 明 上 調(diào)miR‐506可 能 通 過SPHK1/Akt/NF‐κB通路抑制胰腺癌的進(jìn)展且降低其耐藥性，提示在胰腺癌中SPHK1是miR‐506的調(diào)控靶點(diǎn)。我們的前期研究與其他研究均表明，上調(diào)miR‐506可以通過作用于SPHK1逆轉(zhuǎn)NSCLC和胰腺癌的增殖且促進(jìn)其凋亡［8，18］。在本研究中白藜蘆醇可以抑制A549細(xì)胞的增殖同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡，此外白藜蘆醇可以上調(diào)miR‐506和降低SPHK1的表達(dá)水平，因此我們認(rèn)為白藜蘆醇可以通過靶向調(diào)控miR‐506/SPHK1從而有效抑制NSCLC。

綜上所述，白藜蘆醇可以抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上述作用的強(qiáng)弱與白藜蘆醇的藥物濃度及白藜蘆醇的作用時(shí)間密切相關(guān)；通過進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過提高miR‐506的表達(dá)從而抑制SPHK1的表達(dá)進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的增殖且誘導(dǎo)其凋亡。miR‐506/SPHK1信號(hào)通路可能是白藜蘆醇發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一，為白藜蘆醇的抗腫瘤治療提供新的理論依據(jù)。