戴 睿 林 萍 宋精玲 周 瑩 楊 耘 唐 瑩
(昆明醫(yī)科大學(xué)科技成果孵化中心電子顯微鏡室,昆明650500)
乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一,早期以手術(shù)切除以及放化療等傳統(tǒng)方法為主,但易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、易產(chǎn)生抗性和毒副作用大。新出現(xiàn)的靶向治療特異性強,毒副作用小,成為乳腺癌新的治療方法[1-2]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA,研究發(fā)現(xiàn)其參與乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移,也參與細胞耐藥和抵抗等,可作為臨床診斷、預(yù)后標(biāo)志及有效的治療靶點[3-5]。有研究報道m(xù)iR-541-3p在非小細胞肺癌組織和血漿中下調(diào)表達,與TNM分期和術(shù)后生存期相關(guān),過表達miR-541-3p通過靶向轉(zhuǎn)化生長影響因子2(transform growth interacting factor 2,TGIF2)抑制非小細胞肺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-541-3p在神經(jīng)病理性疼痛大鼠海馬中下調(diào)表達[7]。包含1個基因的SPOC結(jié)構(gòu)域(SPOC domain containing 1 gene,SPOCD1)是屬于S-Ⅱ(TFⅡS)家族的轉(zhuǎn)錄因子,有研究報道SPOCD1在胃腫瘤中過表達,敲除SPOCD1減少了胃癌細胞增殖,遷移和侵襲,以及裸鼠中異種移植腫瘤的生長[8]。SPOCD1在人咀嚼黏膜傷口愈合期間顯著上調(diào)表達[9]。然而miR-541-3p和SPOCD1在乳腺癌中的表達及其對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響尚未闡明。本實驗旨在研究miR-541-3p和SPOCD1對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及miR-541-3p是否通過調(diào)控SPOCD1影響乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。
1.1 材料 正常乳腺上皮細胞MCF-10A和乳腺癌細胞MCF-7、T47D、Bcap-37購自美國菌種保藏中心(ATCC);胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司;RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒購自上海純優(yōu)生物科技有限公司;MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin VFITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司;抗體購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司;Transwell小室、Matrigel膠購自北京明陽科華生物科技有限公司;miRcon、miR-541-3p、anti-miR-con、anti-miR-541-3p、sicon、si-SPOCD1、pcDNA-con、pcDNA-SPOCD1載體質(zhì)粒購自上海斯信生物科技有限公司。Thermo FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司;熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) 正常乳腺上皮細胞MCF-10A和乳腺癌細胞MCF-7、T47D、Bcap-37用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),細胞融和至80%~90%時消化傳代。
1.2.2 細胞處理與分組 取對數(shù)生長期細胞MCF-7無血清培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基,將miR-con、miR-541-3p、anti-miR-con、anti-miR-541-3p、si-con、si-SPOCD1分別轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞中,分別記為miRcon組、miR-541-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-541-3p組、si-con組、si-SPOCD1組;將miR-541-3p質(zhì)粒分別與pcDNA-con、pcDNA-SPOCD1共轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞中,分別記為miR-541-3p+pcDNA-con組、miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1組。
1.2.3 RT-qPCR檢測miR-541-3p和SPOCD1 mRNA表達水平 提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行PCR,每個樣品設(shè)3個復(fù)孔,反應(yīng)條件為95℃3 min,95℃15 s,60℃30 s,72℃30 s,共40個循環(huán);相對表達量用2-ΔΔCt計算。miR-541-3p和SPOCD1分別以U6和β-actin為內(nèi)參,miR-541-3p上游引物序列:5'-GCGGATCCAGTTTCCAGAACACCCAGAT-3',下游引物序列:5'-GCAAGCTTAAAAAACGACAAGCACGTCATAGA-3';U6上游引物序列:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3',下游引物序列:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。SPOCD1上游引物序列:5'-CTCCCCAAGTTGCTGACCTG-3',下游引物序列:5'-CCCCTGTAGCGGGCAAATATC-3';βactin上游引物序列:5'-TTACTGCCCTGGCTCCTA-3',下游引物序列:5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3'。
1.2.4 Western blot檢測SPOCD1、CyclinD1、MMP2、MMP9和β-catenin蛋白表達水平 培養(yǎng)48 h后的各組細胞提取總蛋白,BCA試劑盒對蛋白進行定量。通過SDS-PAGE電泳將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉液封閉1 h后加入一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜,Tris鹽吐溫緩沖液(Tris buffer solution tween,TBST)洗膜,加入二抗(1∶2 000)室溫孵育90 min,TBST洗滌3次,ECL發(fā)光液顯影,ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像,Quantity One軟件測定蛋白條帶灰度值,蛋白相對表達水平即為目的條帶和β-actin條帶比值。
1.2.5 MTT檢測細胞存活率 取培養(yǎng)48 h的細胞加入MTT溶液,37℃孵育4 h,加入150μl DMSO,490 nm處用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(OD)值。細胞存活率(%)即為實驗組OD值和空白對照組OD值比值。實驗重復(fù)3次,每次3個復(fù)孔。
1.2.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 細胞遷移實驗:Transwell小室上室和下室中分別加入200μl細胞懸液和500μl RPMI1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后先用4%多聚甲醛固定再用0.1%結(jié)晶紫染色,最后在顯微鏡觀察并拍照,結(jié)晶紫染色細胞數(shù)即為遷移細胞數(shù)。細胞侵襲實驗:先用Matrigel包被Transwell小室的上室,然后按照細胞遷移實驗進行。
1.2.7 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-541-3p對SPOCD1的靶向調(diào)控 構(gòu)建含有miR-541-3p結(jié)合位點的SPOCD1-3′UTR野生型及突變型報告基因載體,在MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染miR-541-3p mimics、野生型及突變型報告基因載體。按照說明書檢測熒光素酶活性,實驗重復(fù)3次。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示,兩組比較行t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
圖1 Western blot檢測SPOCD1蛋白表達Fig.1 Western blot detection of SPOCD1 protein expression
2.1 在乳腺癌細胞系中miR-541-3p和SPOCD1的表達 與正常乳腺上皮細胞MCF-10A相比,乳腺癌細胞MCF-7、T47D、Bcap-37中miR-541-3p表達水平降低,SPOCD1 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)(圖1、表1)。
2.2 過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲 與miR-con組相比,miR-541-3p組乳腺癌細胞MCF-7中miR-541-3p表達水平顯著升高,CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平顯著降低,細胞存活率顯著降低,細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05,圖2、表2)。過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲。
2.3 敲減SPOCD1抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲 與si-con組相比,si-SPOCD1組乳腺癌細胞MCF-7中SPOCD1表達水平顯著降低,CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平顯著降低,細胞存活率顯著降低,細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05,表3、圖3)。可見敲減SPOCD1抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲。
表1 乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞中miR-541-3p、SPOCD1 mRNA和SPOCD1蛋白表達量(±s,n=9)Tab.1 Expressions of miR-541-3p,SPOCD1 mRNA and SPOCD1 protein in breast cancer cells and normal breast epithelial cells(±s,n=9)
表1 乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞中miR-541-3p、SPOCD1 mRNA和SPOCD1蛋白表達量(±s,n=9)Tab.1 Expressions of miR-541-3p,SPOCD1 mRNA and SPOCD1 protein in breast cancer cells and normal breast epithelial cells(±s,n=9)
Note:Compared with MCF-10A,1)P<0.05.
SPOCD1 protein 0.20±0.03 1.12±0.121)0.95±0.101)0.88±0.091)Groups miR-541-3p MCF-10A MCF-7 T47D Bcap-37 1.00±0.12 0.35±0.031)0.40±0.041)0.45±0.051)SPOCD1 mRNA 1.00±0.15 2.01±0.201)1.86±0.191)1.75±0.181)
圖2 過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲Fig.2 Overexpression of miR-541-3p inhibits proliferation,migration and invasion of breast cancer cell MCF-7
表2 過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲(±s,n=9)Tab.2 Overexpression of miR-541-3p inhibitsproliferation,migration and invasion of breast cancer cell MCF-7(±s,n=9)
表2 過表達miR-541-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲(±s,n=9)Tab.2 Overexpression of miR-541-3p inhibitsproliferation,migration and invasion of breast cancer cell MCF-7(±s,n=9)
Note:Compared with miR-con,1)P<0.05.
Number of invasivecells 157.68±15.76 159.63±16.05 92.38±9.251)Groups miR-541-3p CyclinD1 MMP2 MMP9 NC miR-con miR-541-3p 1.00±0.13 1.10±0.12 1.88±0.191)1.20±0.15 1.15±0.12 0.35±0.041)0.98±0.10 0.99±0.11 0.22±0.031)0.88±0.08 0.85±0.08 0.26±0.031)Cell survival rate(%)100.08±10.10 100.35±10.25 54.69±5.451)Number of migratory cells 386.96±38.70 388.53±38.86 183.05±18.321)
2.4 miR-541-3p靶向SPOCD1 Starbase預(yù)測SPOCD1與miR-541-3p存在結(jié)合位點(圖4A)。熒光素酶報告實驗結(jié)果(表4)顯示,與miR-con組相比,miR-541-3p組轉(zhuǎn)染野生型SPOCD1表達載體的細胞MCF-7的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);而轉(zhuǎn)染突變型SPOCD1表達載體的細胞MCF-7的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與miR-con組相比,miR-541-3p組SPOCD1表達水平顯著降低;與antimiR-con組,相比anti-miR-541-3p組SPOCD1表達水平顯著升高(P<0.05)(圖4,表5)。可見,miR-541-3p可靶向調(diào)控SPOCD1的表達。
2.5 高表達SPOCD1可以部分逆轉(zhuǎn)miR-541-3p高表達對MCF-7增殖、遷移和侵襲的影響 與miRcon組相比,miR-541-3p組乳腺癌細胞MCF-7中SPOCD1表達水平顯著降低,CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平顯著降低,細胞存活率顯著降低,細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05);與miR-541-3p+pcDNA-con組相比,miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1組乳腺癌細胞MCF-7中SPOCD1表達水平顯著升高,CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平顯著升高,細胞存活率顯著升高,細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05,圖5、表6)。高表達SPOCD1可以部分逆轉(zhuǎn)miR-541-3p高表達對MCF-7增殖、遷移和侵襲的抑制作用。
表3 敲減SPOCD1抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲(±s,n=9)Tab.3 Knockdown of SPOCD1 inhibits proliferation,migration and invasion of breast cancer cells MCF-7(±s,n=9)
表3 敲減SPOCD1抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲(±s,n=9)Tab.3 Knockdown of SPOCD1 inhibits proliferation,migration and invasion of breast cancer cells MCF-7(±s,n=9)
Note:Compared with si-con,1)P<0.05.
Number of invasivecells 158.96±15.86 155.76±15.89 80.46±8.051)Groups SPOCD1 CyclinD1 MMP2 MMP9 NC si-con si-SPOCD1 1.15±0.12 1.20±0.15 0.38±0.041)1.25±0.13 1.23±0.12 0.36±0.051)1.00±0.10 0.95±0.09 0.33±0.041)0.86±0.08 0.85±0.08 0.20±0.031)Cell survival rate(%)100.35±10.08 100.46±10.28 59.63±6.051)Number of migratory cells 388.32±38.86 384.38±38.45 176.35±17.651)
圖3 Western blot檢 測SPOCD1、CyclinD1、MMP2和MMP9的蛋白表達Fig.3 Western blot detection of protein expressions of SPOCD1,CyclinD1,MMP2 and MMP9
表4 miR-con或miR-541-3p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后雙熒光素酶活性檢測(±s,n=9)Tab.4 Detection of dual luciferase activity after miR-con or miR-541-3p co-transfection with reporter plasmid into MCF-7 cells(±s,n=9)
表4 miR-con或miR-541-3p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后雙熒光素酶活性檢測(±s,n=9)Tab.4 Detection of dual luciferase activity after miR-con or miR-541-3p co-transfection with reporter plasmid into MCF-7 cells(±s,n=9)
Note:Compared with miR-con,1)<0.05.
Groups MUT 1.01±0.12 1.03±0.14 miR-con miR-541-3p luciferaseactivity WT 1.00±0.10 0.36±0.041)
圖4 miR-541-3p靶向調(diào)控SPOCD1表達Fig.4 miR-541-3p targeted regulation of SPOCD1 expression
表5 Western blot檢測SPOCD1的表達(±s,n=9)Tab.5 Western blotdetection of SPOCD1expression(±s,n=9)
表5 Western blot檢測SPOCD1的表達(±s,n=9)Tab.5 Western blotdetection of SPOCD1expression(±s,n=9)
Note:Compared with miR-con,1)P<0.05;compared with anti-miRcon,2)P<0.05.
SPOCD1 1.21±0.13 0.36±0.041)1.18±0.12 1.56±0.162)Groups miR-con miR-541-3p anti-miR-con anti-miR-541-3p
圖5 Western blot檢 測SPOCD1、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達Fig.5 Western blot detection of SPOCD1,CyclinD1,MMP2 and MMP9 protein expression
圖6 Western blot檢測β-catenin蛋白表達Fig.6 Western blot detection ofβ-catenin protein expression
表6 高表達SPOCD1可部分逆轉(zhuǎn)miR-541-3p高表達對MCF-7增殖、遷移和侵襲(±s,n=9)Tab.6 High expression of SPOCD1 can partially reverse high expression of miR-541-3p on proliferation,migration and invasion of MCF-7(±s,n=9)
表6 高表達SPOCD1可部分逆轉(zhuǎn)miR-541-3p高表達對MCF-7增殖、遷移和侵襲(±s,n=9)Tab.6 High expression of SPOCD1 can partially reverse high expression of miR-541-3p on proliferation,migration and invasion of MCF-7(±s,n=9)
Note:Compared with miR-con,1)P<0.05;compared with miR-541-3p+pcDNA-con,2)P<0.05.
Number of invasive cells 160.38±16.05 90.38±9.081)91.35±9.15 121.37±12.152)Groups SPOCD1 CyclinD1 MMP2 MMP9 miR-con miR-541-3p miR-541-3p+pcDNA-con miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1 1.20±0.12 0.32±0.041)0.35±0.05 1.05±0.112)1.18±0.14 0.33±0.041)0.34±0.07 0.96±0.102)1.01±0.10 0.30±0.051)0.32±0.04 0.88±0.092)0.86±0.09 0.22±0.041)0.24±0.05 0.70±0.082)Cell survival rate(%)100.22±10.20 53.75±5.381)52.68±5.27 86.34±9.002)Number of migratory cells 387.25±38.73 184.28±18.431)182.38±18.25 328.69±32.882)
表7 Western blot檢測β-catenin蛋白表達(±s,n=9)Tab.7 Western blot detection ofβ-catenin protein expression(±s,n=9)
表7 Western blot檢測β-catenin蛋白表達(±s,n=9)Tab.7 Western blot detection ofβ-catenin protein expression(±s,n=9)
Note:Compared with miR-con,1)P<0.05;compared with miR-541-3p+pcDNA-con,2)P<0.05.
β-catenin 1.10±0.11 0.40±0.041)0.45±0.05 0.92±0.092)Groups miR-con miR-541-3p miR-541-3p+pcDNA-con miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1
2.6 Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達 與miRcon組相比,miR-541-3p組乳腺癌細胞MCF-7中βcatenin表達水平顯著降低(P<0.05);與miR-541-3p+pcDNA-con組相比,miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1組乳腺癌細胞MCF-7中β-catenin表達水平顯著升高(P<0.05,圖6、表7)??梢?,miR-541-3p過表達抑制Wnt/β-catenin通路的激活,而高表達SPOCD1可以部分逆轉(zhuǎn)miR-541-3p高表達對Wnt/β-catenin通路的抑制作用。
分子靶向治療已在乳腺癌中取得一定進展,并已成為乳腺癌的有效治療手段之一[10]。miRNA是一種參與細胞各種生理過程的小RNA分子,也參與腫瘤的發(fā)展,并可作為腫瘤治療的特異性靶點[11]。有研究報道m(xù)iR-541在肝癌中低表達,過表達miR-541抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲,增加肝癌細胞株對索拉菲尼、阿霉素的敏感性[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LOXL1-AS1通過調(diào)控miR-541-3p和CCND1影響前列腺癌細胞增殖和細胞周期進程[13]。本實驗結(jié)果顯示,在乳腺癌細胞中miR-541-3p表達水平顯著降低,miR-541-3p過表達降低了細胞存活率和細胞遷移、侵襲數(shù)量,降低了CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平。說明miR-541-3p過表達抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。
SPOCD1與腫瘤相關(guān),有研究發(fā)現(xiàn)SPOCD1在膠質(zhì)瘤中高表達,與晚期腫瘤分級和預(yù)后不良有關(guān),敲減SPOCD1可抑制膠質(zhì)瘤U373和U87細胞的增殖、遷移和侵襲[14]。SPOCD1在骨肉瘤細胞系中上調(diào)表達,下調(diào)SPOCD1抑制了MG63和SAOS2骨肉瘤細胞集落的形成和增殖能力,且敲減SPOCD1促進細胞凋亡[15]。本實驗結(jié)果顯示,在乳腺癌細胞中SPOCD1表達水平顯著升高,說明SPOCD1在乳腺癌中也高表達。且敲減SPOCD1降低了細胞存活率和細胞遷移、侵襲數(shù)量,降低了CyclinD1、MMP2、MMP9表達水平。說明敲減SPOCD1可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。SPOCD1在乳腺癌中的作用與在膠質(zhì)瘤和骨肉瘤中的作用相似,說明SPOCD1確實參與腫瘤的進展。且本實驗還發(fā)現(xiàn)miR-541-3p靶向調(diào)控SPOCD1,SPOCD1高表達能部分逆轉(zhuǎn)miR-541-3p高表達對細胞MCF-7增殖、遷移、侵襲的抑制作用。提示,miR-541-3p可能通過調(diào)控SPOCD1影響乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。
研究發(fā)現(xiàn)異?;罨腤nt/β-catenin信號通路參與乳腺癌發(fā)生,其成員分子可作為miRNA的靶基因而受到調(diào)控,影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展[16]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子,βcatenin異常表達活化Wnt/β-catenin信號通路可促進乳腺癌淋巴細胞向腫瘤間質(zhì)浸潤[17]。抑制Wnt/β-catenin信號通路激活可抑制乳腺癌細胞的生長、遷移和侵襲[18]。還有研究報道m(xù)iR-541-3p可能參與介導(dǎo)Wnt信號傳導(dǎo)途徑[19]。本實驗結(jié)果顯示,miR-541-3p過表達時β-catenin表達水平顯著降低,說明miR-541-3p過表達抑制Wnt/β-catenin信號通路。SPOCD1高表達能部分逆轉(zhuǎn)miR-541-3p高表達對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用。提示miR-541-3p可能通過調(diào)控SPOCD1影響Wnt/β-catenin信號通路進而影響乳腺癌細胞的進展。
綜上所述,miR-541-3p過表達可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲,其機制可能與SPOCD1和Wnt/β-catenin信號通路相關(guān),也將為乳腺癌的治療提供新思路和新靶點。