高表達miR-331-3p下調(diào)PI3K/AKT通路抑制人肺癌A549細胞增殖

伊敏努爾·吐爾遜 張 茜 白文梅（新疆自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院呼吸科，烏魯木齊830000）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率增長速度居惡性腫瘤第一位，近年來大氣環(huán)境惡化導(dǎo)致患肺癌發(fā)病率升高［1］。肺癌細胞增殖并轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)、胸膜、腎臟、消化道、骨等部位會加重疾病，影響患者生命安全，因此探究影響肺癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移因素對明確肺癌發(fā)生發(fā)展機制至關(guān)重要［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）可參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3］。miR-331-3p在結(jié)直腸癌中高表達抑制細胞生長，在胃癌中作為腫瘤抑制基因參與調(diào)控細胞增殖，但尚未發(fā)現(xiàn)其在肺癌細胞增殖作用中的研究［4］。本研究通過檢測肺癌A549細胞中miR-331-3p對細胞增殖的影響，并探討其作用機制，以期揭示miR-331-3p在肺癌發(fā)生發(fā)展中作用，為尋找有效生物靶標、實現(xiàn)肺癌控制提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 正常肺上皮BEAS-2B細胞和肺癌A549細胞均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen，貨號：A12861-01、11875101、16000044、11668019）；CCK-8試劑盒（美國GlpBio，貨號：GK10001）；TRIzol（美國Thermo-Fisher，貨號：S0001）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡProbe QPCR Mix（美國Fermentas，貨號：K1622、RR391S）；多聚甲醛（上海信凱生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號：30525-89-4）；Gimsa染液（上海研載生物科技有限公司，貨號：a-03175）；蛋白裂解液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：R0010）；人增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（抗兔）、細胞核相關(guān)抗原（nuclearassociated antigen，Ki67）（抗兔）、脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase B，PI3K）（抗鼠）、蛋白激酶B（protein Kinase B，PKB又稱AKT）（抗兔）、p-AKT（抗兔）、GAPDH（抗鼠）、羊抗兔、羊抗鼠（美國Abcam，貨號：ab152112、ab2438 78、ab140307、ab18785、ab38449、ab9484、ab150077、ab150117）；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（碧云天生物科技有限公司，貨號：P0203）；siR-PI3K、siRNA-NC、miR-331-3p mimics、mimics-NC均由廣州銳博生物科技有限公司合成。普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus，型號：UIS2）；實時熒光定量PCR儀（美國ABI，型號：4376600）；酶標儀（美國Bio-Rad，型號：Elx800）；蛋白凝膠成像儀（美國Invitrogen，型號：EGel174）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng)：BEAS-2B添加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基、A5490加入含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，整個過程無菌操作轉(zhuǎn)染，傳2～3代。分別收集對數(shù)期細胞，qRT-PCR檢測miR-331-3p表達水平。A549細胞轉(zhuǎn)染及分組：對數(shù)期A549細胞消化接種于6孔細胞板（1×106個/孔），按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，miR-331-3p實驗分3組：空白組（細胞不做任何處理），mimic陰性對照組（加入5 nmol mimics NC）和miR-331-3p mimics組（加入5 nmol miR-331-3p mimics）。培養(yǎng)箱溫育48 h后，qRT-PCR檢測miR-331-3p表達水平。siRNA-PI3K實驗分為3組：空白組（細胞不做任何處理），siRNA-NC組（加500μl McCoy′s 5A）和siRNAPI3K組（加500μl siRNA-PI3K）。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-331-3p表達水平 按1.2.1處理miR-331-3p實驗組的各細胞，TRIzol法提取總RNA，采用Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，qRT-PCR儀對miR-331-3p、內(nèi)參U6擴增。引物序列miR-331-3p-F：5′-GCGCCCCTGGGCCTATC-3′、miR-331-3p-R：試 劑 盒 中 提 供；U6-F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′、U6-R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。上樣體系：cDNA 1μl（50 ng/μl），F(xiàn)/R（10μmol/L）各0.5μl，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡProbe QPCR Mix 10μl，ddH2O 8.0μl。反應(yīng)條件：95℃90 s，95℃30 s，61℃30 s，45個循環(huán)。2-ΔΔCt法對miR-331-3p、U6、PI3K、GAPDH表達水平定量分析，每組8個重復(fù)。

1.2.3 CCK-8法檢測miR-331-3p對A549細胞增殖的影響 取1.2.1 miR-331-3p實驗分組檢測過的細胞，部分接種至96孔板中（1.0×105個/孔），在培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72 h時，分別加CCK-8試劑，按照說明書操作，酶標儀檢測450 nm下各孔細胞光密度（optic density，OD），每孔8個重復(fù)。

1.2.4 平板細胞克隆實驗檢測miR-331-3p對細胞增殖的影響 取1.2.1 miR-331-3p實驗分組檢測過的細胞，部分制備單細胞懸液，放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～12 d，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，PBS清洗后4%多聚甲醛固定細胞，室溫下放置15 min，0.1%Gimsa染液染色，常溫下干燥，拍照后肉眼計數(shù)細胞克隆數(shù)量，每組8個重復(fù)。

1.2.5 Western blot檢測PCNA、Ki67、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達情況 Western blot檢測的細胞，接種至6孔板中待融合度至90%，去培養(yǎng)液后每孔加200μl蛋白裂解液提細胞總蛋白，PAGE膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應(yīng)加入一抗PCNA、Ki67、PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH，4℃孵育過夜；加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析蛋白表達情況，每組8個重復(fù)。

1.2.6 siR-PI3K實驗檢測miR-331-3p表達水平干擾PI3K后檢測PI3K的蛋白表達情況和miR-331-3p水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)均采用±s表示，比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-331-3p在BEAS-2B、A549中的表達 與正常肺上皮BEAS-2B細胞比較，肺癌A549細胞中miR-331-3p的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 miR-331-3p mimics轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞表達情況 空白組與mimic陰性對照組miR-331-3p差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組、mimic陰性對照組相比，miR-331-3p mimic組miR-331-3p表達水平升高（P＜0.05）。見圖2。

圖1 miR-331-3p在BEAS-2B、A549細胞中的表達比較Fig.1 Comparison of expression of miR-331-3p in BEAS-2B and A549 cells

圖2 miR-331-3p轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞中的表達比較Fig.2 Comparison of expression of miR-331-3p transfected lung cancer A549 cells

2.3 miR-331-3p mimics轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞增殖情況 空白組與mimic陰性對照組OD450差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組、mimic陰性對照組相比，在36 h、48 h、60 h、72 h miR-331-3p mimic組的OD450顯著降低（P＜0.05）。見圖3。

2.4 miR-331-3p mimics轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞克隆形成情況 空白組與mimic陰性對照組細胞克隆數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組、mimic陰性對照組相比，miR-331-3p mimic組細胞克隆數(shù)顯著減少（P＜0.05）。見圖4。

2.5 miR-331-3p mimics轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞對PCNA、Ki67蛋白的影響 與空白組、mimic陰性對照組相比，miR-331-3p mimic組PCNA、Ki67、PI3K、p-AKT蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖5A、B。

圖3 miR-331-3p mimics轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞增殖情況比較Fig.3 Comparison of proliferation of miR-331-3p mimics transfected lung cancer A549 cells

圖4 miR-331-3p mimics轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞克隆形成比較Fig.4 Comparison of clone formation of miR-331-3p mimics transfected lung cancer A549 cells

圖5 miR-331-3p mimic轉(zhuǎn)染肺癌A549對Ki67、PCNA、PI3K、p-AKT蛋白的比較Fig.5 Comparison of Ki67，PCNA，PI3K，p-AKT proteins in miR-331-3p mimics transfected lung cancer A549

圖6 si-PI3K轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞對PI3K蛋白的比較Fig.6 Comparison of PI3K in si-PI3K transfected lung cancer A549

2.6 s i-PI3K轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞檢測PI3K蛋白的表達 空白組與siRNA陰性對照組PI3K蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組、siRNANC組相比，siRNA組PⅠ3K蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖6A、B。

2.7 si-PI3K轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞檢測miR-331-3p的表達 空白組與siRNANC組miR-331-3p差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組、siRNA NC組相比，siRNA組miR-331-3p表達水平升高（P＜0.05）。見圖7。

3 討論

圖7 si-PI3K轉(zhuǎn)染肺癌A549中miR-331-3p的表達比較Fig.7 Comparison of miR-331-3p in si-PI3K transfected lung cancer A549

肺癌可通過病因干預(yù)、肺癌篩查、早期診斷以及康復(fù)預(yù)防控制，提高患者生存率［5］。miRNA是真核生物細胞內(nèi)一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，具有多種生物學(xué)功能，可在細胞增殖等生理過程中發(fā)揮重要作用。miR-21、let-7c、miR-34、miR-143等多種miRNA均在肺癌中異常表達影響肺癌發(fā)生發(fā)展，尋找準確檢測肺癌的miRNA可提高患者生存率［6］。

miR-331-3p在癌癥中發(fā)揮不同作用，在前列腺癌中低表達，上調(diào)miR-331-3p可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和集落，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，在前列腺癌中起抑癌作用；但在肝細胞癌中高表達，隨著肝癌細胞株侵襲轉(zhuǎn)移程度增加表達上調(diào)越明顯，在肝癌中起致癌作用［7-8］。miR-311-3p根據(jù)腫瘤類型不同發(fā)揮不同作用，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549細胞中miR-331-3p表達水平降低，提示肺癌A549細胞中miR-331-3p水平降低可能影響細胞侵襲、遷移、增殖等過程，進而影響肺癌，但具體有待進一步研究。轉(zhuǎn)染miR-331-3p mimics發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p mimic組miR-331-3p表達水平升高，提示A549細胞轉(zhuǎn)染miR-331-3p mimics成功。A549細胞轉(zhuǎn)染miR-331-3p成功后，與空白組、mimic陰性對照組相比，miR-331-3p mimic組在36 h、48 h、60 h、72 h時OD450降低，細胞克隆數(shù)降低，提示高表達miR-331-3p可抑制肺癌細胞增殖、抑制菌落形成，在肺癌中發(fā)揮抑癌作用，在實際研究中可提高miR-331-3p水平進而抑制肺癌進一步增殖，但具體機制尚不清楚。

PCNA可反應(yīng)細胞增殖狀態(tài)，是細胞增殖狀態(tài)的標志性基因，在肺癌A549原位移植瘤模型中高表達，可促進腫瘤形成［9-10］。Ki67是一種與細胞增殖相關(guān)的核抗原，是細胞增殖標記之一，在非小細胞肺癌腫瘤組織中高表達［11］。以上2種蛋白表達水平均可反映細胞增殖情況。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組、mimic陰性對照組相比，miR-331-3p mimic組PCNA、Ki67蛋白表達降低，提示上調(diào)miR-331-3p可降低PCNA、Ki67蛋白表達，抑制細胞增殖，進而延緩肺癌發(fā)展。

PI3K/AKT是細胞促增殖的經(jīng)典信號通路之一，在多數(shù)腫瘤中處于激活狀態(tài)，抑制PI3K/AKT通路可抑制腫瘤細胞的侵襲［12-13］。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的蛋白激酶［14］。腫瘤細胞中表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子中存在酪氨酸激酶或G蛋白偶聯(lián)受體會激活PI3K，引起下游原癌基因AKT活化促進細胞增殖［15］。非小細胞肺癌中失活PI3K/AKT信號通路可以抑制細胞增殖、侵襲和遷移［16］。miR-331-3p在肺癌細胞中是否調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路影響細胞增殖尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-331-3p可抑制PI3K/AKT通路，肺癌中miR-331-3p水平降低促進PI3K及下游AKT活化進而促進細胞增殖；當(dāng)miR-331-3p水平升高時，PI3K活化被抑制，下游信號通路亦受抑制，增殖蛋白表達量降低使肺癌細胞增殖減緩，從而緩解肺癌疾病。進一步探究發(fā)現(xiàn)，干擾PI3K的A549中miR-331-3p表達上調(diào)，說明下調(diào)PI3K的表達可能促進miR-331-3p的相對表達量，但是否存在靶位點有待進一步驗證。

綜上所述，miR-331-3p在肺癌細胞中表達下調(diào)，高表達miR-331-3p可能通過抑制PI3K/AKT通路進而抑制細胞增殖蛋白表達，進而抑制肺癌細胞增殖，表明miR-331-3p可作為潛在靶標應(yīng)用于預(yù)測肺癌，但直接作用位點尚未發(fā)現(xiàn)，且對細胞遷移、侵襲、凋亡情況尚不明確。同時，本研究只研究肺癌中的一個細胞系，且未在動物中驗證其正確性，初步探究miR-331-3p在A549細胞系中增殖情況，存在不足。不同肺癌細胞系中的表達是否類似、在動物模型中的影響是下一步研究的重點。