胰島間充質(zhì)干細(xì)胞通過外泌體內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒抗原誘導(dǎo)NOD鼠自身免疫反應(yīng)①

龔業(yè)莉 歐陽(yáng)禮辰 張 雯 賁亞琍 戴 飏（江漢大學(xué)免疫疾病研究所，武漢430056）

研究胰島自身抗原的細(xì)胞來源有助于理解Ⅰ型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1D）的發(fā)病機(jī)理。由于胰島炎癥常常始發(fā)于胰島周圍，且在胰島中可檢測(cè)到施萬細(xì)胞抗原特異性的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，因此有研究者認(rèn)為胰島周圍的施萬細(xì)胞可能是早期自身免疫靶細(xì)胞［1-2］。其他研究者認(rèn)為胰島內(nèi)皮細(xì)胞可能通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞進(jìn)入胰島的機(jī)制在T1D的發(fā)病早期發(fā)揮作用［3］。有趣的是，將胰島在體外培養(yǎng)能夠擴(kuò)增出一群成纖維樣細(xì)胞，這群細(xì)胞并非來源于分泌胰島素的β細(xì)胞，但可表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的表型標(biāo)志分子如CD105及Sca-1［4］。免疫組化提示CD105+細(xì)胞在正常胰島組織中分布于胰島周邊區(qū)域，但隨著淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)胰島，這群細(xì)胞逐漸進(jìn)入胰島深部、富含β細(xì)胞的區(qū)域。由此判斷，胰島間質(zhì)細(xì)胞有可能參與觸發(fā)或維持胰島局部炎癥反應(yīng)及自身免疫反應(yīng)的過程。課題組前期觀察到體外培養(yǎng)的胰島MSCs能夠分泌具有免疫刺激功能的外泌體，且這些外泌體可激活NOD鼠體內(nèi)所積累的自身免疫反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞。因此，外泌體可能是攜帶自身抗原的載體，能夠在NOD鼠體內(nèi)觸發(fā)自身免疫應(yīng)答［5］。

外泌體是由細(xì)胞分泌的具有生物學(xué)活性的直徑為30～100 nm的微小泡。其存在于多種體液，如血液、唾液、乳汁、尿液及支氣管肺泡灌洗液［6-7］。外泌體為雙層膜結(jié)構(gòu)，且富含膽固醇、鞘磷脂及蛋白質(zhì)，因此其形態(tài)穩(wěn)定并可通過超高速離心或密度梯度離心法從體液中分離得到［8-9］。外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)是近年的研究熱點(diǎn)，研究者希望從體液中分離出外泌體，尋找與疾病發(fā)生相關(guān)的新的標(biāo)志物［10-11］。外泌體生物合成的分子途徑目前尚不明確，可能與多泡體的形成具有共同途徑［12］。多泡體通過與細(xì)胞膜融合的方式將胞內(nèi)形成的外泌體分泌到細(xì)胞外，故外泌體可能攜帶分泌它們的細(xì)胞的特殊分子。本研究試圖探討NOD小鼠胰島細(xì)胞分泌的外泌體是否攜帶誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)和T1D的特殊抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 NOD/ShiLtJ（NOD）及C57BL/6（B6）小鼠均購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室（Bar Harbor，ME）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行均得到江漢大學(xué)免疫疾病研究所及美國(guó)南加州生物醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物管理及使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與試劑 超速離心機(jī)（Sorvall Discovery 90SE；Hitachi）；分光光度儀（Bio-Rad，Hercules，CA）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)系統(tǒng)（Amersham）；膠原酶（Sigma）；抗CD32/CD16抗體（克隆2.4G2，BD Bioscience）；抗CD45抗體（克隆30-F1，BD Bioscience）；抗CD105抗體（克隆MJ/18，BioLegend）；抗Sca-1抗體（克隆D7，BioLegend）；ABC試劑盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA）；OCT復(fù)合物（Sakura Finetek，Torrance，CA）；CBA試劑盒（BD Biosciences）；CFSE染料（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）；HRP標(biāo)記抗IgG二抗（Amersham，GE Healthcare Life Sciences）；鼠抗MLV Gag抗體（抗p15及抗p30山羊血清，ATCC）；抗ERK抗體（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）；RNA提取試劑盒（Qiagen）；cDNA合成試劑盒（Thermal Fisher）；PCR Supermix（Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 胰島分離培養(yǎng)及胰島細(xì)胞的流式分選 分離NOD小鼠的胰島采用LEITER等［13］報(bào)道的方法。簡(jiǎn)單敘述如下：將處死后的小鼠打開腹腔，在解剖顯微鏡下通過膽總管向小鼠胰腺灌注3 ml 0.46 mg/ml的膠原酶，隨后取出胰腺組織。將灌注的胰腺組織置于37℃水浴鍋消化25 min，劇烈振蕩以分離胰腺組織及細(xì)胞，在解剖鏡下挑取單個(gè)胰島細(xì)胞團(tuán)。如需培養(yǎng)胰島MSCs，先以PBS清洗分離的胰島細(xì)胞團(tuán)2次，再接種于高糖DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及6 mmol/L L-谷氨酰胺。培養(yǎng)的第1周無需更換培養(yǎng)液，增殖的MSCs為貼壁的纖維狀細(xì)胞。如需制備胰島單細(xì)胞懸液以進(jìn)行流式分析，將分離的胰島細(xì)胞團(tuán)置于0.5 ml 0.05%的胰酶-EDTA，37℃水浴2 min，通過吸管反復(fù)吹打以分離單個(gè)細(xì)胞。PBS清洗2次后，加入抗CD32/CD16抗體以封閉Fc受體，再加入PE標(biāo)記的抗CD45抗體及APC標(biāo)記1∶100稀釋的抗CD105或Sca-1抗體置于冰上孵育45 min。加入PBS清洗后重懸于0.5 ml 1%BSA/PBS中進(jìn)行流式分析或分選。

1.2.2 外泌體制備 所有用于細(xì)胞培養(yǎng)的小牛血清均需預(yù)先在100 000 g下離心90 min以去除外泌體。收集體外培養(yǎng)的胰島MSCs第2至第10代的細(xì)胞培養(yǎng)上清。將上清于300 g離心20 min，取上清再次于4℃、10 000 g離心20 min，離心后的上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾去除大直徑囊泡，于100 000 g離心90 min收集外泌體。PBS清洗1次后將外泌體重懸于PBS。Bradford實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白濃度。1 L胰島MSCs培養(yǎng)上清中約可收集到0.5～1.0 mg外泌體。

1.2.3 免疫組化及電鏡檢測(cè) 將胰腺組織包埋于OCT復(fù)合物并于-80℃儲(chǔ)存。制成的冰凍切片（厚度8μm）先用親和素和生物素封閉，再加入生物素標(biāo)記的一抗孵育過夜。清洗切片后，加入HRP標(biāo)記鏈霉親和素共孵育。最后用標(biāo)準(zhǔn)ABC試劑盒對(duì)切片進(jìn)行顯色。將切片用蘇木精復(fù)染，染色后細(xì)胞核為藍(lán)色，而與一抗結(jié)合的細(xì)胞為紅色。外泌體的形態(tài)通過透射電鏡檢查。首先將外泌體固定于2%戊二醛，清洗后用2%醋酸鈾對(duì)其染色，然后包埋于0.8%醋酸鈾與0.13%甲基纖維素混合物進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.4 細(xì)胞因子檢測(cè)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞釋放的IFN-γ采用一種基于顆粒的細(xì)胞因子檢測(cè)方法，此方法通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，敏感度高達(dá)5～10 pg/ml。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出每組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度。細(xì)胞增殖通過細(xì)胞染料CFSE檢測(cè)，簡(jiǎn)述如下：在脾細(xì)胞重懸液（1×107個(gè)/ml PBS）中加入5μmol/L CFSE染料，37℃水浴孵育10 min，清洗后重懸于等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基，再將其接種于96孔板（8×105個(gè)/孔），與外泌體共同培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，用熒光標(biāo)記B220抗體及CD4抗體染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFSE染色陰性的增殖細(xì)胞。

1.2.5 Western blot 裂解細(xì)胞后，按照文獻(xiàn)中報(bào)道的SDS-PAGE方法分離細(xì)胞裂解液中蛋白［14］。溶于PBS的外泌體直接用于SDS-PAGE分析。在所有樣本中加入5×SDS上樣緩沖液，并于95℃加熱10 min使蛋白變性。將分離的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜后，加入1μg/ml或1∶1 000稀釋一抗在室溫下孵育1 h，再加入HRP標(biāo)記抗IgG二抗。通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)系統(tǒng)檢查蛋白條帶。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)胰島ERV表達(dá) 在分選或未分選的胰島組織中加入RTL裂解液。提取上述細(xì)胞或組織的總RNA并溶于無RNA酶水。采用cDNA合成試劑盒中的隨機(jī)引物合成單鏈cDNA。隨后以cDNA為模板采用PCR Supermix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：ERV Gag F：5′-CCCGATCTGCCC TTTACCC-3′，R：5′-CTTTTACCTTGGCCAAATTGG-3′；IFN-αF：5′-GGACTTTGGATTCCCGCAGGAGAAG-3′，R：5′-GCTGCATCAGACAGCCTTGCAGGTC-3′；GAPDH F：5′-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC-3′，R：5′-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3′。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s；共進(jìn)行12個(gè)循環(huán)；然后94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s；共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果

2.1 胰島MSCs的培養(yǎng)及鑒定 8～10周NOD雌性小鼠的胰島如圖1A，將其接種于高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2周后觀察到成纖維樣的基質(zhì)細(xì)胞如圖1B，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表達(dá)MSCs的表面標(biāo)志分子，如CD44、CD90、CD81、CD105和Sca-1（結(jié)果未顯示），因此將這群細(xì)胞稱為胰島MSCs。流式細(xì)胞術(shù)分析新鮮的NOD小鼠胰島單細(xì)胞懸液結(jié)果表明，在8周小鼠的胰島中CD105+細(xì)胞約占CD45－細(xì)胞的2%～5%（圖1C），且這些細(xì)胞中80%以上表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志分子Sca-1，證實(shí)這群CD105+Sca-1+細(xì)胞為主要的胰島MSCs。免疫組化結(jié)果表明，CD105+細(xì)胞主要聚集于胰島組織外周，這些細(xì)胞伴隨淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)而進(jìn)入β細(xì)胞區(qū)域（圖1D）。且這些細(xì)胞似乎在引導(dǎo)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)并首先出現(xiàn)在無淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的胰島深部區(qū)域。

2.2 NOD來源的外泌體較B6來源的外泌體具有更強(qiáng)的免疫刺激作用 電鏡下2種外泌體無明顯形態(tài)上的差異（圖2A），但在刺激NOD小鼠脾細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子上存在顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脾細(xì)胞與NOD外泌體共培養(yǎng)48 h后，約有4.3%的B220+細(xì)胞被激活并增殖，而與B6外泌體共培養(yǎng)后增殖的細(xì)胞小于1.9%（圖2B）。對(duì)培養(yǎng)的脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的CD4+T細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，相比B6來源外泌體（1.6%），NOD來源外泌體（10.2%）能更有效地激活I(lǐng)FN-γ分泌（圖2C）。以上結(jié)果提示NOD來源外泌體較B6來源外泌體具有更強(qiáng)的免疫刺激作用。

圖1 胰島MSCs的鑒定Fig.1 Identification of islet MSCs

圖2 NOD鼠來源的外泌體比B6鼠來源的外泌體具有更強(qiáng)的免疫刺激性Fig.2 Exosomes derived from NOD mice have stronger immune-stimulatory function than exosomes from B6 mice

圖3 NOD來源的外泌體表達(dá)ERV Gag蛋白Fig.3 NOD-derived exosomes express ERV Gag protein

2.3 NOD來源的外泌體表達(dá)ERV病毒的Gag抗原 由圖3A可知，NOD來源的MSCs及MIN6細(xì)胞均表達(dá)ERV Gag p15及p30抗原，但B6來源的MSCs不表達(dá)該抗原。同樣，NOD及MIN6來源外泌體表達(dá)p15抗原，而B6來源外泌體不表達(dá)（圖3B）。此結(jié)果明確顯示僅NOD來源的MSCs和外泌體表達(dá)這種內(nèi)源性病毒抗原，提示表達(dá)ERV抗原可能參與外泌體誘導(dǎo)的免疫刺激效應(yīng)。

圖4 表達(dá)ERV Gag基因的胰島細(xì)胞主要為干細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞Fig.4 Gag-expressing cells in islets are mainly stem cells and stromal cells

2.4 胰島CD105+間質(zhì)細(xì)胞，而非CD45+造血細(xì)胞或淋巴細(xì)胞表達(dá)ERV Gag基因 如圖4A所示，NOD胰島單個(gè)細(xì)胞染色可分離出CD45陽(yáng)性的血源性細(xì)胞或CD105單陽(yáng)性的組織間質(zhì)細(xì)胞。由圖4B可知，CD45+及CD105+細(xì)胞均表達(dá)IFN-α基因，而僅CD105+細(xì)胞而非CD45+細(xì)胞表達(dá)Gag基因。表明胰島中表達(dá)ERV Gag基因的細(xì)胞為間質(zhì)細(xì)胞，而非浸潤(rùn)胰島的淋巴細(xì)胞。

3 討論

T1D是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，但其確切發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，患者一旦確診需終身依賴胰島素治療，這種終身治療方式給患者及家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。因此，找到T1D的確切發(fā)病機(jī)制，特別是觸發(fā)疾病的初始細(xì)胞和T細(xì)胞抗原，可能為其治療帶來曙光。課題組前期發(fā)現(xiàn)細(xì)胞釋放的外泌體在激活或調(diào)控免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用［14］。本研究發(fā)現(xiàn)胰島組織也存在一群MSCs，這群細(xì)胞能夠釋放外泌體。通過比較NOD小鼠及B6小鼠胰島MSCs分泌的外泌體的免疫原性發(fā)現(xiàn)NOD鼠MSCs分泌的外泌體比B6小鼠MSCs分泌的外泌體具有更強(qiáng)的免疫刺激作用，能夠激活NOD小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ并刺激部分B220細(xì)胞增殖，提示NOD鼠胰島MSCs分泌的外泌體在觸發(fā)T1D自身免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。

外泌體攜帶的蛋白抗原是其實(shí)現(xiàn)激活免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。課題組前期結(jié)果提示胰島瘤細(xì)胞系MIN6釋放的外泌體中存在大量ERV抗原［15］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NOD小鼠而非B6小鼠胰島來源的MSCs或外泌體同樣表達(dá)這類ERV Gag抗原，且表達(dá)ERV抗原的細(xì)胞僅局限于CD45－CD105+的間質(zhì)細(xì)胞，與其他研究組的報(bào)道一致，既往報(bào)道NOD鼠而非T1D抵抗小鼠的胰島中存在反轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒［16-17］。NOD來源的外泌體刺激NOD脾細(xì)胞分泌IFN-γ，Gag抗原可能參與此過程，因?yàn)锽6來源的外泌體不表達(dá)Gag抗原也不具備激活I(lǐng)FN-γ的能力，且B6的脾細(xì)胞并不對(duì)NOD來源的外泌體產(chǎn)生類似的反應(yīng)。NOD小鼠富含分泌IFN-γ的T細(xì)胞，可以判斷Gag抗原可能通過激活這些T細(xì)胞誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，這一結(jié)論同樣在本課題組前期敲除外泌體中Gag抗原的實(shí)驗(yàn)中得到支持［15］。除T細(xì)胞反應(yīng)之外，課題組同時(shí)觀察到NOD來源的外泌體還能有效地激活B細(xì)胞，被激活的B細(xì)胞應(yīng)該同樣為自身反應(yīng)性細(xì)胞，因?yàn)锽6來源的脾細(xì)胞不能被外泌體激活。課題組前期發(fā)現(xiàn)NOD小鼠脾臟邊緣區(qū)B細(xì)胞能夠在缺乏T細(xì)胞的情況下對(duì)外泌體產(chǎn)生應(yīng)答，且8～12周NOD雌鼠中能夠?qū)ν饷隗w產(chǎn)生應(yīng)答的B細(xì)胞數(shù)量顯著高于雄鼠，提示外泌體誘導(dǎo)的非T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞應(yīng)答在T1D的發(fā)病中發(fā)揮作用［18］。一般認(rèn)為自身反應(yīng)性B細(xì)胞主要通過其有效的抗原遞呈功能參與誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的產(chǎn)生［19］。值得注意的是，這群自身反應(yīng)性B細(xì)胞在識(shí)別外泌體的過程中同時(shí)需要TLR和BCR信號(hào)途徑滿足非T細(xì)胞依賴的特性，提示NOD外泌體可能同時(shí)攜帶天然免疫和自身免疫性抗原。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NOD小鼠MSCs分泌的外泌體能夠刺激部分B220+細(xì)胞增殖，其刺激能力顯著高于B6小鼠MSCs分泌的外泌體。推測(cè)NOD小鼠MSCs來源外泌體攜帶的抗原，如ERV膜抗原可能在T1D早期B細(xì)胞的激活中發(fā)揮重要作用。

目前對(duì)ERVs是如何參與誘導(dǎo)胰島特異性的自身免疫反應(yīng)的問題尚未明確。人類ERV包膜蛋白Syncytin可通過外泌體方式被釋放到胎盤中，其在母胎免疫耐受中可能扮演重要作用［20］。有趣的是T1D患者的胰島也會(huì)表達(dá)ERV抗原，不過是人源的ERV［21］。由于細(xì)胞能夠表達(dá)缺陷性ERV中的部分完整基因，這類病毒抗原可能通過外泌體的方式被釋放到細(xì)胞外并參與免疫激活或調(diào)控。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NOD小鼠胰島干細(xì)胞分泌的外泌體表達(dá)ERV Gag抗原，并具有較強(qiáng)的免疫原性，提示外泌體可能模擬類病毒誘導(dǎo)抗ERV抗原的免疫刺激應(yīng)答，為進(jìn)一步研究ERV Gag在NOD小鼠糖尿病發(fā)病中的作用奠定基礎(chǔ)。后續(xù)研究工作將集中在從NOD小鼠，特別是胰島MSCs中分離和鑒定Gag抗原來研究那些能識(shí)別該抗原及多肽的T細(xì)胞，并檢測(cè)其在誘發(fā)自身免疫反應(yīng)和糖尿病過程中的關(guān)鍵作用。