miR-503-5p靶向VEGFA基因通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控人絨毛膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

謝迎春 鄧 丹 張玉梅 王 琴（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科檢查室，貴陽(yáng)550001）

絨毛膜癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，多繼發(fā)于葡萄胎、流產(chǎn)以后，少數(shù)發(fā)生于妊娠后［1］。絨毛膜癌的治療主要采用手術(shù)切除和化療，但手術(shù)治療創(chuàng)傷大，而化療副作用多［2］。尋找絨毛膜癌的新型分子治療靶點(diǎn)一直是領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子單鏈非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用［3］。研究顯示，miR-503-5p參與卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［4］。目前，miR-503-5p對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制還未知。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）是miR-503-5p的靶基因。VEGFA是促血管生長(zhǎng)因子家族成員，參與腫瘤血管生成，在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［5-7］。本研究以miR-503-5p/VEGFA軸為切入點(diǎn)，探討miR-503-5p對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機(jī)制，以期為人絨毛膜癌的靶向分子治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/Svneo、人絨膜癌細(xì)胞系JEG-3、BeWo和JAR（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），四甲基噻唑藍(lán)（methylthiazoletrazolium，MTT）和胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司），Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），PCR引物（上海生工生物工程有限公司），細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase，p-PI3K）、磷酸化的蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）抗體（北京中杉金橋生物試劑公司），二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），miR-503-5p模擬物（mimics）、miR-503-5p抑制劑、VEGFA的小干擾RNA（廣州銳博生物科技有限公司），雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/Svneo、人絨膜癌細(xì)胞系JEG-3、BeWo和JAR，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中。每隔1 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基。細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的JEG-3細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至60%時(shí)，更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說(shuō)明，分別將miR-503-5p mimcs（miR-503-5p組）、模擬物陰性對(duì)照（miRNC組）、miR-503-5p抑制劑（anti-miR-503-5p組）、抑制劑對(duì)照（anti-miR-NC組）、VEGFA的小干擾RNA（si-VEGFA組）、小干擾RNA陰性對(duì)照（si-NC組）、miR-503-5p mimcs與VEGFA過(guò)表達(dá)載體（miR-503-5p+pcDNA-VEGFA組）、miR-503-5p mimcs與空載體（miR-503-5p+pcDNA組）轉(zhuǎn)染至JEG-3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中miR-503-5p和VEGFA mRNA表達(dá)水平 各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞。PBS清洗后，Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA。微量核酸儀檢測(cè)RNA的純度和濃度，RNA溶液在260 nm處的吸光度值（absorbance，A）與280 nm處的A的比值（A260nm/A280nm）處于1.8～2.0范圍說(shuō)明純度較好。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-503-5p上游5'-GGTCCGCGTAAGTGCAGAAGA-3'，下 游5'-GAGGTTCCGCGCTAGATCCGTC-3'；VEGFA上 游5'-GGGTTTAGACAAATGCTAG-3'，下 游5'-AAGTAGCGCGCVCATAGTT-3'；U6上游5'-ATGATAGTCGCTAGTCTGATC-3'，下 游5'-TTGACCGTAGCTGTATTTTGA-3'；GAPDH上游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下 游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。miR-503-5p以U6為內(nèi)參，VEGFA以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-503-5p和VEGFA mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中VEGFA、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白水平 各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞。PBS清洗后，加入RIPA蛋白裂解液，提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取適量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每泳道30μg蛋白。電泳后，電轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯二氟膜。然后將聚偏乙烯二氟膜置于5%脫脂牛奶中，封閉1 h。分別加入VEGFA（稀釋度1∶800）、CyclinD1（稀釋度1∶400）、MMP2（稀釋度1∶600）和MMP9（稀釋度1∶600）抗體，4℃孵育過(guò)夜。第2天，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（稀釋度1∶200），37℃孵育1 h。加入ELC顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入20μl的MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲基亞砜，輕輕振蕩混勻，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度值（OD）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力 各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為5×104個(gè)/ml。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：水化后的Transwell上室加入100μl細(xì)胞懸液，下室加入500μl含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗后，0.4%結(jié)晶紫染色15 min。然后置于倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：先將Matrigel基質(zhì)膠用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋（比例1∶8），鋪于Transwell上室。自然晾干后，再加入100μl細(xì)胞懸液，后續(xù)操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-503-5p與VEGFA靶向關(guān)系 starbase生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，VEGFA的3'非翻譯區(qū)（3'untranslated region，3'UTR）含有與miR-503-5p互補(bǔ)的核苷酸序列。由上海捷瑞生物工程有限公司合成VEGFA的3'UTR，并插入pGL3-Promoter質(zhì)粒載體中，將該重組質(zhì)粒命名為VEGFA-WT。利用定點(diǎn)突變技術(shù)將含miR-503-5p結(jié)合位點(diǎn)的VEGFA的3'UTR位點(diǎn)突變后，插入pGL3-Promoter質(zhì)粒載體中，將該重組質(zhì)粒命名為VEGFA-MUT。分別將VEGFA-WT、VEGFA-MUT與miR-503-5p mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染至JEG-3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，收集細(xì)胞。參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)熒光素酶活性。各組的熒光素酶活性以熒光蟲(chóng)活性/海腎熒光強(qiáng)度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人絨膜癌細(xì)胞系中miR-503-5p和VEGFA表達(dá)水平 與HTR8/Svneo細(xì)胞比較，人絨膜癌細(xì)胞系JEG-3、BeWo和JAR中miR-503-5p水平均降低（P＜0.05），VEGFA mRNA和蛋白水平均升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-503-5p對(duì)人絨膜癌細(xì)胞JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-503-5p組miR-503-5p水平升高（P＜0.05），說(shuō)明miR-503-5p mimics轉(zhuǎn)染成功，JEG-3細(xì)胞中miR-503-5p過(guò)表達(dá)。與miR-NC組比較，miR-503-5p組JEG-3細(xì)胞48 h和72 h OD值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 敲減VEGFA對(duì)人絨膜癌細(xì)胞JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-VEGFA組VEGFA蛋白水平降低（P＜0.05），說(shuō)明VEGFA小干擾RNA轉(zhuǎn)染成功，JEG-3細(xì)胞中VEGFA表達(dá)敲低。與si-NC組比較，si-VEGFA組JEG-3細(xì)胞48 h和72 h OD值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 miR-503-5p靶向調(diào)控VEGFA表達(dá) starbase生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，VEGFA的3'UTR存在與miR-503-5p核苷酸序列結(jié)合的連續(xù)位點(diǎn)。miR-503-5p組共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-VEGFA的細(xì)胞熒光素酶活性低于miR-NC（P＜0.05），而miR-503-5p組共轉(zhuǎn)染MUTVEGFA的細(xì)胞熒光素酶活性與miR-NC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。miR-503-5p組VEGFA蛋白水平低于miR-NC組（P＜0.05），anti-miR-503-5p組VEGFA蛋白水平高于anti-miR-NC組（P＜0.05）。這說(shuō)明miR-503-5p靶向負(fù)調(diào)控VEGFA表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖1 人絨膜癌細(xì)胞系中miR-503-5p和VEGFA表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of miR-503-5p and VEGFA in human chorionic cancer cell lines

圖2 過(guò)表達(dá)miR-503-5p對(duì)人絨膜癌細(xì)胞JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響Fig.2 Effect of over-expressing miR-503-5p on proliferation，migration and invasion of human chorionic cancer cell JEG-3

圖3 敲減VEGFA對(duì)人絨膜癌細(xì)胞JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響Fig.3 Effect of knockdown VEGFA on proliferation，migration and invasion of human chorionic cancer cell JEG-3

2.5 過(guò)表達(dá)VEGFA逆轉(zhuǎn)miR-503-5p對(duì)JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-503-5p+pcDNANC組比較，miR-503-5p+pcDNA-VEGFA組JEG-3細(xì)胞48 h和72 h OD值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖4 miR-503-5p靶向調(diào)控VEGFA表達(dá)Fig.4 miR-503-5p targets VEGFA expression

圖5 過(guò)表達(dá)VEGFA逆轉(zhuǎn)miR-503-5p對(duì)JEG-3增殖、遷移和侵襲的影響Fig.5 Over-expressing VEGFA reversed effect of miR-503-5p on JEG-3 cells proliferation，migration and invasion

圖6 Western blot檢測(cè)p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)Fig.6 Western blot detected expression of p-PI3K and p-AKT protein

2.6 PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 與miR-NC組比較，miR-503-5p組p-PI3K和p-AKT蛋白水平降低（P＜0.05）。與miR-503-5p+pcDNA-NC組比較，miR-503-5p+pcDNA-VEGFA組p-PI3K和p-AKT蛋白水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

3 討論

miR-503-5p是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。李小輝等［8］研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-503-5p通過(guò)干擾Rb/E2F信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。JIANG等［9］研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-503-5p通過(guò)靶向抑制WEE1表達(dá)降低肝細(xì)胞癌HCCLM3細(xì)胞的遷移和細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，是肝細(xì)胞癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。但目前，miR-503-5p對(duì)絨毛膜癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響還未知。本研究以人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/Svneo為對(duì)照，采用qRT-PCR法檢測(cè)了人絨膜癌細(xì)胞系JEG-3、BeWo和JAR中miR-503-5p水平，結(jié)果顯示，人絨膜癌細(xì)胞系中miR-503-5p水平明顯低于絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，提示miR-503-5p可能作為抑癌基因參與絨膜癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染miR-503-5p mimics構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-503-5p的JEG-3細(xì)胞，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-503-5p可有效抑制JEG-3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示miR-503-5p是人絨膜癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。

miRNA通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為［10-11］。為了進(jìn)一步探討miR-503-5p影響人絨膜癌JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用機(jī)制，本研究通過(guò)starbase生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，VEGFA的3'UTR存在與miR-503-5p核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的連續(xù)位點(diǎn)，并通過(guò)雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-503-5p可與VEGFA的3'UTR靶向結(jié)合。同時(shí)，上調(diào)JEG-3細(xì)胞中miR-503-5p表達(dá)降低了VEGFA表達(dá)，而下調(diào)miR-503-5p表達(dá)促進(jìn)了VEGFA表達(dá)，這些結(jié)果說(shuō)明miR-503-5p靶向負(fù)調(diào)控VEGFA表達(dá)。作為促血管生長(zhǎng)因子家族成員之一，VEGFA可促進(jìn)腫瘤血管生成，而腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的基礎(chǔ)，因此，抑制VEGFA表達(dá)對(duì)于延緩腫瘤發(fā)展具有積極意義［12］。本研究顯示，敲低VEGFA表達(dá)可抑制人絨膜癌JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，過(guò)表達(dá)VEGFA則降低了過(guò)表達(dá)miR-503-5p對(duì)JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示過(guò)表達(dá)miR-503-5p通過(guò)抑制VEGFA表達(dá)發(fā)揮抗絨膜癌作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路是VEGFA下游信號(hào)通路之一，參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移等生命過(guò)程。XU等［13］研究顯示，VEGF可作用于PI3K/AKT信號(hào)通路，在體外和體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥性。PI3K同時(shí)具備磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其受到外界信號(hào)刺激后被激活生成p-PI3K。AKT是PI3K下游靶分子之一。p-PI3K進(jìn)一步激活A(yù)KT（p-AKT）。p-AKT活化PI3K/AKT信號(hào)通路下游分子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）［14］?；罨膍TOR可促進(jìn)CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞周期。CyclinD1表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘發(fā)腫瘤［15］。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活還能夠促進(jìn)MMP的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲［16］。本研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-503-5p可降低JEG-3細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT及CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白水平，提示過(guò)表達(dá)miR-503-5p抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路。此外VEGFA過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-503-5p對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用，提示miR-503-5p通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控VEGFA表達(dá)，進(jìn)而抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗絨膜癌作用。

綜上所述，人絨毛膜癌細(xì)胞中miR-503-5p呈低表達(dá)，VEGFA呈高表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-503-5p可抑制人絨毛膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控VEGFA與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活發(fā)揮作用。